添加具有抑真菌特性植物乳桿菌生產切達干酪工藝條件的研究

范　帥,陳忠軍,忻勝兵,淡　婧,溫　梅

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

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添加具有抑真菌特性植物乳桿菌生產切達干酪工藝條件的研究

范帥,陳忠軍*,忻勝兵,淡婧,溫梅

(內蒙古農業大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018)

以兩株具有抑制真菌活性的植物乳桿菌LactobacillusplantarumALAC-3、LactobacillusplantarumALAC-4為研究對象,分別與工業發酵劑復配生產切達干酪。通過研究傳統發酵劑與具有抑真菌特性植物乳桿菌的不同菌株混合比例、接種量、培養溫度、發酵時間因素的影響,采用單因素分析及正交實驗,確定生產切達干酪的最佳工藝條件。并對添加植物乳桿菌生產的干酪的抑菌效果進行研究。結果表明,ALAC-3菌株發酵生產切達干酪的最佳工藝條件為:傳統發酵劑與ALAC-3菌種混合比例4∶4∶2.5,接種量3%,培養溫度35 ℃,發酵時間20 min;ALAC-4菌株發酵生產切達干酪的最佳工藝條件為:傳統發酵劑與ALAC-4菌種混合比例4∶4∶0.5,接種量3%,培養溫度37 ℃,發酵時間25 min。在此工藝條件下,制得的干酪質量良好。25 ℃的貯藏條件下,添加ALAC-3(ALAC-4)生產的干酪產品抑制真菌的效果良好。因此,可以將ALAC-3和ALAC-4作為生物防腐劑應用于切達干酪的生產中。

乳桿菌,抑真菌特性,干酪,工藝條件

近年來,生物保鮮劑因其天然安全、高效且保護食品原有風味的特性在食品保鮮中的優勢日漸凸顯,且必將成為一種趨勢[1]。乳酸菌及其代謝物通過抑制腐敗菌和致病菌的生長,進而可以使食品腐敗延緩、食品貨架期延長,而且能夠維持并改善食品的風味,提升食品附加值,并且因其無毒副作用的防腐特性,在發酵食品中被廣泛應用。因此,乳酸菌及其代謝產物在食品特別是乳制品保鮮中的應用逐漸成為研究熱點[2-3]。研究表明,Nisin應用于各式干酪,可以解決由梭狀菌引起的變質問題,同時能夠有效防止肉毒桿菌對干酪的污染[4]。此外,乳酸菌發酵劑在干酪生產和成熟過程中起酸化、改善質構和產香的作用,發酵劑菌株的酶系不同,生產出的干酪品質也不同[5]。在我國,干酪生產發展緩慢,除了經濟因素,口味難以接受也是重要原因[6],所以,開發風味口感優良且貨架期長的干酪產品已成為必然。

前期的實驗研究發現,LactobacillusplantarumALAC-3和LactobacillusplantarumALAC-4具有抑真菌特性,且抑菌物質是一種蛋白類物質[7]。因此,在干酪生產過程中添加ALAC-3和ALAC-4,評定其風味質構并觀察產品抑菌活性,具有實際應用意義。本實驗以感官評定為主要篩選標準,進行ALAC-3和ALAC-4在干酪生產中工藝條件的優化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

原料乳市售新鮮無抗牛乳;供試菌種乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種(內蒙古農業大學微生物實驗室)、實驗室篩選鑒定出的2株植物乳桿菌LactobacillusplantarumALAC-3、LactobacillusplantarumALAC-4;小牛皺胃酶內蒙古農業大學微生物實驗室;脫脂乳粉;MRS培養基葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、Tween 80 1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳54 mg/L,pH6.5,121 ℃、15 min滅菌;脫脂乳培養基脫脂乳粉100 g/L、酵母粉10 g/L,105 ℃、10 min滅菌。

DPX-9162B-1電熱恒濕培養箱上海?，攲嶒炘O備有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺蘇州博萊爾凈化設備有限公司;BCD-249CF美菱冰箱合肥美菱股份有限公司;可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠;PB-10酸度計賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;FA2104N電子天平奧蒙斯儀器(上海)有限公司;DL-I-15臺式電爐天津市泰斯特儀器有限公司;KDC-I40HR商速冷凍離心機安徴中科中佳科學儀器有限公司;HPX-9052 MBE數顯電熱培養箱上海博迅實業有限公司醫療設備廠;HWS-12電熱恒濕水浴鍋上海一恒科學儀器有限公司;TA-XT2i質構儀英國Stable Micro System公司;UD K126D凱氏定氮儀意大利help公司;DZQ-400/2S真空充氣包裝機章丘市炊具機械總廠包裝機械廠;干酪槽;真菌試紙。

1.2實驗方法

1.2.1切達干酪的生產工藝原料乳標準化→巴氏殺菌(72 ℃、15 s)→冷卻至30～32 ℃→添加2%的發酵劑→靜置培養30 min→添加凝乳酶(按1 mL/1000 L的比例添加)→保溫(32 ℃)靜置45 min以上→凝塊切割→熱燙→乳清排出→堆釀→加鹽→壓榨(18 h)→包裝→成品。

1.2.2干酪的品質測定

1.2.2.1質構指標使用質構儀測定切達干酪質構指標。

質構儀測定樣品的硬度、粘性、彈性、內聚性、膠著性、咀嚼性、回復性,所有樣品重復測定3次,然后求其平均值。質構儀具體參數設定為:

負載類型:Auto-5 g;下壓距離:5 mm;保持時間:0 s;恢復時間:1 s;測中速:120 mm/min;探頭:A/WEG;樣品規格:長×寬×高=30 mm×10 mm×10 mm。

1.2.2.2感官評定邀請10名從事食品研究的人員組成評定小組,評定分數采用100分制,取平均分作為總感官評分。感官評定打分標準如下[8]:

表1　干酪感官評定打分標準

1.2.3添加抑真菌特性乳酸菌生產切達干酪工藝的研究

1.2.3.1菌種混合比例對切達干酪的品質影響將活化好的乳球菌乳酸亞種、乳球菌乳脂亞種、ALAC-3菌株按4∶4∶1、4∶4∶2、4∶4∶3、4∶4∶4、4∶4∶5的混合比例,以3%的接種量投放于原料乳中,按照1.2.1的工藝制作干酪,進行感官評定并打分。按照相同方法確定乳球菌乳酸亞種、乳球菌乳脂亞種與ALAC-4的混合比例。

1.2.3.2不同接種量對切達干酪的品質影響將活化好的菌種按上述確定的最佳混合比例,分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量投放于脫脂乳培養基中,按照預實驗的工藝制作干酪,分別對添加ALAC-3和ALAC-4制作的干酪進行感官評定并打分,確定最佳接種量。

1.2.3.3不同溫度發酵對切達干酪的品質影響將活化好的菌種以最佳混合比例,按以上確定的接種量投放于原料乳中,其他工藝不變的情況下分別在25、30、37、40、45 ℃下,按照預實驗的工藝制作干酪,分別對添加ALAC-3和ALAC-4制作的干酪進行感官評定并打分。

1.2.3.4不同發酵時間對切達干酪的品質影響將活化好的菌種按最佳混合比例及接種量,其他工藝不變的情況下在最適溫度靜置培養下分別培養10、15、20、25、30 min后,分別對添加ALAC-3和ALAC-4制作的干酪進行感官評定并打分。

1.2.3.5通過正交實驗確定最佳工藝依據單因素實驗結果,對菌種混合比例、接種量、發酵溫度、發酵時間四個影響因素進行正交實驗分析。采用正交實驗表,確定發酵干酪的最佳工藝條件。

表2　ALAC-3組工藝條件L9(34)因素水平表

表3　ALAC-4組工藝條件L9(34)因素水平表

1.2.4添加抑真菌乳桿菌生產干酪防腐效果研究

1.2.4.1抑菌效果研究將在最佳工藝條件下添加ALAC-3和ALAC-4生產的切達干酪,與添加傳統菌株生產的切達干酪采用在空氣中裸露放置,并在4 ℃和25 ℃條件下進行貯藏。每天測定ALAC-3(ALAC-4)干酪和傳統干酪的酵母數和霉菌數。判斷ALAC-3和ALAC-4的抑菌效果。

1.2.4.2成品干酪中酵母和霉菌數的測定將待測的干酪成品在生理鹽水中倍比稀釋,參考GB/T 4789.15-2010,采用孟加拉紅培養基進行計數[9]。

1.3數據處理

實驗數據采用DPS 6.55軟件進行數據處理分析,數據表示為(平均數±方差),采用Origin 8.5軟件做圖。

2　結果與分析

2.1菌種混合比例對切達干酪的品質影響

將活化好的乳球菌乳酸亞種、乳球菌乳脂亞種、菌株ALAC-3(ALAC-4)按照不同的混合比例制作后干酪,進行感官評定,結果見圖1。

圖1　不同菌種混合比例對干酪的感官評分影響Fig.1　Effect of mixed proportion of different strains on sensory evaluation of cheese

由圖1可知,不同的菌種混合比例對干酪風味的影響很大。當乳球菌乳酸亞種、乳球菌乳脂亞種、ALAC-3菌株以4∶4∶2的比例混合時,制作的干酪感官評分顯著高于其他混合比例;而乳球菌乳酸亞種、乳球菌乳脂亞種、ALAC-4菌株以4∶4∶1的比例混合時,干酪具有良好的感官評價。

2.2接種量對切達干酪的品質影響

菌種的接種量對切達干酪的感官品質作用明顯。將活化好的菌種分別不同的接種量接種于原料乳中,按照1.2.1方法制作干酪,并進行感官評定。結果見圖2。

圖2　菌株不同接種量對干酪的感官評分影響Fig.2　Effect of different inoculation amount of strain on sensory evaluation of cheese

從圖2可以看出,在接種量為3%時,添加ALAC-3和ALAC-4菌株制作的干酪感官評分最高。發酵劑的添加量在干酪加工過程中影響產品的酸度及口感、組織狀態,對干酪產率也有影響。研究表明,發酵劑接種量過低,菌株活力不好,產酸速度減慢,發酵工藝時間延長,蛋白分解能力差,影響干酪產品品質,且降低經濟效益[10];而發酵劑接種量過高,初期在干酪乳中生長過快,產生的乳酸過量,并且會出現干酪產品硬度下降,水分含量增加,產生苦味等現象[11]。

2.3發酵溫度對切達干酪的品質影響

將活化好的菌種以最佳混合比例,按3%的接種量接種于原料乳中,分別不同的發酵溫度生產干酪,進行感官評定,結果見圖3。

圖3　不同溫度對干酪的感官評分影響Fig.3　Effect of different temperature on the sensory evaluation of cheese

由圖3可知,對于ALAC-3菌株,在30 ℃發酵時干酪的感官最佳;而ALAC-4菌株在40 ℃發酵時制作的干酪感官評分明顯高于其它組。

2.4發酵時間對切達干酪的品質影響

將活化好的菌種以最佳混合比例,3%接種量接種于原料乳中,按照不同的發酵時間制作干酪,進行感官評分,結果見圖4。

表6　優選工藝條件樣品剪切力測定及感官評分結果

圖4　不同發酵時間對干酪的感官評分影響Fig.4　Effect of different fermentation time on the sensory evaluation of cheese

注:小寫字母不同表示數據間差異顯著(p<0.05)。

由圖4可知,隨著發酵時間的延長,添加菌株的干酪感官評分逐漸上升,當發酵時間為25 min時,添加ALAC-3和ALAC-4菌株制作的干酪感官評分均達到最高,隨著發酵時間繼續延長到30 min時,感官評分反而下降。

2.5正交實驗確定最佳工藝參數

正交實驗結果如表4和表5所示。

表4　ALAC-3工藝條件正交實驗結果

從表4中通過各因素的極差值RA>RB>RC=RD可以看出,影響ALAC-3生長的主次關系為:菌種混合比例>接種量>溫度=發酵時間。并根據各因素的排序可以得到,添加ALAC-3菌株時,干酪發酵的工藝條件最佳組合為菌種混合比例4∶4∶2.5,接種量3%,溫度35 ℃,發酵時間20 min。

表5　ALAC-4工藝條件正交實驗結果及極差分析

從表5中通過各因素的極差值RB>RA>RD>RC可以看出,影響ALAC-4生長的主次關系為:接種量>菌種混合比例>發酵時間>溫度。并根據各因素的排序可以得到,添加ALAC-4菌株時,干酪發酵的工藝條件最佳組合為菌種混合比例4∶4∶0.5,接種量3%,溫度32 ℃或者37 ℃,而綜合單因素實驗感官評分和相關質構指標,選擇37 ℃發酵,發酵時間25 min。

2.6干酪成品剪切力測定

在最佳工藝條件生產切達干酪,測定其質構指標(剪切力)并進行感官評定。結果分別如表6所示。

由表6可以看出,添加ALAC-3和ALAC-4菌株在優選工藝條件下生產的干酪產品彈性好、硬度適中、凝聚性高、膠粘性適中,均與對照組差異顯著;在添加ALAC-3的優組合條件下生產的干酪產品感官評分為89.21,添加ALAC-4的優組合條件下生產的干酪產品感官評分為90.09,均顯著高于對照組,而ALAC-3組樣品和ALAC-4組樣品感官評分組間差異不明顯。在此工藝條件下干酪產品的組織狀態細膩、均勻,滋氣味較濃。

表7　25 ℃裸露放置干酪成品中霉菌數、酵母數測定

注:小寫字母不同表示數據間差異顯著(p<0.05)。

2.7抑菌效果研究

將在最佳工藝條件下添加ALAC-3和ALAC-4生產的切達干酪,與添加傳統菌株生產的切達干酪在25 ℃裸露放置貯藏。測定干酪成品的酵母數和霉菌數,并記錄產品中的酵母數和霉菌數超標(≥50 CFU/g即為超標)的日期[12]。

從表7可以看出,在25 ℃裸露放置條件下,傳統菌株干酪產品放置至2 d時霉菌數超過國標要求的50 CFU/g[12],放置至3 d時酵母數超標。添加ALAC-3和 ALAC-4干酪產品中的霉菌數分別在4 d和5 d超標,酵母數在5 d和在4 d時超標。

實驗表明,與添加傳統菌株生產的干酪相比,添加菌株ALAC-3和ALAC-4可以抑制干酪中真菌的污染。

3　結論

添加具有抑制真菌特性乳桿菌生產切達干酪,對于ALAC-3菌株,最佳工藝條件為:菌種混合比例4∶4∶2.5,接種量3%,培養溫度35 ℃,發酵時間20 min;對于ALAC-4菌株,最佳工藝條件為:菌種混合比例4∶4∶0.5,接種量3%,培養溫度37 ℃,發酵時間25 min。在此最佳工藝條件下,生產制得的干酪質構組織狀態良好,彈性好、硬度適中、凝聚性高、膠粘性適中,感官評分均顯著高于傳統對照組。25 ℃裸露貯藏條件下,添加ALAC-3(ALAC-4)生產的干酪產品中的霉菌數和酵母數超標日期晚于傳統菌株超標日期。

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Study on production technology of Cheddar cheese addingLactobacillusplantarumwith antifungal activity

FAN Shuai,CHEN Zhong-jun*,XIN Sheng-bing,DAN Jing,WEN Mei

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China)

In this study,LactobacillusplantarumALAC-3 and ALAC-4 being of antifungal activity was chosen to produce Cheddar cheese combining with industrial fermentation agent.Single factor experiment and orthogonal experiments were used to traditional strain and optimize ratio of different lactobacillus strains with fungal inhibition,inoculation amount,culture temperature and fermentation time. The antifungal effect of cheese adding the Lactobacillus was studied. The results showed the optimum fermentation conditions for ALAC-3,were as follows:the mixing proportion of traditional strain and ALAC-3 was 4∶4∶2.5,inoculum size was 3%,fermenting at 35 ℃ for 20 min. For ALAC-4 the result was as follows:the mixing proportion of traditional strain and ALAC-4 was 4∶4∶0.5,inoculum size was 3%,fermenting at 37 ℃ for 25 min. Comparing with the traditional cheese,the special cheese products adding ALAC-3(ALAC-4)had significantly antifungal effect when were stored at 25 ℃. Therefore,the Lactobacillus of ALAC-3 and ALAC-4 could be used as biological preservative in the production of cheddar cheese.

Lactobacillus;antifungal effect;cheese;production technology

2016-03-23

范帥(1988-),男,碩士研究生,研究方向:食品微生物,E-mail:364231050@qq.com。

陳忠軍(1971-),女,博士,教授,研究方向:食品微生物及發酵工程,E-mail:nmndchen@126.com。

國家自然科學基金(31260390);內蒙古自然科學基金(2015MS0364)。

TS252

A

1002-0306(2016)18-0180-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.026