超臨界CO2萃取脂質對南極磷蝦肌原纖維蛋白理化性質的影響

王曉龍,馮曉梅,隋　曉,席　璇,韓玉謙,*

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.青島大學生物系,山東青島 266071)

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超臨界CO2萃取脂質對南極磷蝦肌原纖維蛋白理化性質的影響

王曉龍1,馮曉梅1,隋曉2,席璇1,韓玉謙1,*

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.青島大學生物系,山東青島 266071)

通過研究南極磷蝦肌原纖維蛋白經超臨界CO2萃取脂質后的理化性質變化特點及規律,為南極磷蝦深加工提供基礎數據。在15～25 MPa,35～55 ℃,2 h以及15 MPa,35 ℃,1～3 h的實驗條件下,考察了經過萃取脂質后的肌原纖維蛋白的巰基數量、Ca2+-ATPase活性、表面疏水性變化并結合SDS-PAGE電泳,研究超臨界CO2萃取南極磷蝦脂質對肌原纖維蛋白理化性質的影響情況。結果表明,南極磷蝦肌原纖維蛋白總巰基數量和Ca2+-ATPase活性隨溫度、壓力和時間的增加而下降;表面疏水性隨溫度、壓力和時間的增加而上升;巰基數量與Ca2+-ATPase活性的下降主要發生在0～1 h內,而表面疏水性的上升主要發生在1～2 h內;SDS-PAGE電泳圖顯示經過超臨界CO2萃取脂質后的蛋白條帶略有變淺,說明超臨界萃取處理會使南極磷蝦肌原纖維蛋白的結構發生變化,產生新的作用鍵。經過超臨界萃取處理后,肌原纖維蛋白巰基的氧化、二硫鍵的生成和表面疏水性的提高以及其他作用鍵的形成均有利于改善蛋白的乳化和凝膠等功能性質,這對南極磷蝦的加工及利用有重要意義。

超臨界流體萃取,南極磷蝦,肌原纖維蛋白,理化性質,影響

南極磷蝦是一種生活在南極水域的甲殼類浮游生物,其生物資源量巨大,含有豐富的營養成分,營養價值十分豐富。南極磷蝦含有豐富的蛋白質,是一種優質的蛋白資源[1]。同時,南極磷蝦的脂肪含量也很可觀,脂質中多不飽和脂肪酸含量較高,富含磷脂型EPA、DHA,具有較好的醫藥保健功能[2]。此外,南極磷蝦還含有豐富的類胡蘿卜素、蝦青素和脂溶性維生素(如維生素A、維生素E)[2-3]。近年來,南極磷蝦已經成為食品、醫學和藥學等學科的研究熱點之一[4]。

目前南極磷蝦脂質的提取主要采用的有機溶劑中通常含有氯仿和甲醇[5],但會產生有機溶劑,且用量大、殘留多,導致蛋白變性、失去部分功能性質[6]等問題。近年來,超臨界CO2作為一種新興的技術受到人們的重視,CO2具有無毒、廉價、易得、臨界壓力和溫度都不太高等優點,有利于在溫和的條件下提取脂質。許多油脂化工反應都可以在超臨界CO2中進行,關于超臨界流體在脂類萃取、分級方面的研究已有詳細的報道[7-8]。目前,超臨界CO2已用于磷蝦等海洋生物的脂質萃取,Yamaguchi[9]等人采用超臨界CO2從南極磷蝦中萃取出脂質并進行了分析。

肌原纖維蛋白是肌肉蛋白質的重要組成部分,在肉制品加工過程中,雖然肌漿蛋白和基質蛋白也對肉制品的風味等起到一定的作用,但是肌肉中主要起作用的蛋白是肌原纖維蛋白,肌原纖維蛋白的性質是由肌原纖維蛋白的結構體現出來,蛋白與蛋白、蛋白和水之間的作用形成的肌原纖維蛋白凝膠,在溶液界面是肌原纖維蛋白的性質改變,直接影響蛋白的感官性質(肉制品的彈性、多汁性、口感等)[10]。

肌原纖維蛋白在不同的環境和加工條件下,通常表現出不同的特性[11]。經過超臨界CO2萃取脂質后的南極磷蝦肌原纖維蛋白會表現出一些特性,有利于在食品和工業中的進一步利用。本文通過考察肌原纖維蛋白的巰基數量,Ca2+-ATPase活性,表面疏水性并結合SDS-PAGE電泳研究南極磷蝦肌原纖維蛋白經超臨界CO2萃取脂質后的變化特點及規律,為南極磷蝦加工及利用提供基礎數據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

南極磷蝦肉由中國水產科學研究院東海水產研究所提供,冷凍運至實驗室,-20 ℃冰箱保存,實驗前解凍粉碎;正己烷、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、馬來酸、氯化鈉、三氯乙酸、鹽酸購于國藥;尿素、乙二胺四乙酸(EDTA)、三磷酸腺苷二鈉、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)等試劑來自索萊寶,均為分析純。

SFE121-50-02超臨界萃取裝置江蘇南通華興石油儀器有限公司;粉碎機上海梅香儀器有限公司;乳化分散均質機IKA T18 basic;JY-SCZ2+型雙垂直電泳槽北京六一生物科技有限公司;旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠;紫外分光光度計上海元析儀器有限公司;F-4600熒光光譜儀Hitachi。

1.2實驗方法

1.2.1超臨界CO2萃取南極磷蝦脂質20 g南極磷蝦肉放入到1 L的萃取釜中,萃取釜采用不銹鋼材質,溫度控制采用循環水浴,壓力由高壓泵打壓、調節閥控制,采用15～25 MPa的壓力,35～55 ℃的溫度,時間2 h以及15 MPa,35 ℃,1～3 h對南極磷蝦肉進行萃取,用正己烷進行收集,將油水混合物分層,取有機層40 ℃旋蒸得到南極磷蝦脂質。經超臨界CO2萃取脂質后的樣品存放在-80 ℃的冰箱中,待分析。

1.2.2南極磷蝦肌原纖維蛋白的提取肌原纖維蛋白的提取參考文獻[12],并稍作修改。取5 g處理后的南極磷蝦肉,加入40 mL pH7.0的Tris馬來酸緩沖液,均質1 min,靜置1 h,4 ℃下6000×g離心10 min,重復三次。然后將8倍體積的含0.6 mol/L 氯化鈉的pH7.0的Tris馬來酸緩沖液加入到沉淀中,均質1 min后放入到4 ℃冰箱靜置1 h,6000×g離心20 min,取上清液作為肌原纖維蛋白溶液。采用雙縮脲法對蛋白質濃度進行測定,用牛血清白蛋白作為標準蛋白。

1.2.3肌原纖維蛋白巰基數量的測定巰基數量的測定參考文獻[13-14],并稍作修改。肌原纖維蛋白溶液濃度調至2 mg/mL,取0.5 mL蛋白溶液,加入4.5 mL 0.2 mol Tris-HCI緩沖液(含8 mol/L尿素,2% SDS,10 mmol/L EDTA,pH6.8),取4 mL混合液,加入0.5 mL 0.1% DTNB-Tris-HCI緩沖液,40 ℃反應20 min,在412 nm下測定吸光度。

巰基數量(mol/10000 g)=AD/BC

式中,A為吸光度,B為蛋白濃度mg/mL,C為分子吸光系數,C=13600 L/mol·cm,D為稀釋倍數,蛋白濃度為2 mg/mL。

1.2.4肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的測定Ca2+-ATPase活性的測定參考文獻[13],并稍作修改。肌原纖維蛋白溶液調至2 mg/mL,取0.5 mL蛋白溶液,依次加入0.25 mL pH7.0的Tris馬來酸緩沖液、025 mL 0.1 mol/L CaCI2溶液,3.75 mL去離子水,0.25 mL 20 mmol/L ATP溶液,25 ℃反應3 min,加入2.5 mL 15% TCA終止反應,反應液6000 r/min離心5 min,取上清液采用鉬藍比色法測定無機磷的含量。

Ca2+-ATPase活性(μmol Pi/mg·min)=m/t·M

式中,m為生成的無機磷含量(μmol),t為反應時間(min),M表示肌原纖維蛋白的含量。

1.2.5肌原纖維蛋白表面疏水性的測定表面疏水性的測定參考文獻[15],并稍作修改。蛋白溶液分別稀釋到0.125、0.25、0.5、1 mg/mL,分別取2 mL,加入10 μL含8 mmol/L ANS的pH7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液,暗反應10 min,在激發波長390,發射波長470,狹縫5 nm的條件下測定熒光強度,表面疏水性S0以熒光強度與蛋白濃度對應曲線的斜率表示。

1.2.6肌原纖維蛋白SDS-PAGE的研究SDS-PAGE參考文獻[16],并稍作修改。肌原纖維蛋白溶液濃度調至4 mg/mL,采用濃縮膠濃度5%,分離膠濃度12%,上樣量為10 μL。電壓80 V,待染料前端跑到分離膠時,加大電壓到120 V,直至電泳完成,電泳后凝膠用考馬斯亮藍R250染色,經脫色后,進行凝膠成像。

1.2.7數據處理每組實驗進行三次,采用平均值。使用SPSS19.0軟件(IBM公司,USA)對數據進行分析(Turkey HSD),對于每個參數,計算其在95%的置信區間內的顯著性差異。

2　結果與分析

2.1超臨界CO2萃取對肌原纖維蛋白巰基數量的影響

萃取溫度和壓力對肌原纖維蛋白巰基數量的影響如圖1,未經超臨界萃取處理的樣品肌原纖維蛋白巰基數量為2.05×10-5mol/g。經過萃取處理的樣品巰基數量隨溫度和壓力的升高而下降,在25 MPa、55 ℃達到最小值1.11×10-5mol/g,而在15 MPa、35 ℃的條件下具有最大值1.69×10-5mol/g。巰基數量的下降可能是由于肌原纖維蛋白在超臨界萃取脂質過程中巰基基團暴露,氧化聚集,形成了二硫鍵[17],隨著溫度和壓力的升高,蛋白進一步發生了變性和展開,從而使巰基數量不斷下降。經過處理的樣品巰基數量在15 MPa、35 ℃時具有最大值,說明此條件下超臨界CO2對樣品肌原纖維蛋白的影響最小,因此研究萃取時間對肌原纖維蛋白巰基數量的影響選擇在15 MPa、35 ℃、1～3 h的條件下進行。

圖1　萃取溫度和壓力對肌原纖維蛋白巰基數量的影響Fig.1　Effect of temperature and pressure on sulphydryl content of myofibrillar proteins注:定義25 ℃時樣品的巰基數量為未處理樣品的巰基數量；圖3、5同。

萃取時間對肌原纖維蛋白巰基數量的影響如圖2,肌原纖維蛋白巰基數量隨著時間的延長呈現下降的趨勢,與未處理樣品相比,處理1、2、3 h的樣品巰基數量分別下降了13.7%,17.6%,20.5%。根據兩點之間的斜率進行比較,可以發現巰基數量的下降主要發生在萃取過程的1 h內,說明蛋白結構的變化主要發生在萃取過程的開始階段,從而使得巰基數量下降。這可能是由于在超臨界萃取過程中的1 h內脂質提取的量較高,大量的脂肪被除去,超臨界CO2與肌原纖維蛋白的接觸面積增大,CO2對蛋白的作用增強,使得肌原纖維蛋白的大部分巰基暴露,更容易被氧化,從而導致巰基數量主要下降發生在萃取的1 h內。

圖2　萃取時間對肌原纖維蛋白巰基數量的影響Fig.2　Effect of time on sulphydryl content of myofibrillar proteins注:相同小寫字母表示差異不顯著(p>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)；圖4、6同。

巰基氧化、巰基/二硫鍵交換等反應產生的蛋白質分子間的二硫鍵將對食品的功能性質產生影響。一方面,吸附于空氣-水界面或油-水界面的蛋白質所形成的二硫鍵交聯網絡結構對于穩定乳狀液和氣泡具有重要作用[18],乳液界面蛋白質形成的分子間二硫鍵,增強吸附蛋白質的表面粘彈性,增大乳液粘度[19]。另一方面,在凝膠結構中蛋白分子間二硫鍵交聯具有增強凝膠彈性和強度的作用,肌球蛋白和肌動蛋白含有豐富的巰基,經氧化劑誘導形成二硫鍵交聯增強了肉制品的凝膠性[20]。因此,巰基氧化,二硫鍵的生成有利于肌原纖維蛋白乳化性質和凝膠性質的提高。

2.2超臨界CO2萃取對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

超臨界CO2萃取脂質對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響如圖3和圖4。未經超臨界萃取處理的樣品Ca2+-ATPase活性為0.25 μmol Pi/mg·min,隨著溫度和壓力的升高,Ca2+-ATPase活性也呈現了下降的趨勢,與巰基數量相似,并在25 MPa,55 ℃的條件下達到最小值0.06 μmol Pi/mg·min,這是因為蛋白質氧化和巰基數量的下降與Ca2+-ATPase活性的喪失密切相關[21]。

圖3　萃取溫度和壓力對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響Fig.3　Effect of temperatue and pressure on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar proteins

圖4　萃取時間對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響Fig.4　Effect of time on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar proteins

Ca2+-ATPase活性是一個表征肌凝蛋白完整性的良好指標[22],因為肌凝蛋白的球狀頭部具有Ca2+-ATPase活性。Ca2+-ATPase活性是肌球蛋白的最主要特性,反映肌球蛋白的生化活性,與肌球蛋白的生物功能、凝膠形成有一定的關系。Ca2+-ATPase活性的下降可能是由于肌凝蛋白的球狀頭部構象變化,發生聚合,以及蛋白質通過蛋白質之間的相互作用產生了重排[13]。位于肌凝蛋白頭部的巰基(SH1、SH2)對Ca2+-ATPase活性具有重要作用[23],這部分巰基的氧化會導致Ca2+-ATPase活性的下降。超臨界萃取脂質過程中隨著溫度和壓力的升高,Ca2+-ATPase活性下降,說明蛋白質的頭部結構發生變化,巰基暴露氧化,形成了二硫鍵,有利于改善蛋白質的乳化和凝膠等功能性質。

隨著時間的延長,肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性顯著下降,與未處理樣品相比,在經過萃取1、2、3 h后分別下降了36%、44%、52%,與巰基數量受萃取時間影響類似,Ca2+-ATPase活性的下降主要發生在1 h內。在本實驗的條件范圍內,Ca2+-ATPase活性下降最大發生在25 MPa、55 ℃時,此時相比未處理樣品,肌原纖維蛋白巰基數量下降了76%,這說明經過超臨界萃取處理后的肌凝蛋白大部分構象發生了變化,但仍有部分保持一定的結構和活性。肌凝蛋白對凝膠的形成具有重要作用,經過超臨界萃取處理后Ca2+-ATPase活性下降,巰基氧化,生成了二硫鍵,可能會使其乳化和凝膠等功能性質得到提高。

2.3超臨界CO2萃取對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

圖5　萃取溫度和壓力對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.5　Effect of temperature and pressure on surface hydrophobicity of myofibrillar proteins

ANS是一種有效的熒光探針,用來檢測蛋白質分子結構的變化[24]。萃取溫度和壓力對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響如圖5,未經超臨界萃取處理的樣品表面疏水性為62.39,隨著溫度和壓力的升高,肌原纖維蛋白的表面疏水性呈現上升的趨勢,在25 MPa、55 ℃時表面疏水性達到最大值69.13。表面疏水性的增加說明肌原纖維蛋白的結構和構象在超臨界萃取脂質過程中發生變化,導致疏水基團變得更加暴露,結合了ANS[25]。Temelli[26]等人研究了超臨界CO2萃取大西洋鯖魚脂質后蛋白質理化性質的變化,發現經過超臨界CO2萃取脂質后蛋白的系水能力有所增強,說明萃取脂質使得蛋白質表面結合部位發生變化,從而增強了蛋白質的疏水性。

萃取時間對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響如圖6,隨著時間的延長,蛋白的表面疏水性升高,不同于巰基數量與Ca2+-ATPase活性,表面疏水性在1～2 h內增加最多,這可能是由于1～2 h內脂質提取率最高,較高脂肪的去除量使蛋白表面結合部分發生較大的變化,從而使蛋白疏水性增加最多。

圖6　萃取時間對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.6　Effect of time on surfacehydrophobicity of myofibrillar proteins

疏水作用的增加,說明了蛋白質結構的變化使疏水基團出現在分子的表面,形成了疏水相互作用,減少了自由能,疏水作用參與了膠凝過程[27],并且疏水基團在膠凝過程中起很重要的作用[28]。因此表面疏水性的增加有利于蛋白質凝膠性質的改善和提高。Smaeijma等則發現在肌球蛋白膠凝過程中,頭部的聚集與疏基有關,而尾部的聚集主要是非共價鍵如氫鍵、疏水相互作用在起作用[29]。

2.4超臨界CO2萃取對肌原纖維蛋白SDS-PAGE影響

SDS-PAGE圖像顯示南極磷蝦肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、肌鈣蛋白T、原肌球蛋白、肌球蛋白輕鏈組成,各個蛋白的分子量大約分別為220、43、37、35、17～20 ku。隨著溫度和壓力的升高,肌原纖維各蛋白條帶逐漸變淺,可能是由于肌原纖維蛋白在脂質萃取過程中受到超臨界CO2的影響,形成新的疏水鍵、氫鍵、二硫鍵,小分子量的蛋白發生聚集,形成了大分子量的蛋白。Temelli[26]在研究超臨界CO2萃取大西洋鯖魚脂質后各分子量蛋白變化時,發現分子量<100 ku的蛋白含量均有減少,>100 ku蛋白含量有所上升,其中以220 ku上升為主。隨著時間的延長,肌原纖維蛋白的條帶略有變淺,這是因為肌原纖維蛋白在脂質萃取過程中受到超臨界CO2的影響,發生了部分變性。本實驗中肌原纖維各小分子蛋白條帶隨溫度和壓力的升高、時間的延長略有變淺,這與上述的研究結果一致,但未見高分子量蛋白條帶的形成,這可能是由于形成的高分子量蛋白較少,在電泳條帶中不明顯。經過萃取處理后新形成的一些鍵對凝膠的形成具有重要的作用,氫鍵在水凝膠穩定結合水方面發揮重要作用,蛋白分子表面極性氨基酸基團的暴露,造成大量的水分子與其進行鍵合。二硫鍵是巰基氧化形成的,有利于穩定乳液和增強凝膠強度,而疏水相互作用力則是一個熱動力學事件,主要由于蛋白變性造成疏水位點暴露引起[30],疏水作用的增強有利于蛋白質凝膠性質的改善和提高。

圖7　15 MPa下不同時間和溫度的肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳Fig.7　SDS-PAGE analysis of myofibrillar proteinsunder different time and temperatures of 15 MPa注:1,6為Marker;2,7為未處理樣品;3～5分別為15 MPa,35 ℃,1、2、3 h處理下的蛋白條帶,8～10分別為15 MPa,2 h,35、45、55 ℃處理下的蛋白條帶。

圖8　20 MPa和25 MPa 下不同溫度的肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳Fig.8　SDS-PAGE analysis of myofibrillar proteinsunder different temperatures of 20 and 25 MPa注:1,6為Marker;2,7為未處理樣品;3～5分別為20 MPa,2 h,35、45、55 ℃處理下的蛋白條帶;8～10分別為25 MPa,2 h,35、45、55 ℃處理下的蛋白條帶。

Ai-Nehari[31]研究南極磷蝦經超臨界CO2萃取脂質后消化酶電泳條帶的變化后發現,未經處理的樣品蛋白條帶與超臨界CO2萃取脂質后的蛋白條帶基本一致,認為超臨界萃取脂質過程中蛋白沒有變性。這與本實驗的結果有所不同,本實驗中通過超臨界萃取處理后的蛋白條帶雖與原樣相比基本一致,但略有變淺,造成這種不同的原因可能是由于本實驗采用的原料是新鮮的南極磷蝦,水分含量高于上述研究采用的干燥的磷蝦,大量水分的存在可能會使蛋白結構發生更大的變化。蛋白條帶的變淺說明蛋白在超臨界萃取過程中發生了部分變性,超臨界萃取處理會使南極磷蝦肌原纖維蛋白的結構發生變化,生成新的疏水鍵、氫鍵、二硫鍵,從而提高蛋白的乳化和凝膠等功能性質,這對南極磷蝦的加工及利用有重要意義。

3　結論

本文通過研究超臨界萃取脂質后南極磷蝦肌原纖維理化性質的變化,為南極磷蝦加工利用提供基礎數據。經過超臨界萃取脂質處理后,南極磷蝦蛋白的巰基數量和Ca2+-ATPase活性均有所下降,在25 MPa、55 ℃達到最小值。表面疏水性有所升高,也在25 MPa、55 ℃達到最大值。巰基數量和與Ca2+-ATPase活性的下降主要發生在0～1 h內,而表面疏水性的上升主要發生在1～2 h內。SDS-PAGE電泳圖顯示超臨界萃取脂質后的蛋白條帶有所變淺,說明超臨界萃取會使蛋白結構發生變化,產生新的作用鍵。巰基氧化、二硫鍵的生成,表面疏水性的升高以及其他作用鍵的形成有利于改善蛋白的乳化和凝膠性質,說明經過超臨界萃取處理后的南極磷蝦肌原纖維蛋白乳化和凝膠等功能性質會得到改善,有利于南極磷蝦的進一步加工和利用。

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Effect of supercritical CO2extraction of oil on physicochemical properties of myofibrillar proteins inEuphausiaSuperba

WANG Xiao-long1,FENG Xiao-mei1,SUI Xiao2,XI Xuan1,HAN Yu-qian1,*

(1.Food Department,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Biology Department of Qingdao University,Qingdao 266071,China)

Physicochemical properties of myofibrillar proteins inEuphausiaSuperbawas investigated following extraction of oil with supercritical CO2in order to provide basic information for food process. The lipids ofEuphausiaSuperbawas extracted at 15～25 MPa,35～55 ℃,2 h and 15 MPa,35 ℃,1～3 h. Sulphydryl content,Ca2+-ATPase activity,surface hydrophobicity and SDS-PAGE pattern were measured after extraction to study the changes in myofibrillar proteins . Total sulphydryl content and Ca2+-ATPase activity decreased with pressure,temperature and time while surface hydrophobicity increased after extraction. The changes in total sulphydryl content and Ca2+-ATPase activity mainly occurred during the first hour,however,surface hydrophobicity increased most at 1～2 h. SDS-PAGE pattern showed there were slight changes in protein bands,which indicated the structure of myofibrillar proteins varied after supercritical CO2extraction,thus some new bonds formed. After supercritical CO2extraction,the oxidized sulphydryl groups,formed disulfide bonds,increase in surface hydrophobicity and formation of some new bonds all improved the emulsifying and gel properties of proteins,which was very important to the application of theEuphausiaSuperba.

supercritical fluids extraction;EuphausiaSuperba;myofibrillar proteins;physicochemical properties;effect

2016-03-08

王曉龍(1990-),男,碩士研究生,研究方向:食品質量與安全控制,E-mail:wangxiaolong0109@163.com。

韓玉謙(1962-),男,教授,研究方向:超/亞臨界流體萃取技術的應用,E-mail:hanyuqian@ouc.edu.cn。

TS254.4

A

1002-0306(2016)18-0116-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.014