超聲波輔助酶法提取草魚皮膠原蛋白及其純化

王金梅,包建強

(上海海洋大學食品學院,上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306)

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超聲波輔助酶法提取草魚皮膠原蛋白及其純化

王金梅,包建強*

(上海海洋大學食品學院,上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306)

本文研究了超聲波輔助提取草魚皮膠原蛋白的工藝。以超聲功率、超聲時間和酶解時間為實驗因素,膠原蛋白提取率為響應值,利用Box-Behnken設計實驗及響應面法分析實驗,確定其最佳提取工藝條件。結果顯示:最佳工藝條件為超聲功率310 W,超聲時間10 min,酶解時間29 h,此時膠原蛋白提取率達到68.67%,與模型理論預測值(68.80%)較為相近,相對誤差僅為0.189%。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜(SDS-PAGE)和傅里葉紅外光譜(FTIR)譜圖,對比超聲波作用下與無超聲波作用的膠原蛋白發現,超聲波對膠原蛋白結構無明顯影響。

超聲波,草魚皮,膠原蛋白,凝膠電泳,傅里葉紅外光譜

我國是水產大國,2014年淡水魚總產量達2770萬噸,占魚類年產量的73%之多[1]。近年來水產品加工業快速發展,魚類產品加工中產生了大量的廢料,60%～70%的魚體部分成了加工副產品[2]。由于大量的魚類廢料(魚皮、魚鱗、魚骨等)未經處理被隨意丟棄,不僅造成生物資源的浪費,還造成嚴重的環境污染,魚產品加工廢料的生物價值和開發利用引起人們廣泛關注。加工副產品中的魚皮占很大比例,而研究發現草魚皮膠原蛋白的量占粗蛋白的88.07%,表明魚皮中膠原蛋白含量豐富[3]。

近年來超聲波在成分提取方面應用廣泛,如從鱈魚皮[4]、大鯢魚皮[5]、深海紅魚[6]及豬皮[7]、牛蹄筋[8]中提取膠原蛋白,膠原蛋白提取率提高效果顯著,但缺乏對提取得到的膠原蛋白的結構進行鑒定研究。楊萌萌[8]等利用超聲波輔助胃蛋白酶法提取牛蹄筋膠原蛋白,最優提取條件為超聲功率366 W,超聲時間7.4 min,提取率提高了10.69%。王希等[4]研究了鱈魚皮提取膠原蛋白最佳條件:超聲波輔助提取時間3.5 h、酶解時間7.5 h,膠原蛋白提取率達33.75%。王林等[6]研究了深海紅魚的超聲提取最優工藝,功率505 W,超聲時間15 min、提取時間18 h,在此條件下,膠原蛋白提取率(93.6%)與傳統提取方法無顯著性差異,但提取時間縮短了30 h。

值得注意的是,水產品膠原蛋白提取不同于一般動物,水產品膠原蛋白變性溫度較低,膠原蛋白特有的三級螺旋結構更容易被破壞,而三級螺旋結構是膠原蛋白具有生物功能的重要指標。本文實驗超聲波輔助提取草魚皮膠原蛋白,優化實驗過程中嚴格控制超聲波工作時間間隔以降低溫度,并對提取得到的膠原蛋白結構進行鑒定,為膠原蛋白類生物功能性材料的開發利用提供了理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮草魚魚皮南潯新雅農產品(浙江)開發有限公司,實驗室-50 ℃冷凍保藏;羥脯氨酸南京建成生物工程研究所;胃蛋白酶(3000 U/g)、氫氧化鈉、正丁醇、乙酸、Tris堿分析純,國藥集團試劑有限公司。

UV-18OOPC型紫外可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司;KjeltecTM2300自動凱氏定氮儀福斯華科貿有限公司;FOSS消化爐丹麥福斯公司;SZF-06脂肪測定儀上海新嘉電子有限公司;PYRAMID TX陶瓷纖維馬弗爐北京皮爾美特科技有限公司;J-26XP冷凍離心機貝克曼庫爾特;Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀賽默飛世爾科技分子光譜;XO-SM100超聲波微波組合反應系統先歐儀器(南京)制造有限公司。

1.2基本成分分析方法

水分含量測定采用直接干燥法(GB/T 5009.3-2010);蛋白質含量測定采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2010),轉化系數取6.25;脂肪含量測定采用索氏抽提法(GB/T5009.6-2003);灰分含量測定采用灼燒恒重法(GB/T5009.4-2010);總糖含量測定采用苯酚-硫酸法(GB/T5009.8-2008)。

1.3草魚皮膠原蛋白的提取

1.3.1膠原蛋白提取純化魚皮室溫流水解凍,刮掉魚皮表面殘留魚肉及表面水分,剪碎稱重,氫氧化鈉浸泡除去雜蛋白,水洗至中性,正丁醇浸泡除脂,水洗,加0.5 mol/L乙酸,料液比1∶15,一定功率下超聲處理一定時間,再加4%的酶進行一定時間的酶解,離心(10000×g,10 min)取上清液,加Tris調節pH至中性,加入氯化鈉進行鹽析,離心(10000×g,30 min)取沉淀,加乙酸復溶,低濃度乙酸中透析,冷凍干燥得膠原蛋白樣品[8]。

1.3.2羥脯氨酸標準曲線繪制參考Woessner[9]的比色法。酶解液中提取率計算公式如下:

式中:X為膠原蛋白提取率,ω為酶解液中羥脯氨酸的質量,9.09為羥脯氨酸轉換系數。

1.3.3單因素實驗本實驗草魚皮經過脫脂處理后進行超聲波輔助下的酶溶液提取,首先通過預實驗確定酶解過程中的兩個重要因素,酶用量(8%)和樣品的料液比(1∶10),然后進行超聲波處理,從中涉及到三個因素,超聲功率、超聲時間和酶解時間。分別設定三個單因素的水平為:超聲時間10 min,酶解時間25 h,超聲功率100、200、300、400和500 W;超聲功率300 W,酶解時間25 h,超聲時間分別為2、5、10、15和20 min;超聲功率300 W,超聲時間10 min,酶解時間分別為10、15、20、25和30 h。實驗重復3次,數據取均值。

1.3.4響應面設計實驗應用Box-Behnken模型,以超聲功率、超聲時間和酶解時間為自變量,膠原蛋白得率為響應值設計實驗。響應面因素水平見表1。

表1　響應面因素水平表

1.4聚丙稀銑胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE參照Matmaroh[10]等人的方法。膠原蛋白分離采用8%的SDS/聚丙烯酰胺凝膠、Tris-HCl/甘氨酸電泳緩沖系統。膠原蛋白溶于去離子水(1 mg/mL)后,與上樣緩沖液(0.5 mol/L Tris-HCl,4%SDS,20%甘油,含或不含10%DTT,pH6.8)以1∶1(V/V)混合,沸水浴5 min。樣品冷卻后,加入4%聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠)梳孔,冰浴電泳120 V。電泳結束后,凝膠用0.05%考馬斯亮藍R-250染色,用含15%甲醇和10%乙酸的脫色液脫去背景色。

1.5傅里葉紅外光譜分析

在干燥的條件下,取凍干的膠原蛋白樣品,把樣品放置在ATR臺上,紅外光譜儀對樣品進行紅外掃描。單點反射ATR附件,設置光譜分辨率4 cm-1,測量范圍4000～650 cm-1,掃描信號累加16次。

1.6數據處理

用Design-expert V8.0.6軟件進行數據分析。

2　結果與分析

2.1基本成分分析

草魚皮基本組分含量見表2,所測數據均是占魚皮濕重的比例。由表2可知,草魚皮中蛋白含量較高,但仍含有部分粗脂肪,所以在提取草魚皮膠原蛋白前首先進行脫脂預處理,以獲得高提取率和較高純度的膠原蛋白。

表2　草魚魚皮的基本成分

2.2單因素實驗結果及分析

2.2.1超聲功率對膠原蛋白提取率的影響圖1所示,膠原蛋白的提取率隨超聲功率的增加先升高后緩慢下降,且在300 W時提取率達到最高,超過300 W后膠原提取率逐漸下降,超聲作用過程中在樣品周圍進行降溫處理,但圖1顯示超聲波功率過大后產生的高溫對膠原蛋白會有一定作用,這跟水產品膠原蛋白變性溫度一般都比較低有關,超過300 W后超聲波能量過大產生高溫,對膠原蛋白的結構造成破壞,為獲得最高提取率實驗選擇單因素超聲功率為300 W。

圖1　超聲功率對提取率的影響Fig.1　Effects of ultrasonic rate on extraction of collagen

2.2.2超聲時間對膠原蛋白提取率的影響圖2顯示,膠原蛋白的提取率隨超聲時間延長先升高后下降,在超聲10 min時達到最大值,說明此時樣品細胞基本完全破裂,樣品與試劑充分結合,超聲波作用達最大值。超聲時間超過10 min后,超聲波空化效應產生的熱量對膠原蛋白造成破壞,膠原蛋白的提取率反而下降,說明超聲波的熱效應相對魚皮膠原蛋白作用明顯,應注意控制超聲波時間,實驗選定時間為10 min。

圖2　超聲時間對提取率的影響Fig.2　Effects of ultrasonic time on extraction of collagen

2.2.3酶解時間對膠原蛋白提取率的影響由圖3可知,超聲處理后的魚皮膠原蛋白隨酶解時間的變化較大,在25 h之前隨時間延長,膠原蛋白提取率升高的相對明顯,酶解時間達到25 h之后,膠原蛋白提取率變化趨于平緩,這說明在酶解時間25 h之前,膠原蛋白與胃蛋白酶的反應并不完全,25 h后趨于飽和,為提高提取效率故選取酶解時間為25 h。

圖3　酶解時間對提取率的影響Fig.3　Effects of enzyme time on extraction of collagen

2.3響應面實驗結果與優化

在單因素實驗的基礎上,以膠原蛋白提取率為響應值,利用Design Expert 8.0.6設計實驗,實驗結果如表3。

表3　實驗方案的設計及結果

根據表3中的數據使用Design-Expert軟件進行多元回歸擬合分析,得到模型的擬合曲線方程:Y=66.87+1.13X1+2.42X2+4.31X3+0.34X1X2-0.86X1X3-2.51X2X3-2.42X12-3.36X22-2.46X32。

同時對模型進行了回歸系數和方差分析的顯著性檢驗,分析和檢驗結果見表4。

表4　回歸模型的方差分析及系數的顯著性檢驗

注:p<0.05,差異顯著,*;p<0.01,差異極顯著,**。

根據表4方差分析數據顯示,該模型p=0.0002,小于0.01,表現為該模型的回歸方程極顯著。失擬項p>0.05,不顯著,表明實驗誤差較小,此模型對本實驗擬合較好。表4中還顯示了各因素對草魚皮中膠原蛋白提取率影響的主次順序為:X3>X2>X1,即酶解時間>超聲時間>超聲功率。單因素一次項X1、X2對實驗結果影響顯著,一次項X3和二次項X12、X22、X32對實驗結果影響極顯著,各因素交互項中X2X3極顯著,X1X2、X1X3不顯著,即超聲時間與酶解時間的交互作用對提取率的影響極顯著,超聲功率和酶解時間、超聲功率和超聲時間交互作用不顯著。

比較圖4～圖6響應曲面圖,通過曲面坡度的陡峭度及等高線的形狀可以較直觀的反映兩因素交互作用程度。圖6中響應面坡度較陡,說明酶解時間和超聲時間的交互作用較強,當條件變化時響應面值差異較大。故由圖4～圖6可知,酶解時間和超聲時間的交互作用顯著,超聲功率和酶解時間、超聲功率和超聲時間交互作用不顯著,這與方差分析結果一致。

圖4　超聲時間和超聲功率交互作用Fig.4　Effects of ultrasonic time and ultrasonic rate on extraction of collagen

圖5　酶解時間和超聲功率交互作用Fig.5　Effects of enzyme time and ultrasonic rate on extraction of collagen

圖6　酶解時間和超聲時間交互作用Fig.6　Effects of enzyme time and ultrasonic time on extraction of collagen

通過響應面法優化,酶法提取得到草魚皮膠原蛋白最優可操作的工藝條件:超聲功率312.97 W,超聲時間10.29 min,酶解時間29.12 h,此時膠原蛋白提取率理論值為68.80%。考慮到實際生產中的需要,上述工藝條件進行略微調整,最終確定實際最優的提取工藝:超聲功率310 W,超聲時間10 min,酶解時間29 h,并在此最優條件下對其進行3次驗證實驗,以考察模型的可靠性,結果表明:在實際的最優工藝條件下,超聲波輔助提取下的膠原蛋白提取率達到68.67%,實際操作中的數值與實驗設計中的理論數值(68.80%)相對誤差僅為0.189%,其結果較為接近,提取工藝得到合理優化。

2.4凝膠電泳

超聲波輔助提取與未經超聲波處理所得的膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖7所示,所得膠原蛋白與標準Ⅰ型膠原蛋白條帶基本一致,均存在兩條不同的α鏈,是由α1和α2組成,其中從光密度來看α1和α2的比率為2∶1,因此膠原蛋白的組成應該為(α1)2α2，這種結構符合真骨魚膠原含有兩條[11-12]或者三條[13]不同的鏈,根據與Marker對比,可以確定為Ⅰ型膠原蛋白,圖中另一條帶為β,是兩條肽鏈的二聚體,符合魚皮Ⅰ型膠原結構,且圖中電泳條帶清晰無雜帶出現,說明超聲波輔助酶法提取膠原蛋白純度較高。總之,圖中2、3和4、5條帶對比發現,相同濃度樣品經超聲波處理和未經超聲波處理所得條帶位置和條帶密度均大致相同,表明超聲波輔助提取沒有破壞膠原蛋白的結構。

圖7　PSC SDS-PAGE圖Fig.7　SDS-PAGE patterns of PSC from grass carp skin注:1-高分子蛋白Marker;2、3-未經過超聲波處理所得PSC(2、3分別為1、0.5 mg/mL);4、5-經超聲波處理所得PSC(4、5分別為1、0.5 mg/mL)。

2.5傅里葉紅外光譜

如圖8所示,圖中兩條分別為經超聲波處理和未經超聲波處理的膠原的紅外光譜圖,兩個樣品都含有酰胺A、B和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ吸收峰,均為膠原蛋白的特征吸收峰,且圖中各吸收峰位置相差不大,說明在提取膠原蛋白過程中有無超聲波作用不會對膠原蛋白的結構產生影響。其中酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ經常被作為鑒定膠原二級結構的特征峰,可以反映膠原的肽鏈骨架結構[14],膠原蛋白的酰胺I出現在1629 cm-1,表示了C=O的伸縮振動[15],該峰和蛋白質的二級結構有關,膠原蛋白的酰胺Ⅱ出現在1546 cm-1處,這是由N-H的彎曲振動和C-N的伸縮振動引起的,有研究證明,圖中顯示的酶溶性膠原蛋白(PSC)的酰胺在1236 cm-1處,該波數同1450 cm-1的比值大約為1,表明了三級螺旋結構的存在[16],由此證明超聲波輔助提取同無超聲波輔助的酶法提取一樣,不會破壞膠原蛋白的三級螺旋結構。

圖8　PSC傅里葉紅外吸收光譜Fig.8　FTIR spectra of PSC from grass carp skin注:1-未經過超聲波處理所得PSC紅外光譜;2-經超聲波處理所得PSC紅外光譜。

3　結論

本實驗研究分析了超聲波輔助法提取膠原蛋白具體條件,通過響應面設計實驗并分析獲得最佳工藝參數:超聲波功率310 W,超聲波時間10 min,酶解時間29 h,此條件下膠原蛋白提取率為68.67%。實驗還通過對比經超聲波處理和未經超聲波處理下酶法提取得到的膠原蛋白的理化性質,分別由凝膠電泳圖譜和傅里葉紅外光譜確定超聲波處理不會對膠原蛋白的結構造成影響。總之,響應面法設計實驗獲得了超聲波輔助法下提取草魚皮膠原蛋白提取率達到68.67%,大大提高了膠原蛋白提取率，優于傳統的酶提法,超聲波處理下的膠原蛋白仍然具有完整的三級螺旋結構,這為超聲波在膠原蛋白的提取工藝中的應用提供了有力的理論支持,為膠原蛋白的工業化生產提供了理論依據,以及更好地利用資源做出貢獻。

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Study on ultrasonic-assisted solvent extraction and purification of pepsin-soluble collagen from grass carp skin

WANG Jin-mei,BAO Jian-qiang*

(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Ultrasonic-assisted solvent extraction and purification pepsin-soluble collagen from grass carp skin was investigated in this paper.Ultrasonic rate,ultrasonic time and enzyme extraction time were chosen as influencing factors.The extraction rate of collagen was selected as response value.The mathematical model was established by Box-Behnken central composite design. The analysis method was response surface methodology(RSM).The final optimum conditions were:ultrasonic rate 310 W,ultrasonic time 10 min and enzyme extraction time 29 h,extraction rate of collagen was 68.67%,it’s nearly to the model 68.8%,relative tolerance was 0.189%.SDS-PAGE and FTIR showed that ultrasonic-assisted extraction hadno obvious effect on collagen structure.

ultrasonic-assisted extraction;grass carp skin;collagen;SDS-PAGE;FTIR

2016-03-11

王金梅(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學,E-mail:wjmytu@163.com。

包建強(1963-),男,教授,研究方向:食品冷凍,E-mail:baojq@shou.edu.cn。

水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心(ZF1206);上海市科委工程中心建設(11DZ2280300)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)18-0236-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.036