人絨毛膜促性腺激素通過上調膠質細胞缺失因子-1介導人滋養細胞胎盤生長因子分泌

趙洪波　李瑞霞　張　煒

(上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室-復旦大學附屬婦產科醫院　上海　200011)

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人絨毛膜促性腺激素通過上調膠質細胞缺失因子-1介導人滋養細胞胎盤生長因子分泌

趙洪波▲ △李瑞霞▲張煒

(上海市女性生殖內分泌相關疾病重點實驗室-復旦大學附屬婦產科醫院上海200011)

目的研究人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)對人滋養細胞膠質細胞缺失因子-1(glial cell missing 1,Gcm-1)表達及胎盤生長因子(placental growth factor,PIGF)分泌的調控。方法人絨毛膜癌細胞株Bewo經不同劑量HCG處理后,以實時定量PCR及Western blot法分析檢測Gcm-1的表達,以ELISA方法測定PIGF分泌。通過干擾小RNA下調人滋養細胞Gcm-1表達,觀察其對HCG調控PIGF分泌的影響。結果HCG以劑量依賴的方式促進人滋養細胞Gcm-1表達及PIGF分泌,而HCG誘導PIGF分泌則由Gcm-1介導。結論HCG通過上調Gcm-1表達促進人滋養細胞PIGF分泌,提示HCG可能是一種對妊高征具有保護作用的因子。

人絨毛膜促性腺激素;滋養細胞;膠質細胞缺失因子-1;胎盤生長因子

妊娠高血壓綜合征,簡稱妊高征,是妊娠20周后出現的高血壓、水腫、蛋白尿等癥狀的統稱。妊高征發病率約為5%～8%,是導致產婦與圍生兒死亡的重要原因之一[1]。然而,妊高征可能涉及的相關分子機制目前并不完全清楚[2-4]。膠質細胞缺失因子-1 (glial cell missing 1,Gcm-1)是主要在胎盤組織表達的轉錄因子,妊高征孕婦胎盤Gcm-1表達顯著下降,提示Gcm-1的表達下降與妊高征發生密切相關[5-6]。Gcm-1調控包括胎盤生長因子(placental growth factor,PIGF)在內的多種蛋白質的水平[5]。而PIGF與早孕期胎盤血管形成密切相關,妊高征孕婦PIGF的水平較正常孕婦顯著下降,且PIGF水平越低妊高征孕婦癥狀愈嚴重,而恢復PIGF水平則顯著緩解妊高征孕婦的癥狀,提示恢復PIGF水平可能是妊高征重要的治療措施[5,7-9]。

近期有研究發現,人絨毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)以正反饋的方式促進Gcm-1基因表達[10],然而HCG是否通過Gcm-1調控PIGF水平目前并無報道及深入研究。 因此本文擬利用人滋養細胞株分析HCG對PIGF基因的表達調控及其分子機制,從而為提出妊高征治療策略提供新的理論依據。

材 料 和 方 法

細胞培養人絨毛膜癌細胞株Bewo購自美國美國菌種保藏中心(ATCC)細胞庫,細胞培養使用加入青霉素和鏈霉素的含10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F12 培養液(美國GIBCO公司,中國杭州吉諾生物技術有限公司分裝)。培養條件:培養皿置于37 ℃、5% CO2的培養箱,每2～3天換液一次。細胞傳代使用0.25 %胰蛋白酶消化,按1∶3或1∶4的細胞比例傳代。

試劑PIGF細胞因子ELISA檢測試劑盒購于美國R&D公司;HCG購于美國Sigma公司;人Gcm-1小干擾RNA(siRNA):5′-AACTCCCGCA-TCCTCAAGAAG-3′和5′-AACCTACAGTAGTG-GAG-ACCT-3′,非特異干擾siRNA (NS siRNA):5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,購自德國Qiagen公司。小鼠抗人Gcm-1抗體購自于英國Abcam公司,使用濃度按1∶1 000稀釋。小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購自美國Santa Cruz公司,使用濃度按1∶2 000稀釋。標記辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG二抗購自上海康成生物公司。

RNA抽提及實時定量RT-PCRBewo細胞經HCG處理48 h后加入TRIzol裂解液(美國Invitrogen 公司),靜置5 min后于4 ℃下12 000×g離心10 min(下同),上清中加入氯仿,充分混勻后離心,轉移水相至離心管加入等體積異丙醇,離心后取沉淀并加入75%乙醇,再離心取沉淀于室溫靜置5 min,以使RNA沉淀充分干燥。用無菌水溶解抽提物的樣品濃度,測定在260 nm和280 nm波長下的吸光度值(D),確定RNA含量。取0.5 μg的RNA加入5 ×PrimeScriptTMRT Master Mix (實時定量PCR) 37 ℃下15 min,85 ℃下5 s,將其逆轉錄為cDNA。PCR反應以上述的逆轉錄產物為模板,利用SYBR Premix Ex TaqII (實時定量PCR) 進行定量PCR。擴增條件:94 ℃預變性5 min、94 ℃30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃ 30 s、72 ℃延伸45 s。Gcm-1及 GAPDH引物序列如下:Gcm-1正義鏈,5′-GCCATGCGCAAT-ACCAACAA-3′,Gcm-1反義鏈,5′-TCACAGTTGGGACAG-CGTTT-3′;GAPDH正義鏈,5′-GCCGCTTC-TTCTCGTGCAG-3′,GAPDH反義鏈,5′-ATGGATCATTGATGGC-GACAACAT-3′。Gcm-1和GAPDH的PCR擴增產物長度分別是:144 bps和173 bps。

細胞轉染使用陽離子脂質體LipofectamineTM2000 (美國Invitrogen公司)試劑進行轉染。將對數生長期細胞2×105個接種到6孔板中,培養24 h 以使轉染時細胞融合達到30%～50%。分別平行配制轉染試劑Lipofectamine的無血清DMEM/Ham’s F12稀釋液(每孔250 μL無血清DMEM/Ham’s F12和10 μL Lipofectamine)和重組質粒的無血清稀釋液(在250 μL無血清DMEM/Ham′s F12中加入4 μg siRNA),室溫靜置,5 min內混合上述兩管液體,室溫靜置20 min形成DNA-Lipofectamine復合物,并將DNA-Lipofectamine復合物加入培養細胞中。37 ℃、5% CO2細胞培養箱中孵育8 h后,更換新鮮培液。轉染48 h,收集細胞進行Western blot蛋白質印跡及ELISA測定實驗。

ELISA測定Bewo細胞接種于6孔板,以無血清培養液處理8 h,隨后加入HCG或轉染小干擾RNA處理48 h,取上清離心后儲存于-80 ℃。按照ELISA試劑盒說明書對上清PIGF進行檢測,具體操作如下:根據待測樣品量,截取相應酶標板孔數,每孔加入細胞培養上清100 μL及樣品稀釋液100 μL,室溫孵育2 h,以400 μL洗滌液洗滌3次,每孔加入PIGF抗體工作液(PIGF conjugate) 200 μL,室溫孵育1 h。再次以400 μL洗滌液洗滌3次,每孔加入200 μL新鮮配置的底物溶液,室溫避光孵育30 min,加入反應終止液50 μL。搖勻后用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度值(D),計算培養上清中PIGF的濃度。

Western blot法取2×106個細胞棄去培養液,以預冷的PBS洗滌,加入相應體積的蛋白質裂解液,冰上放置30 min。然后以刮棒刮下細胞,收集到1.5 mL的離心管中。加入上述蛋白質裂解液后沸水浴10 min,然后于4 ℃下12 000×g離心10 min。取上清,用蛋白質定量試劑盒(K3001-BCA,上海申能博采生物有限公司)進行總蛋白質定量。根據測定的總蛋白質濃度,對照組及實驗組分別取50 μg總蛋白質樣品進行目標蛋白質及內參蛋白質GAPDH的表達檢測,檢測內參蛋白質的目的是確保每個樣品孔上樣的總蛋白質樣品量一致,以進行目標蛋白質表達水平的比較。上述50 μg總蛋白質樣品分別加入相應體積 β-巰基乙醇及1× SDS上樣緩沖液,于100 ℃變性10 min,繼而10 000×g離心5 min,取上清進行蛋白質SDS-PAGE電泳,轉膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗,4 ℃孵育過夜,PBS洗滌,加入相應二抗,室溫放置1 h,用增強型化學超敏發光液(天根生化科技有限公司)在暗室中壓片曝光,顯影定影后膠片保存。

結　　　果

HCG以劑量依賴方式促進 Gcm-1基因表達為了分析不同劑量HCG對人滋養細胞Gcm-1表達的影響,在用不同濃度HCG處理人滋養細胞48 h后,以實時定量RT-PCR及Western blot分別鑒定在mRNA及蛋白質水平的Gcm-1基因表達。人滋養細胞經HCG處理48 h后,Gcm-1的mRNA水平隨著HCG處理濃度增加而增高(圖1A);Gcm-1蛋白質水平上調也呈現HCG劑量依賴關系,提示HCG能以劑量依賴的方式上調Gcm-1基因表達(圖1B)。

A:mRNA level of Gcm-1;B:Protein level of Gcm-1.GAPDH is the loading control in Western blot.

圖1不同濃度HCG對人滋養細胞Gcm-1基因表達的影響

Fig 1The influence of different HCG concentration on Gcm-1 gene expression in human trophoblast cells

HCG以劑量依賴方式促進PIGF分泌為了分析不同劑量HCG對人滋養細胞PIGF表達的影響,用不同濃度的HCG處理人滋養細胞48 h后,細胞培養上清被收集用于ELISA檢測。PIGF水平隨著HCG處理濃度的增加而提高,證實HCG以劑量依賴的方式促進人滋養細胞PIGF分泌(圖2)。

Gcm-1 介導HCG促進滋養細胞PIGF分泌以上實驗結果證明HCG可促進Gcm-1基因表達和PIGF分泌,已知Gcm-1是調控滋養細胞增殖及分化的重要轉錄因子,其可調控PIGF的表達[5]。為了驗證HCG是否通過Gcm-1來介導PIGF分泌,本研究增加了用HCG、Gcm-1 siRNA同時(或)單獨處理人滋養細胞的6組實驗。結果發現,HCG及Gcm-1 siRNA同時處理組(圖 3A,Lane 5)與HCG單獨處理組(圖3A,Lane 4)相比,Gcm-1 siRNA顯著抑制HCG對于Gcm-1表達的促進作用(圖3A)。采用HCG及Gcm-1 siRNA同時處理人滋養細胞后,HCG單獨處理組(圖3B,Lane 4)與HCG及Gcm-1 siRNA同時處理組(圖3B,Lane 5)相比,PIGF分泌的抑制率約為45%(圖3 B)。與HCG單獨處理組相比,HCG及對照siRNA(NS siRNA)同時處理組并不影響HCG介導的Gcm-1的表達(圖3A Lane 6)及PIGF的分泌(圖3 B,Lane 6),提示HCG促進PIGF的分泌確實由Gcm-1介導。

圖2不同濃度HCG對人滋養細胞PIGF分泌的影響

Fig 2The effect of different HCG concentration on PIGF secretion in human trophoblast cells

A:Gcm-1 siRNA inhibits HCG-induced PIGF secretion;B:Gcm-1 siRNA inhibits HCG-induced Gcm-1 gene expression.GAPDH is the loading control in Western blot.

圖3Gcm-1介導HCG促進人滋養細胞PIGF分泌

Fig 3Gcm-1 mediates HCG-induced PIGF secretion in human trophoblast cells

討　　　論

Gcm-1是主要在胎盤組織表達的轉錄因子,其主要調控下游靶基因合胞素(syncytin)、PIGF及高溫需求蛋白A4(high-temperature requirement protein A4,HtrA4)表達,參與調控滋養細胞的增殖、融合(fusion)及分化[5,11-12]。妊高征孕婦胎盤Gcm-1基因表達顯著下降、并表現出滋養細胞融合障礙及絨毛外滋養細胞分化異常,提示Gcm-1的表達下降與妊高征發生密切相關[5-6]。

PIGF作為Gcm-1的靶基因,主要參與滋養細胞對子宮血管系統重鑄,妊高征孕婦與正常孕婦相比血清PIGF顯著下降,且下降水平越低,妊高征癥狀愈重,提示PIGF水平下降是妊高征關鍵致病因素之一[5,7-8]。已有研究證實,妊高征患者PIGF降低的主要原因是可溶性血管內皮生長因子受體1(soluble fms-like tyrosine kinase 1,sFlt1)水平過度升高[13]。sFlt1雖然保持與配體PIGF結合的能力,但缺乏跨膜區和酪氨酸激酶活性。因此,過量sFlt1與游離的PIGF結合并拮抗PIGF促胎盤血管形成的能力,導致妊高征的發生[13]。根據孕婦血清sFlt1/PIGF比值可以有效預測短期內妊高征的發生及嚴重程度[8,14-15];而體外分離去除血清sFlt1可以有效恢復血清PIGF的水平,明顯緩解妊高征的癥狀[9]。這些研究提示,恢復PIGF表達水平可能有助于妊高征的預防與治療。

HCG是臨床常用的促排卵及促黃體功能制劑,孕期可以安全應用。前期研究發現,HCG以正反饋的方式促進Gcm-1的表達[10],而另一項研究發現Gcm-1活化后可促進人滋養細胞PIGF表達[5]。在此基礎上,本文利用人滋養細胞系,研究發現HCG通過上調Gcm-1表達促進PIGF分泌,提示早孕期滋養細胞分泌的HCG可能通過促進PIGF表達參與妊娠早期胎盤血管重鑄。鑒于PIGF水平恢復可以很大程度上緩解妊高征的癥狀,因此HCG可能對妊高征發生發揮保護作用,并有可能成為潛在的治療手段。此外,妊高征目前并無有效的預防措施,某些妊高征高危孕婦在早孕期接受一定劑量的重組HCG以提高血清PIGF水平,這可能有助于緩解妊高征高危孕婦的癥狀,發揮一定的預防作用。HCG的這些可能的臨床應用仍需要大量深入的研究工作驗證。深入研究HCG對PIGF調控的分子機制,可能拓展HCG的臨床應用,為妊高征探尋新的預防及治療策略。

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E-mail:zhaohongbo01@sina.com

Human chorionic gonadotropin mediates the secretion of placental growth factor by promoting the expression of glial cell missing-1 gene in human trophoblast cells

ZHAO Hong-bo▲ △, LI Rui-xia▲, ZHANG Wei

(Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases-Obstetrics and Gynecology Hospital,Fudan University,Shanghai 200011,China)

ObjectiveTo study the regulation of human chorionic gonadotropin (HCG) on the expression of glial cell missing 1 (Gcm-1) gene and secretion of placental growth factor (PIGF) in human trophoblast cells.MethodsWe used realtime RT-PCR and Western blot assay to determine the mRNA and protein levels of Gcm-1,and used ELISA assay to detect PIGF secretion after human choriocarcinoma cells Bewo were treated with different doses of HCG.We applied small interfering RNA to knockdown Gcm-1 gene expression,and then observed the effect of Gcm-1 siRNA on HCG-inducing PIGF secretion.ResultsHCG promoted Gcm-1 gene expression and PIGF secretion in human trophoblast cells in a dose-dependent manner,and HCG-inducing PIGF secretion was mediated by Gcm-1.ConclusionsHCG promotes PIGF secretion by increasing the expression of Gcm-1 gene in human trophoblast cells,indicating that HCG may be a protective factor for preeclampsia.

human chorionic gonadotropin;trophoblast cells;glial cell missing 1;placental growth factor

R714.2

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.003

2016-03-14;編輯:張秀峰)

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81571457) and Pujiang Talent Program of Shanghai,China (15PJ1400900).

國家自然科學基金(81571457);上海市浦江人才計劃(15PJ1400900)

▲ZHAO Hong-bo and LI Rui-xia contributed equally to the article.