維A酸衍生物ECPIRM對維A酸核受體的影響及小鼠皮膚刺激反應

張孟麗 魏峻 馬鵬程 李玲珺 錢坤 陶蕾

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院激光科（張孟麗），藥物研究室（魏峻、馬鵬程、李玲珺、錢坤、陶蕾）

·論著·

維A酸衍生物ECPIRM對維A酸核受體的影響及小鼠皮膚刺激反應

張孟麗 魏峻 馬鵬程 李玲珺 錢坤 陶蕾

210042南京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 皮膚病醫院激光科（張孟麗），藥物研究室（魏峻、馬鵬程、李玲珺、錢坤、陶蕾）

目的 探討維A酸衍生物ECPIRM對維A酸核受體的影響，評估ECPIRM對小鼠皮膚的紅斑、脫屑等刺激反應。方法 10 μmol/L ECPIRM和全反式維A酸（ATRA）作用于SCL-1細胞24 h，用蛋白免疫印跡法和實時熒光定量PCR法分別檢測維A酸受體（RARα、RARβ、RARγ和RXRα）的蛋白和mRNA表達變化。用實時熒光定量PCR檢測維A酸受體RAR激活通路的靶基因細胞色素P450家族成員26A1和他扎羅汀誘導基因1（TIG1）的mRNA表達變化。BALB/c小鼠剃毛后外涂ECPIRM凝膠，以等摩爾濃度的全反式維A酸乳膏為對照，觀察小鼠皮膚刺激反應。結果 ATRA作用后，RARα、RARβ、RARγ的蛋白和mRNA表達明顯增高，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。CYP26A1和TIG1的mRNA表達分別增加到25.49倍和3.88倍，差異有統計學意義（P<0.01）。但ECPIRM作用后并不增加核受體RARα、RARβ、RARγ及RXRα的蛋白表達；RARα、RARβ、RARγ的mRNA表達變化差異無統計學意義（P>0.05）；RAR靶基因CYP26A1和TIG1的mRNA表達變化差異無統計學意義（P>0.05）。BALB/c小鼠外用全反式維A酸乳膏后2 d出現明顯的紅斑、脫屑反應，用藥5 d達高峰。而連續外用0.075%ECPIRM凝膠21d，小鼠一直未出現紅斑、脫屑反應。結論 ECPIRM不激活經典的維A酸受體通路，未出現ATRA樣皮膚刺激反應。

維甲酸；皮膚刺激試驗；小鼠；ECPIRM；維A酸核受體

維A酸化合物因其復雜的藥理作用，用于治療痤瘡、光老化及多種角化性皮膚病等。研究表明，許多維A酸化合物發揮生物學效應都與維A酸受體的表達與激活密切相關，但同時會產生明顯與維A酸核受體激活相關的不良反應，其中在皮膚上表現為紅斑、脫屑等刺激反應，限制了藥物的使用［1-2］。本實驗室合成出一種維A酸衍生物ECPIRM［N-（4-ethoxycarbonylphenyl）isoretinamide］，發現該化合物具有較強的抗腫瘤增生及抗炎作用［3-4］。本文探討其對維A酸核受體的作用，并觀察該衍生物對小鼠皮膚的刺激反應，以初步評估ECPIRM的安全性。

材料與方法

一、材料

ECPIRM 由本實驗室合成（純度 ＞ 98%）［3］。全反式維A酸（ATRA）購自美國Sigma公司（純度＞98%）。0.05%的ATRA乳膏由重慶華邦制藥股份有限公司饋贈，0.075%的ECPIRM凝膠由本課題組制備。DMEM培養基，胰酶,胎牛血清，TRIzol購自美國Invitrogen公司。DMSO購自美國Sigma公司。Reverse Transcription system和GoTaqqPCR Master Mix購自美國 Promega公司。RARα、RARβ、RARγ及 RXRα 的 一 抗 購 自 美 國 Cell Signaling Technology。人皮膚鱗癌細胞株SCL-1源于德國癌癥研究中心，由中國醫科大學何春滌教授饋贈。BALB/c小鼠（合格證號0248335）購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司。

二、方法

1.細胞培養與藥物處理：SCL-1細胞生長于含10%FBS、100 U/ml青霉素及 0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，置于5%CO2，37℃孵育培養，2～3 d換液1次，取對數生長期的細胞用于實驗。ECPIRM及ATRA用DMSO溶解，配制成0.1 mol/L的母液保存于-80℃冰箱中，加藥前用含有10%胎牛血清的DMEM培養基稀釋成終濃度10 μmol/L。藥物配制均在避光環境中進行。

2.蛋白免疫印跡法測定維A酸核受體的蛋白含量：SCL-1細胞以2×105個/皿的密度接種于10 cm的平皿中，觀察細胞生長約80%時，棄上清，分別加入含10 μmol/L的ECPIRM和ATRA的培養基8 ml（以不含藥物的培養基為陰性對照），作用24 h后，PBS洗2次，利用蛋白提取試劑盒提出相同質量的蛋白，進行凝膠電泳后將蛋白電轉印到硝酸纖維膜上，以含5%的脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，其中抗體稀釋度為：其中抗體稀釋度為：RARα（1 ∶200）、RARβ（1 ∶400）、RARγ（1∶400）、RXRα（1∶400），β 肌動蛋白（1∶400）。繼以二抗室溫孵育l h，化學發光法檢測反應條帶。應用圖像分析軟件對圖像進行分析，以β肌動蛋白為內參照，計算RARα、RARβ、RARγ 和RXRα 的相對量。蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參照蛋白條帶灰度值。

3.實時熒光定量PCR測定維A酸核受體和受體通路靶基因的mRNA表達：SCL-1細胞以5×104個/皿的密度接種于60 mm培養皿中，觀察細胞生長約80%時，棄上清，分別加入10 μmol/L的ECPIRM和ATRA的培養基2 ml（以不含藥物的培養基為陰性對照），作用24 h后，PBS洗2次，根據TRIzol試劑說明書提取總的RNA并檢測其純度和濃度。按照反轉錄系統合成cDNA。待測的mRNA為核受體RARα、RARβ、RARγ、RXRα 和 受 體 通 路 靶 基 因TIG1和CYP26A1，其相關引物為：RARα引物，上游：5′-CTGCCAGTACTGCCGACTGC-3′，下游 5′-ACGTTGTTCTGAGCTGTTGTTCGTA-3′，235bp；RARβ 引物，上游：5′-CTGGGAGGAATTGTTTGCA T-3′，下游：5′-GTTCTCAACCAGCTCAGACTCA-3′，145 bp；RARγ 引物，上游：5′-CTGCCAGTACTGCCG GCTAC-3′，下游：5′-TCTGCACTGGAGTTCGTGGTA TACT-3′，228 bp，RXRα 引物，上游：5′-CGACCCTG TCACCAACATTTGC-3′，下游：5′-GAGCAGCTCATT CCAGCCTGCC-3′，142 bp；TIG1 引物，上游：5′-TGA GGCAGTGGAAAACTAATGA-3′，下游：5′-AAGTGA ATGCGACAGGGAAT-3′，100 bp；CYP26A1 引物，上游：5′-AGGTTCAGCTTCATTCCATTTG-3′，下游：5′-GGTTTTCATTGTAGGAGGTCCAT-3′，144 bp；GAPDH 引物，上游：5′-TGGGTGTGAACCATGAGAA GT-3′，下游：5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′，126 bp。合成的cDNA根據GoTaqqPCR Master Mix說明書配置反應體系。擴增結束后，分析得到mRNA的相對表達含量。

4.皮膚刺激試驗：BALB/c小鼠分成ECPIRM組、ATRA組，每組4只，雌雄各半，分籠飼養。試驗前一天用皮膚標記筆在每只小鼠背部近頭部和近尾部各標記一塊1.5 cm×1 cm大小區域，兩區域間隔約1.5 cm，剃毛。分別稱取約0.030 g的0.075%的ECPIRM凝膠和0.05%的ATRA乳膏（兩種制劑所含藥物的摩爾濃度相同），涂于近頭部標記區。所有動物近尾部區域涂基質。每天用藥1次，連續用藥21 d。觀察小鼠皮膚變化并記錄局部皮膚反應。皮膚反應評分等級:0分為用藥局部無可見反應；0.5分為隱約可見紅斑、脫屑；1分為輕度紅斑、脫屑；2分為中度紅斑、脫屑；3分為重度紅斑、脫屑。局部皮膚不同用藥時間平均刺激分值=每組所有觀察動物當天的局部刺激分值之和/觀察動物數。

5.統計分析：采用SPSS 17.0軟件進行分析計算，計量資料采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、ECPIRM 對維 A 酸核受體 RARα、RARβ、RARγ、RXRα的蛋白表達影響

RARα、RARβ、RARγ 和 RXRα 反應條帶見圖1。各組的蛋白相對表達量如下，對照組：RARα 0.43 ± 0.11，RARβ 0.27 ± 0.08，RARγ 0.45 ± 0.10，RXRα 0.51±0.23，ECPIRM 組 RARα 0.42± 0.06，RARβ 0.28 ± 0.10，RARγ 0.45 ± 0.15，RXRα 0.50 ±0.21，ATRA 組 RARα 0.83 ± 0.15，RARβ 0.62 ±0.05，RARγ 0.96±0.33，RXRα 0.48±0.19。與對照組相比，ATRA能誘導RARα、RARβ和RARγ高表達，RARα和RARβ變化有統計學意義（P<0.01），RARγ變化有統計學意義（P<0.05）。而ECPIRM對RARα、RARβ、RARγ、RXRα 的蛋白表達影響不明顯（P>0.05）。

圖1 10 μmol/L的ECPIRM和全反式維A酸（ATRA）作用24 h對 SCL-1細胞中維 A 酸核受體（RARα、RARβ、RARγ、RXRα）的蛋白印跡

表1 ECPIRM和全反式維A酸（ATRA）對SCL-1細胞維A酸核受體mRNA表達的影響（±s）

表1 ECPIRM和全反式維A酸（ATRA）對SCL-1細胞維A酸核受體mRNA表達的影響（±s）

注：n=3。a：與對照組比較，P<0.01

組別 RARα RARβ RARγ RXRα對照組 1.00±0.06 1.00±0.23 1.00±0.13 1.00±0.03 ECPIRM組 0.90±0.09 0.63±0.29 0.79±0.11 0.70±0.03a ATRA組 1.78±0.22a 2.40±0.21a 1.36±0.18a1.05±0.04

二、ECPIRM 對 RARα、RARβ、RARγ、RXRα 的mRNA表達影響

由表1可知，與對照組比較，ATRA可誘導RARα、RARβ、RARγ 的高表達，差異有統計學意義（均P<0.01），RXRα則無明顯變化。而ECPIRM組的RARα、RARβ、RARγ的mRNA表達量均出現與陰性對照組無統計學意義的降低，RXRα的mRNA表達量則有降低，差異有統計學意義（P<0.01）。

三、ECPIRM對RAR通路靶基因mRNA表達影響

CYP26A1和TIG1等均是經典維A酸受體通路（RARE）激活的靶基因，各組TIG1和CYP26A1的mRNA表達量變化見表2。與對照組比較，ATRA處理細胞24 h后，TIG1和CYP26A1的mRNA表達量增加到3.88倍和25倍，與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.01）。但是，ECPIRM作用后SCL-1細胞中的TIG1和CYP26A1的mRNA表達量降低，變化無統計學意義（P>0.05）。

四、小鼠皮膚刺激反應

表2 ECPIRM和全反式維A酸（ATRA）對SCL-1細胞中TIG1和CYP26A1的mRNA表達量的影響（±s）

表2 ECPIRM和全反式維A酸（ATRA）對SCL-1細胞中TIG1和CYP26A1的mRNA表達量的影響（±s）

注：n=3。a：與對照組比較，P<0.01

組別 TIG1 CYP26A1對照組 1.00±0.43 1.00±0.35 ECPIRM組 0.58±0.22 0.49±0.05 ATRA組 3.88±0.11a 25.49±1.37a

為了進一步了解藥物可能的臨床副作用，我們以0.05%全反式維A酸乳膏為對照，檢測了0.075%ECPIRM凝膠對BALB/c小鼠的局部皮膚刺激反應（兩種藥物含相同的摩爾濃度）。結果見圖2，外用0.05%全反式維A酸乳膏，用藥2 d出現紅斑、脫屑反應，用藥5 d達高峰，持續1～2 d后，反應逐漸減輕，用藥17 d消失，這種“出現一高峰一消退”的一過性規律，與既往研究結果一致［6］；而連續外用0.075%ECPIRM凝膠21 d，一直未出現紅斑、脫屑反應，與用藥前相比無明顯變化。所有外用基質部位與用藥前相比無明顯變化。根據兩組不同用藥時間平均刺激分值結果，ECPIRM的安全性遠大于等摩爾濃度的全反式維A酸。圖3顯示ECPIRM凝膠組小鼠和全反式維A酸組小鼠第0天和第5天的皮膚反應。

討 論

維A酸化合物的作用機制較復雜，通常認為與維A酸核受體密切相關。維A酸核受體分為兩大類，即維A酸受體（RAR）和維A酸X受體（RXR）。RAR同RXR形成異二聚體并且連接維A酸反應元件（retinoic acid responsive element，RARE）進而調控CYP26A1和TIG1等維A酸受體靶基因的表達，影響細胞增殖及分化［2-3］。也有研究表明，合成的維A酸化合物芬維A胺主要以非受體依賴方式介導皮膚癌［5］、畸胎瘤［6］等多種腫瘤的凋亡。先前的研究表明，ECPIRM能明顯抑制皮膚鱗癌細胞系的增殖，誘導細胞凋亡，將細胞周期阻滯在G1期［3］，調節細胞分化，并具有明確的抗炎活性［4］。本研究結果表明，ECPIRM 不能誘導核受體 RARα、RARβ、RARγ和RXRα蛋白及mRNA表達的增加，也不能增加RAR的激活通路靶基因CYP26A1和TIG1的表達，而ATRA則能明顯上調維A酸受體及RAR通路靶基因CYP26A1和TIG1的表達。表明ECPIRM的增殖、誘導細胞凋亡及抗炎活性機制與經典的維A酸類藥物不同，它不依賴于維A酸受體及其激活通路。

圖2 小鼠背部外用維A酸乳膏不同時間的皮膚平均刺激分值

維A酸類藥物的標志性不良反應為皮膚刺激反應，如紅斑、脫屑、干燥、瘙癢、灼燒感、刺痛感等，這些皮膚刺激反應主要涉及 RARβ、RARγ［7］和RARα［8-10］的高表達及被激活。我們觀察了外用ECPIRM對BALB/c小鼠皮膚的刺激反應，結果臨床常用的0.05%全反式維A酸乳膏出現了與既往研究結果一致［11］的典型的一過性紅斑、脫屑反應，而相同摩爾濃度的ECPIRM凝膠（0.075%）連續外用21 d均未出現皮膚刺激反應。通常認為維A酸類藥物的療效與皮膚刺激反應相關聯［11］，我們的研究結果表明，不經過維A酸受體激活途徑而發揮作用的維A酸類藥物的療效與皮膚刺激反應不一定關聯。多年來，研發受體選擇性維A酸藥物曾是熱點，我們的研究結果提示，對于維A酸研究領域而言，研發低毒高效的維A酸類藥物將成為一種新途徑。

圖3 兩種制劑對小鼠皮膚的刺激反應 全反式維A酸組小鼠在用藥后第5天出現明顯的紅斑、脫屑反應，ECPIRM組未出現紅斑和脫屑反應

［1］Bunaciu RP,Yen A.Retinoid Chemoprevention:Who Can Benefit?［J］.CurrPharmacol Rep,2015,1 （6）:391-400.DOI:10.1007/s40495-015-0036-8.

［2］Altucci L,Leibowitz MD,Ogilvie KM,et al.RAR and RXR modulation in cancer and metabolic disease ［J］.Nat Rev Drug Discov,2007,6（10）:793-810.DOI:10.1038/nrd2397.

［3］Zhang M,Tao Y,Ma P,et al.Synthesis and characterization of a new retinoic acid ECPIRM as potential chemotherapeutic agent for human cutaneous squamous carcinoma［J］.Anticancer Agents Med Chem,2015,15（9）:1204-1212.

［4］楊林芳,曹玉萍,張孟麗,等.新型維A酸ECPIRM及全反式維A酸對白細胞介素17刺激HaCaT細胞白細胞介素1β表達的影響 ［J］.中華皮膚科雜志,2015,48（11）:797-800.DOI:10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.11.011.Yang LF,CaoYP,Zhang ML,et al.Effects of a novel retinoic acid ECPIRM and all-trans-retinoic acid on interleukin-1β expression in interleukin-17-stimulated HaCaTcells ［J］.Chin J Dermatol,2015,48 （11）: 797-800. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.11.011.

［5］Xu H,Cheepala S,McCauley E,et al.Chemoprevention of skin carcinogenesis by phenylretinamides: retinoid receptorindependent tumor suppression ［J］.Clin Cancer Res,2006,12（3 Pt 1）:969-979.DOI:10.1158/1078-0432.CCR-05-1648.

［6］Malone W,Perloff M,Crowell J,et al.Fenretinide:a prototype cancer prevention drug［J］.Expert OpinInvestig Drugs,2003,12（11）:1829-1842.DOI:10.1517/13543784.12.11.1829.

［7］Otley CC,Stasko T,Tope WD,et al.Chemoprevention of nonmelanoma skin cancer with systemic retinoids:practical dosing and management of adverse effects ［J］.DermatolSurg,2006,32（4）:562-568.DOI:10.1111/j.1524-4725.2006.32115.x.

［8］吳秋菊,馬鵬程,陳志強,等.外用維A酸引起小鼠皮膚反應的研究［J］.中華皮膚科雜志,2005,38（6）:380-382.DOI:10.3760/j.issn.0412-4030.2005.06.018.Wu QJ,Ma PC,Chen ZQ,et al.Skin reactions induced by topical retinoic acid in mice［J］.Chin J Dermatol,2005,38（6）:380-382.DOI:10.3760/j.issn.0412-4030.2005.06.018.

［9］吳秋菊,馬鵬程,陳志強,等.外用維A酸后小鼠皮膚中維A酸受體的表達［J］.中華皮膚科雜志,2005,38（7）:449-450.DOI:10.3760/j.issn.0412-4030.2005.07.017.Wu QJ,Ma PC,Chen ZQ,et al.Expression of retinoicreceptor in mice skin tissues after topical treatment with retinoic ［J］.Chin J Dermatol,2005,38 （7）:449-450.DOI:10.3760/j.issn.0412-4030.2005.07.017.

［10］后文俊,馬鵬程.連續外用維A酸皮膚刺激反應中維A酸受體mRNA 的表達［J］.中國熱帶醫學,2009,9（5）:827-828.Hou WJ,Ma PC.The expressions of retinoic acid receptors in the skin irritation induced by topical retinoic acid［J］.China Tropical Medicine,2009,9（5）:827-828.

［11］Chen S,Ostrowski J,Whiting G,et al.Retinoic acid receptor gamma mediates topical retinoid efficacy and irritation in animal models［J］.J Invest Dermatol,1995,104（5）:779-783.

Effect of a tretinoin derivative ECPIRM on retinoic acid receptors and skin irritation responses to it in mice

Zhang Mengli,Wei Jun,Ma Pengcheng,Li Lingjun,Qian Kun,Tao Lei

Department of Cosmetic Laser Surgery,Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China （Zhang ML）;Department of Pharmacal Research,Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wei J,Ma PC,Li LJ,Qian K,Tao L）

Objective To estimate the effect of a tretinoin derivative ECPIRM on retinoic acid receptors（RARs）,and to observe skin irritation responses to it in mice.Methods Cultured SCL-1 cells were divided into 2 groups to be treated with culture medium containing 10 μmol/L ECPIRM （ECPIRM group）or 10 μmol/L all-trans retinoic acid（ATRA） （ATRA group）for 24 hours,and those treated with drug-free culture medium served as the control group.Western blot analysis and real-time fluorescence-based quantitative PCR were performed to quantify the protein and mRNA expressions of RARs （RARα,RARβ,RARγ and RXRα）respectively.In addition,real-time fluorescence-based quantitative PCR was conducted to measure the mRNA expressions of two target genes of the activated RAR signaling pathway,i.e.,cytochrome P450 26A1 （CYP26A1）and tazarotene-induced gene 1 （TIG1）.Eight BALB/c mice were equally divided into 2 groups to be topically treated with 0.075%ECPIRM gel or 0.05%ATRA cream at equal molar concentrations on the shaved skin once daily for 21 successive days.Skin irritation reactions were assessed in these mice.Results Compared with the control group,the ATRA group showed significantly increased protein and mRNA expressions of RARα,RARβ and RARγ （allP<0.05）.The mRNA expressions of CYP26A1 and TIG1 genes in the ATRA group were 25.49 and 3.88 times that in the control group respectively （bothP<0.01）.However,there was no significant difference in the protein expressions of RARα,RARβ,RARγ and RXRα,or mRNA expressions of RARα,RARβ,RARγ,CYP26A1 and TIG1 between the ECPIRM group and control group （allP>0.05）.Obvious Skin irritation reactions such as erythema and desquamation were observed in BALB/c mice after 2-day topical treatment with ATRA cream,and their degree peaked after 5-day treatment.However,neither erythema nor desquamation was observed in BALB/c mice during 21-day treatment with 0.075%ECPIRM gel.Conclusion Unlike ATRA,ECPIRM cannot activate the canonical RAR signaling pathway or cause skin irritation reactions.

Tretinoin;Skin irritancy tests;Mice;ECPIRM;Retinoic acid receptor

Ma Pengcheng,Email:mpc815@163.com

馬鵬程，Email：mpc815@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.06.013

北京協和醫學院協和青年基金（3332015115）

Fund program:PUMC Youth Fund（3332015115）

2016-01-05）

（本文編輯：吳曉初）