黃穎楨，陳菁瑛，朱景花，劉保財，趙云青

(福建省農業科學院農業生物資源研究所，福建　福州　350003)

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太子參中蕪菁花葉病毒的RT-PCR檢測

黃穎楨，陳菁瑛*，朱景花，劉保財，趙云青

(福建省農業科學院農業生物資源研究所，福建福州350003)

建立并應用太子參中蕪菁花葉病毒的檢測技術。采用RT-PCR技術，設計特定引物從太子參病株中的不同部位擴增特定片段，且進行序列分析和比對。序列比對結果表明，擴增得到的片段為蕪菁花葉病毒外殼蛋白基因序列片段，本研究建立了一種簡便可靠太子參中蕪菁花葉病毒的檢測方法，并且從太子參根、莖、葉和花中均檢測到病毒目標序列。

太子參；TuMV；RT-PCR

太子參Pseudostellaria heterophylla(Miq.)PaxetHoffm為石竹科異葉假繁縷屬植物，又名孩兒參、童參等，是常用中藥材之一，以干燥塊根提供藥用[1]。福建省柘榮縣被譽為全國太子參之鄉，全縣90%以上農民種植太子參[2]。長期以來，太子參均以塊根進行無性繁殖，體內浸染并積累多種病毒，嚴重影響了太子參的產量和質量。

太子參病毒病又稱花葉病，是太子參產區發生普遍、危害嚴重的病害之一，嚴重影響產量和品質[3]。染病葉常表現為花葉、斑駁花葉、皺縮、扭曲、畸形、葉緣卷曲、葉質脆硬，病株矮小、塊根小且根數明顯減少，嚴重者整株死亡[4]。目前已知危害太子參的病原有4種[5]，分別為煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)，蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)，黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)和蠶豆萎蔫病毒(Broadbeanwilivirus，BBMV)，其中以蕪菁花葉病毒廣泛分布于全國太子參各產區[6]，是為害太子參的主要病毒病原。

近年來，太子參的相關研究集中在栽培技術和藥材質量方面，而對太子參中各種病毒的檢測研究較少。本研究針對高度保守的蕪菁花葉病毒CP基因，采用RT-PCR技術，對太子參病株的各個部位進行了蕪菁花葉病毒檢測，以期為太子參的病毒防治和脫毒種苗制備提供科學依據。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

材料及采集保存：太子參病株樣品來源于福建省寧德市柘榮縣。采集新鮮植物組織，迅速移入液氮保存，用于總RNA提取。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計根據GenBank中已登錄的TuMVCP基因的核苷酸序列(登錄號為AJ000690.1)設計TuMV引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。上游引物F：5′-ACCAAGACCGACCATACA-3′；下游引物R：5′-CCATAAGCGAGAATACTAACG-3′。

1.2.3RT-PCR檢測病毒PCR反應體系50 mm3：10×PCR Buffer(含Mg2+)5 mm3，dNTP(2.5 mmol·dm-3)4 mm3，正、反向引物(10 μmol·dm-3)各2 mm3，TaqDNA Polymerase(5 U·mm-3)0.5 mm3，cDNA模板量約2 mm3，補足雙蒸水至總體積為50 mm3。PCR反應程序：94℃ 預變性5 min；94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，共40個循環；72℃ 延伸10 min；4℃ 停止。擴增得到的PCR產物經1.5 %瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶送測序，測序結果進行比對分析。

1.2.4序列及分析PCR產物直接測序，方法簡便可靠。將擴增得到的PCR產物直接送鉑尚生物技術(上海)有限公司測序，測序結果在NCBI上進行Blast比對分析。

2　結果與分析

2.1總RNA提取

紫外分光光度計檢測所提取的太子參病葉總RNAOD260/OD280比值在1.8 ～ 2.0范圍內。瓊脂糖凝膠電泳表明，所提取的RNA主帶清晰，沒有明顯降解，符合試驗要求(圖1)。

2.2TuMV CP基因RT-PCR及序列分析

太子參cDNA中擴增得到目的CP基因序列電泳圖(圖2)。對擴增得到的目的片段進行測序分析(圖3)，經過NCBI Blast分析，擴增得到的序列與煙草花葉病毒的CP基因片段相似度高(圖4)，結果表明目的片段為蕪菁花葉病毒的CP基因片段。

2.3病株不同部位病毒檢測

按照本試驗建立的RT-PCR方法對太子參病株的不同組織分布進行檢測，選取帶花的太子參植株進行檢測，選取部位包括葉肉、葉脈、花、莖上部、莖中部、莖下部、根上部、根中部、根下部和須根。通過RT-PCR技術檢測，結果(圖5)顯示感染蕪菁花葉病毒的太子參在各部位均有分布。

3　討　論

本試驗建立太子參中蕪菁花葉病毒的RT-PCR檢測方法，同時應用該方法對太子參病株不同部位的蕪菁花葉病毒進行檢測分析。

相對于傳統的病毒分離電鏡檢查、ELISA、核酸雜交和基因芯片等其他病毒檢測方法，RT-PCR方法具有靈敏度高、操作簡便、特異性較高和成本較低等優點[7-8]，能夠滿足了大規模病毒樣品的分析。

福建省柘榮縣太子參病毒種類多樣，除蕪菁花葉病毒，本課題組還在不同的樣品中檢測到蠶豆萎蔫病毒、煙草花葉病毒。多種病毒的作用造成了太子參病毒病危害嚴重，造成太子參減產和農民減收，所以本文建立的太子參的病毒檢測技術，進而進行多種病毒的多重檢測技術研發，為太子參病毒防治，開發太子參脫毒種苗，提高太子參的產量和質量提供技術保障。

[1]肖培根,李大鵬,楊世林. 新編中藥志：第一卷[M]. 北京:化學工業出版社，2002：191-193.

[2]袁小坦，袁家雄. 柘榮縣太子參產業發展現狀與對策[J]. 福建農業科技，2014,(7)：:68-70.

[3]吳朝峰, 林彥銓. 藥用植物太子參的研究進展[J]. 福建農林大學學報: 自然科學版, 2005, 33(4): 426-430.

[4]劉清琪, 等.太子參花葉病病原及其防治的初步研究[J].中藥材科技, 1953， (2): 11.

[5]宋榮浩，濮祖芹. 太子參病毒病病原鑒定[J].上海農業學報，1991，7(2):80-85.

[6]朱艷, 周小華, 秦民堅. 太子參病毒病及其脫病毒研究進展[J]. 中國野生植物資源, 2005, 24(2): 31-32.

[7]王新, 莫笑晗, 林良斌. 分子生物學技術在植物病毒檢測中的應用[J]. 安徽農業科學, 2009, 37(28):13498-13500.

[8]周利飛，劉映紅，孫現超，等。 煙草蕪菁花葉病毒的ELISA和RT-PCR快速檢測技術研究[J]. 西南農業學報，2007,20(4)：758-761.

(責任編輯：柯文輝)

RT-PCR Detection of Turnip Mosaic Virus onPseudostellariaheterophylla

HUANG Ying-zhen, CHEN Jing-ying*， ZHU Jing-hua, LIU Bao-cai, ZHAO Yun-qing

(InstituteofAgriculturalBio-resourcesFujianAcademyofAgriculturalScience，Fuzhou，Fujian350003，China)

Amethodtodetecttheturnipmosaicvirus(TuMV)ondiseasedPseudostellaria heterophyllawasestablishedandapplied.SpecificgeneticfragmentsatdifferentlocationsinTuMVwasamplifiedbyRT-PCR,sequenced,andaligned.Thesequencealignmentindicatedthatthefragmentwasthecoatprotein(CP)geneofTuMV.Hence,asimple,reliabledetectionmethodbasedontheCPgenesequenceofTuMVforthediagnosisondiseasedP. heterophyllawasestablished.Usingthemethod,thetargetsequencewasdetectedintheroot,stem,leaf,andflowerofP. heterophylla.

Pseudostellaria heterophylla;turnipmosaicvirus;RT-PCR

黃穎楨，陳菁瑛，朱景花，等.太子參中蕪菁花葉病毒的RT-PCR檢測[J].福建農業學報，2016，31(6)：616-619.

HUANG Y-Z，CHEN J-Y，ZHU J-H，et al.RT-PCR Detection of Turnip Mosaic Virus onPseudostellariaheterophylla[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：616-619.

2016-03-02初稿；2016-04-15修改稿

黃穎楨(1976-)，男，助理研究員，主要從事藥用植物分子生物學研究 (E-mail：hyzmprc@163.com)

陳菁瑛(1966-)，女，研究員，主要從事植物生物技術和藥用植物資源利用研究(E-mail：cyj6601@163.com)

福建省種業創新與產業化工程項目(2014S1477-12);福建省自然科學基金項目(2015J01292)

S436.3

A

1008-0384(2016)06-616-05