基于神經生物電原理治療原發性痛經的作用機制研究*

李盈潔　饒瑩　曾茜　胡析　王一枝　易學良　牛英杰　張曉△

(1.成都醫學院基礎醫學實驗教學中心，四川 成都　610500；2.云南省蒙自市人民醫院，云南 蒙自　661100)

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論著

基于神經生物電原理治療原發性痛經的作用機制研究*

李盈潔1饒瑩2曾茜1胡析1王一枝1易學良1牛英杰1張曉1△

(1.成都醫學院基礎醫學實驗教學中心，四川 成都610500；2.云南省蒙自市人民醫院，云南 蒙自661100)

目的：探究神經生物電刺激對原發性痛經(Primary dysmenorrhea，PD)大鼠P物質(Substance P，SP)的表達變化的影響。方法：將SD大鼠隨機分為非模型對照組、模型對照組和實驗組3組。實驗組給予股部皮下注射已烯雌酚，每天一次，連續10 d，第1天0.8 mg·只-1，第2-9天0.4 mg·只-1，第10天0.8 mg·只-1；第11天腹腔注射縮宮素2 U ·只-1；對實驗組大鼠進行神經生物電刺激干預，并在1 h、3 h和7 h后采用扭體評分進行運動評價。模型對照組只注射與實驗組相同劑量的已烯雌酚與縮宮素，不進行神經生物電刺激干預，其余操作不變。非模型對照組不注射已烯雌酚與縮宮素，不進行神經生物電刺激干預，其余操作不變。免疫組織化學技術檢測各組大鼠脊髓后角中SP的定位及表達變化，采用免疫熒光技術探究SP與腦源性神經營養因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)在脊髓后角的共定位情況。結果：扭體評分顯示實驗組大鼠運動增加幅度明顯小于模型對照組(P<0.05)。SP主要分布于脊髓后角Ⅱ板層，所有時間點實驗組SP表達均低于模型對照組，在3 h表達差異最大(P<0.05)。免疫熒光雙標技術顯示SP和BDNF在脊髓后角共表達。結論：神經生物電刺激能抑制SP的表達，影響原發性痛經，其機制可能與SP及BDNF共同作用有關。

原發性痛經；神經生物電刺激；P物質；腦源性神經營養因子

原發性痛經(Primary dysmenorrhea，PD)是指非盆腔器質性病變引起的痛經。西醫對PD的治療強調使用止痛劑、鎮靜劑及前列腺素抑制劑等，不良反應多，手術治療也有一定得療效，但因為其具有一定的局限性，所以手術治療不易被患者接受[1-2]。因PD的高發病率及治療棘手，給女性的身心健康和工作學習帶來了嚴重的影響。因此，探索減輕痛經患者的腹痛程度、緩解痛經癥狀及提高痛經患者的生活質量越來越受到重視。目前已有大量研究表明，神經生物電刺激具有鎮痛和延緩疼痛的效果[3-5]。因具有無創傷、易操作、患者易接受等優點，所以我們選擇采用神經生物電刺激的方法探討治療PD的方法。

神經生物電刺激是治療PD的一種方法。神經電刺激主要是利用特定參數的電流，對神經根及其分支進行刺激，進而干預痛覺反射的神經通路。

P物質(Substance P，SP)是一種與疼痛密切相關的物質，在中樞神經系統中分布廣泛[6-13]，它既能傳遞傷害性信息，也有鎮痛作用[8-9]。P物質與神經系統及其他遞質相互作用、相互配合而發揮作用，其作用機制十分復雜[8,11]。另外，也有研究表明調節傷害性信息的重要物質還有腦源性神經營養因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)，它在痛覺中樞敏化的發生、發展與維護中發揮作用[14]。

雖然有大量證據表明SP與BDNF參與了疼痛信號的傳遞，但是在原發性痛經中神經電刺激對SP與BDNF有什么影響還不清楚，SP與BDNF對原發性痛經的作用機制還有待研究。因此，本實驗采用免疫組織化學技術的方法，探究神經生物電刺激后SP在脊髓后角的表達變化及定位；通過免疫熒光雙標技術，研究SP和BDNF的定位表達，探討神經生物電刺激治療PD的作用機制，對于探索非藥物治療PD的方法，具有十分重要的臨床意義。

1　材料與方法

1.1動物模型制備

1.1.1動物與分組

清潔級健康成年SD雌性大鼠54只，體重220±20 g，由華西實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為非模型對照組、模型對照組和實驗組，每組又各分為1 h、3 h 、7 h組，每組各6只。

1.1.2動物模型制備

動物隨機分組經2天適應后開始造模，實驗組股部皮下注射已烯雌酚，每天一次，連續10 d，第1天0.8 mg·只-1，第2-9天0.4 mg·只-1，第10天0.8 mg·只-1；第11天腹腔注射縮宮素2 U ·只-1；對實驗組大鼠進行神經生物電刺激干預，并對大鼠進行扭體評分。模型對照組只注射與實驗組相同劑量的已烯雌酚與縮宮素，不進行神經生物電刺激干預，其余操作不變。非模型對照組不注射已烯雌酚與縮宮素，不進行神經生物電刺激干預，其余操作不變。

1.1.3神經生物電刺激

術后用SDZ-IV型電刺激儀對實驗組大鼠進行神經生物壓電刺激干預，參數設置：疏密波脈沖電流，電流強度為2 mA，頻率2 Hz，刺激6次，時間30 min。電極經皮膚及皮下組織，于大鼠第12胸椎棘突下后正中線右側旁開約2 cm，接正極；后正中線右側旁開約10 cm處接負極。

1.1.4動物扭體評分[15]

觀察注射縮宮素后大鼠每分鐘扭體反應，根據行為學評分標準，將扭體行為分為4個等級。0級：正常姿勢(手爪平放盒底或正常探查行為)；1級：身體向左或右偏斜；2級：后肢伸展，后爪背屈，軀體伸展伴頻繁地盆骨側向旋轉；3級：腹部肌肉收縮，伴軀體伸展和后肢伸展。每20 min記錄扭體次數。以每分鐘行為學分數=[0級(次數)×0(分)+1級(次數)×1(分)+2級(次數)×2(分)+3級(次數)×3(分)] ·(分鐘數/20)-1作為指標。

1.2免疫組織化學技術

1.2.1取材灌注

在電刺激后的第1 h、3 h、7 h，分別對大鼠進行灌注取材。大鼠過量麻醉后開胸暴露心臟，用眼科剪剪開心尖，將灌注針頭經左心室插入到主動脈，快速灌入200 ml 生理鹽水，至右心耳膨脹時剪開右心耳使大鼠體內血液完全排出。之后持續緩慢滴注300 ml的4%多聚甲醛固定液。灌注固定后取出脊髓組織(胸10至腰2)，取出標本置于4%多聚甲醛中后固定，于4℃保存備用。

1.2.2免疫組織化學技術

脊髓標本經4%多聚甲醛固定48 h后，用切片機制作厚度為5 μm的石蠟切片，置于60℃的烤箱30 min，常規二甲苯脫蠟，各級酒精至水化，3%甲醇雙氧水溶液浸泡10 min，高壓鍋加熱修復5 min，3%H2O2室溫孵育10 min，羊血清37℃孵育30 min。加一抗(BDNF，Rb，1：100；SP，Ms，1：200)，置入4℃過夜。SP-9001試劑B液與C液均孵育15 min，DAB-H2O2顯色液，PBS終止并沖洗，蘇木素復染，鹽酸酒精分色，自來水返藍，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。一抗與二抗均購自于中杉金橋生物技術公司。用于熒光免疫組化的石蠟切片在高壓修復10 min后，羊血清孵育30 min，加入一抗過夜后，熒光二抗(cy3，anti-Rb，1：200，Jackson；488，anti-Ms，1：100，中杉金橋)37℃孵育2 h，漂洗后用DAPI甘油封片，鏡檢。

每組選取連續切片中相同序數的3張代表切片，在高倍鏡下計數脊髓視野免疫陽性細胞并記錄陽性細胞的平均灰度值，取5個視野細胞數總和及5個視野灰度值的平均值。運用正置熒光顯微鏡(Olympus BX41，Japan)及Motic光學顯微鏡采集圖像進行觀察分析。

1.3統計學分析

2　結果

2.1痛經模型制備

本實驗通過扭體反應來評價大鼠的痛經程度。扭體實驗結果表明，模型對照組在1 h，3 h，7 h的評分均高于非模型對照組且都具有統計學意義(P<0.05)，上述實驗結果表明本實驗動物模型制備成功。1 h時模型對照組的評分略高于實驗組，無統計學意義(P>0.05)；3 h時模型對照組評分明顯高于實驗組(P<0.05)，在所測時間點評分差異達到最大值；7 h時模型對照組評分也明顯高于實驗組(P<0.05)，見表1。

表1　大鼠扭體反應結果統計表±S，n=6)

注：與模型對照組相比，*P<0.05。

2.2免疫酶組化及免疫熒光組化

2.2.1SP在脊髓后角的表達變化

本實驗通過免疫酶組化實驗來反映SP在脊髓后角的定位表達，結果顯示SP免疫反應陽性物質呈棕色、纖維狀，主要分布于脊髓后角Ⅰ板層和Ⅱ板層，且在實驗組與模型對照組的不同時間段均有表達。與非模型對照組相比(圖1-a，b，c)，模型對照組SP免疫陽性物質表達均增加，1 h的表達量較低，3 h達到峰值，到7 h有所下降(圖1-d，e，f)，且均具有統計學意義(P<0.05)；與模型對照組相比，實驗組SP免疫陽性物質的表達量在1 h表達較低，在3 h時表達量達到峰值，7 h有所下降(圖1-g，h，i)，并且在1 h、3 h、7 h時的表達量均明顯小于模型對照組，且均有統計學意義(P<0.05)。SP在脊髓后角的表達結果見圖1、圖2。

圖1　脊髓后角SP的表達情況(IHC，400X)

圖2　脊髓后角SP表達變化統計圖(IHC，400X)注：與模型對照組相比，*P<0.05。

2.2.2SP與BDNF在脊髓后角共表達

本實驗用免疫熒光雙標技術顯示，SP與BDNF在脊髓后角Ⅱ板層共定位表達。染色為紅色的為BDNF的定位，綠色的為SP的定位，藍色的染出細胞核，顯示黃褐色與藍色的圖片為BDNF、SP及細胞核的共定位表達，如圖3。

圖3　SP和BDNF免疫熒光雙標結果(IF，200X)

3　討論

原發性痛經是女性常見的給身心健康和工作學習帶來嚴重的影響的疾病，目前還沒有比較好的治療方法。神經生物電刺激對緩解痛經有一定的療效，因此，本實驗探討神經生物電刺激對原發性痛經的影響，實驗結果顯示神經生物電刺激過后，大鼠原發性痛經癥狀減輕，脊髓后角的SP明顯較少，BDNF在脊髓后角與SP共定位表達。

3.1神經電刺激通過抑制SP的表達來緩解痛經。

大量研究表明，疼痛的信號主要是由各種神經遞質傳遞，SP是傳導傷害性疼痛的一種興奮性遞質，它在傳入神經的突觸釋放，產生致痛作用[16-18]。在多種慢性疼痛中，SP作為疼痛遞質通過感覺神經傳入纖維向上傳遞至脊髓中樞， 參與疼痛在脊髓中樞的傳導和調制[19]。因此，痛覺傳導通路上的SP的釋放加重PD的重要原因。臨床觀察表明神經電刺激能夠緩解疼痛，但是其作用機制不清楚。

本實驗用免疫組織化學和免疫熒光的技術觀察SP在脊髓后角的表達變化，以探討神經生物電療法治療痛經的作用機制。結果顯示，SP免疫反應陽性物質呈棕色、纖維狀，在脊髓后角Ⅰ板層和Ⅱ板層分布，與其他的研究結果相同[20]。另外，本實驗結果還表明與模型對照組相比SP免疫反應陽性物質在神經生物電刺激后在脊髓后角的表達減少，實驗結果提示神經電刺激能夠減少SP的表達，緩解痛經的疼痛傳導。其作用機制是神經生物電刺激產生的疼痛刺激可作為一種神經生物電信號，通過脊髓細纖維(Aβ類神經纖維和C纖維)傳導，激活脊髓后角的神經細胞，興奮后角膠狀質細胞，使其釋放神經遞質，抑制神經細胞傳導，不再傳遞另一個疼痛沖動的刺激信號，出現鎮痛作用。Chen YW等人的研究也表明，對術后的大鼠進行神經生物電刺激，會減少SP在脊髓的釋放，抑制異常性疼痛[21]。用高頻經皮電神經刺激抑制SP在大鼠背根神經節表達，減弱手術后的疼痛[22]，上述的研究支持我們的實驗結果。所以，本實驗研究結果提示神經生物電刺激通過減少SP的表達，在脊髓減少傷害性信息傳遞，緩解痛經。

3.2BDNF可能與SP的共同作用來影響痛經。

本實驗研究結果顯示，SP與BDNF在脊髓后角的共表達，提示著BDNF可能與SP的共同作用，增強痛經的疼痛程度。

研究表明，在痛信號產生的初始階段，活化的小膠質細胞形態結構發生明顯變化，釋放細胞因子，如BDNF、TNF-α和SP等[23]。因此，在神經病理性疼痛下，脊髓活化的小膠質細胞BDNF的表達增加，與神經病理性疼痛的發生密切相關。本實驗用免疫熒光雙標技術顯示，SP與BDNF共同在脊髓后角2板層表達，提示BDNF與SP共同作用，增強痛經的疼痛程度。因此，BDNF與SP在脊髓強化痛信號的產生和傳遞中都發揮作用。Chen FX等人的研究表明，BDNF會通過增強SP的興奮性來加速腸道蠕動[24]，說明兩者在調節生命活動的過程中有聯系，支持我們的實驗結果。

綜上所述，神經生物電刺激后，SP表達減少，表明神經生物電刺激具有減輕大鼠原發性痛經的疼痛的作用。BDNF可能與SP共同作用來影響痛經，但是其作用機制還有待進一步研究。

1連偉清,王唯迪,徐梅,等. 原發性痛經發病機制及治療的研究進展[J]. 國際婦產科學雜志, 2012, 39(1): 29-31+39.

2華永慶,洪敏,朱荃. 原發性痛經研究進展[J]. 南京中醫藥大學學報, 2003, 19(1): 62-64.

3王亮,馮珍. 神經電刺激的臨床應用及機制研究進展[J]. 中國康復醫學雜志, 2013, 28(8): 775-778.

4向軍,常鵬飛,劉坤. 神經電刺激治療慢性疼痛研究進展[J]. 中國疼痛醫學雜志, 2008, 14(2): 105-108.

5陳良良,沈愛學,方劍喬,等. 經皮神經電刺激對癌痛患者的鎮痛作用及其機理研究[A]. 中華中醫藥學會, 2005, 20(增刊): 237-239.

6Massari VJ, Tizabi Y, Park CH, et al. Distribution and origin of bombesin, substance P and somatostatin in cat spinal cord. [J]. Peptides, 1983, 4(5): 673-681.

7Goto T, Kido MA, Yamaza T, et al. Substance P and substance Preceptors in bone and gingival tissues[J]. Med Electron Microsc, 2001, 34(2): 77-85.

8Jang JH, Nam TS, Pail KS, et al. Involvement of peripherally released substance P and calcitonin gene-related peptide in mediating mechanical hyperalgesia in a traumatic neuropathy model of the rat[J]. Neurosci Lett, 2004, 360(3): 129-132.

9Li YS, Wang JX, Jia MM, et al. Dragon′s blood inhibits chronic inflammstory and Neuropathic pain responses by blocking the synthesis and release of substance P in rats[J]. J Pharmacol Sci, 2012, 118(1): 43-54.

10Wong BJ, Minson CT. Altered thermal hyperaemia in human skin by prior desensitization of neurokinin-1 receptors[J]. Exp Physiol, 2011, 96(6): 599-609.

11Mukda S, Moller M, Ebadi M, et al. The modulatory effect of substance P on rat pineal norepinephrine release and melatonin secretion[J]. Neurosci Lett, 2009, 461(3): 258-261.

12Makeham JM, Goodchild AK, Pilowsky PM. NK1 receptor activation in rat rostral ventrolateral medulla selectively attenuates somato-sympathetic reflex while antagonism attenuates sympathetic chemoreflex[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2008, 288(6): R1707-1715.

13Theoharides TC, Zhang B, Kempuraj D, et al. IL-33augment substance P-induced VEGF secretion from human mast cdlls and is increased in psoriatic skin[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(9): 4448-4453.

14Duric V, McCarson KE. Effects of analgesic or antidepressant drugs on pain-or stress-evoked hippocampal and spinal neurokinin-1 receptor and brain-derived neurotrophic factor gene expression in the rat[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2006, 319(3): 1235-1243.

15Schmauss C， Yaksh TL. In vivo studies on spinal opiate receptor systems mediating antinociception. II. Pharmacological profiles suggesting a differential association of mu, delta and kappa receptors with visceral chemical and cutaneous thermal stimuli in the rat[J]. J Pharmacol Exp Ther, 1984, 228(1): 1-12．

16周躍,劉正津,廖雄宏,等. 脊神經節損傷時P物質和血管活性腸肽改變與神經行為異常的關系[J]. 中國行為醫學科學, 2005, 14(2): 165-168.

17Anand P, Bley K. Topical capsaicin for pain management: therapeutic potential and mechanisms of action of the new high-concentration capsaicin 8% patch[J]. Br J Anaesth, 2011, 107(4): 490-502.

18Wajima Z, Hua XY, Yaksh TL. Inhibition of spinal protein kinase C blocks substance P-mediated hyperalgesia[J]. Brain Res, 2000, 877(2): 314-321.

19Henry JL. Future basic science directions into mechanisms of neuropathic pain[J]. J Orofac Pain, 2004, 18(4): 306-310.

20周仲福,湯健. 中樞神經系統中的P物質[J]. 生理科學進展, 1979, 10(4): 297-303.

21Chen YW, Tzeng JI, Lin MF, et al．Transcutaneous electrical nerve stimulation attenuates postsurgical allodynia and suppresses spinal substance P and proinflammatory cytokine release in rats[J]. Phys Ther, 2015, 95(1): 76-85.

22Chen YW, Tzeng JI, Lin MF, et al．High-frequency transcutaneous electrical nerve stimulation attenuates postsurgical pain and inhibits excess substance P in rat dorsal root ganglion[J]. Reg Anesth Pain Med, 2014, 39(4): 322-328.

23Ichikawa H, Sato T, Kano M, et al. Masseteric nerve injury increases expression of brain-derived neurotrophic factor in microglia within the rat mesencephalic trigeminal tract nucleus[J]. Cell Mol Neurobiol, 2011, 31(4): 551-559.

24Chen FX, Yu YB, Yuan XM, et al．Brain-derived neurotrophic factor enhances the contraction of intestinal muscle strips induced by SP and CGRP in mice[J]. Regul Pept, 2012, 178(1-3): 86-94.

Research of the therapy of the primary dysmenorrhea based on the principle of neurobiology electric*

Li Ying-Jie1, Rao Ying2, Zeng Xi1, Hu Xi1, Wang Yi-Zhi1, Yi Xue-Liang1, Niu Ying-Jie1, Zhang Xiao1△

(1.ExperimentalTeaching Center of Basic Medical Science of Chengdu Medical College,Sichuan Chengdu 610500; 2. People′s Hospital of Mengzi City, Yunnan Mengzi 661100)

Objective：To explore the influence of substance P (SP) on rats with primary dysmenorrhea after electric therapy. Methods: SD rats were divided into 3 groups: control group, model group and experimental group. Rats in experimental group were given diethylstilbestrol injection in subcutaneous tissue of femoral region once a day for 10 days. Each rat was given 0.8 mg diethylstilbestrol injection at the first day, 0.4 mg diethylstilbestrol injection from second day to ninth day, 0.8 mg diethylstilbestrol injection on ten day. Each rat was given 2 U oxytocin by intraperitoneal injection on the eleventh day. Rats in the experimental group were given the intervention of neural bioelectricity stimulation and evaluated by the twisting reaction scores in 1 h, 3 h, and 7 h after the intervention. Rats in model group were given the same diethylstilbestrol injection and oxytocin as the rats in experimental group, not the intervention of neural bioelectricity stimulation. The remaming operations in model of group were also the same as that in experimental group. Rats in control group were not given the diethylstilbestrol injection and oxytocin or the intervention of neural bioelectricity stimulation. The remaming operations in model of group were also the same as that in experimental group. In addition, immunohistochemistry was used to observe the distribution and the expression of SP in the posterior horn of the spinal cord. Immunofluorescence was used to detect whether SP and brain derived neurotrophic factor (BDNF) co-expressed in the posterior horn of the spinal cord. Results: Twisting reaction scores in the experimental group were significantly less than that in the model group (P<0.05). Immunohistochemistry results showed that SP was mainly located in the second layer of posterior horn of spinal cord. Positive cells in the experimental group were always less than that in the model group, and the expression at 3 h had the most significantly difference between the two groups (P<0.05). Immunofluorescence indicated that SP and BDNF were co-expressed in the posterior horn of spinal cord. Conclusion: Electric therapy of neurobiology can inhibit the expression of SP and influence the primary dysmenorrhea, which may have some relations to the interaction between SP and BDNF.

Primary dysmenorrhea; Neurobiology electric therapy; Substance P; Brain derived neurotrophic factor

成都醫學院大學生創新實驗項目(編號：CX201213)

李盈潔，女，成都醫學院2014級臨床本科在讀學生，主要從事脊髓損傷與修復研究，Email：1049667281@qq.com。

張曉，男，教授，主要從事脊髓損傷與修復研究，Email：954073462@qq.com。

2016-4-8)