冰島刺參膠原蛋白多肽對PC12細胞氧化損傷的保護作用

趙　芹,林　棟,劉海梅

(1.魯東大學食品工程學院,山東煙臺 264025;2.濱州醫學院藥學院,山東煙臺 264003)

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冰島刺參膠原蛋白多肽對PC12細胞氧化損傷的保護作用

趙芹1,林棟2,劉海梅1

(1.魯東大學食品工程學院,山東煙臺 264025;2.濱州醫學院藥學院,山東煙臺 264003)

目的:研究不同分子量范圍的冰島刺參膠原蛋白多肽C1(6 ku

冰島刺參,膠原蛋白多肽,PC12細胞,活性氨基酸,抗氧化

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種老年高發的漸進性神經退行性疾病,其發病機制與氧化應激及其引起的相關損傷密切相關[1]。近年來,尋找具有抗氧化活性的天然生物活性物質用于保護神經細胞免受氧化損傷備受關注。

海參是一種藥食同源的海洋棘皮動物,因富含海參膠原蛋白、皂苷、多糖、腦苷脂等活性物質而具有很高的食用及藥用價值。在海參體壁的活性物質中蛋白質(多肽)含量最高,可達干品比重的90%[2]。采用蛋白酶酶解海參體壁制備得到的水解產物,已被證明具有保護內皮細胞[3]、抑制ACE酶活性[4]、減少黑色素生成[5]、提高記憶力和抗疲勞[6]等生理活性,其顯著的抗氧化活性[7-8]更是引起廣泛的關注。

冰島刺參(Cucumariafrondosa)主產于大西洋北部,其口感較差,食用價值低,研究并利用其體內的生物活性成分,可有效利用低值海參資源,提高其經濟價值。目前對于冰島刺參的研究主要集中在整參以及海參巖藻聚糖硫酸酯和巖藻糖基化硫酸軟骨素的生物活性研究[9-11],對其膠原蛋白多肽的生物學活性及作用機制則鮮有報道。本實驗采用酶解法和膜分離技術制備不同分子量段的冰島刺參(C.frondosa)膠原蛋白多肽,采用H2O2誘導PCl2細胞建立氧化應激損傷神經元的模型,比較不同分子量范圍的冰島刺參膠原蛋白多肽對神經細胞的保護作用,為推動低值海參生物活性物質的合理開發利用,深入挖掘海參膠原蛋白多肽的藥用功能提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

干品冰島刺參(C.frondosa)市售,由中國科學院海洋研究所廖玉麟研究員對樣品進行種屬鑒定;復合風味酶活力500 LAPU/g,Novo Nordisk公司;PC12細胞株中國科學院上海生化與細胞研究所;高糖DMEM培養基、胎牛血清美國Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)美國Amresco公司;乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒南京建成生物工程研究所;ROS試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒海門市碧云天生物技術研究所。

835-50型氨基酸自動分析儀、F-2500型熒光分光光度計日本HITACHI公司;TS-100型倒置生物顯微鏡日本Nikon公司;680型酶標儀美國BIO-RAD公司。

1.2實驗方法

1.2.1膠原蛋白多肽的制備參照文獻[5],采用乙醇連續浸提脫除皂苷等小分子物質后,以復合風味酶在最適反應條件下酶解4 h(酶與底物比為1∶4、pH6.5、溫度45 ℃)。采用截留分子量為6 ku和10 ku的超濾膜處理,得到不同分子量的酶解液。于40 ℃旋蒸濃縮,真空凍干,分別得粉末狀冰島刺參膠原蛋白多肽C1(6 ku

1.2.2細胞培養用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內培養PC12細胞,每2 d以0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.3對正常細胞PC12細胞增殖率的影響收集對數生長期的PC12細胞,調整密度至2×104個/mL,以200 μL/孔接種于96孔培養板。培養24 h后,分別加入C1或C2處理,濃度設置為12.5、25、50、100 μg/mL,正常對照組不加樣品,每組4個復孔,培養時間為24、48和72 h。采用MTT法[12]測定吸光度OD570值,按以下公式計算各組細胞增殖率。

1.2.4對H2O2損傷PC12細胞存活率的影響收集對數生長期的PC12細胞,調整密度至1×105個/mL,以100 μL/孔接種于96孔培養板。培養24 h后,加入C1和C2預處理12 h,濃度設置為6.25、12.5、25、50和100 μg/mL,正常對照組和模型對照組不加樣品,每組4個復孔。隨后換液、洗滌,除正常對照組外,各組分別加入含有H2O2(80 μmol/L)的無血清DMEM培養基孵育4 h。以MTT法測定吸光度OD570值,細胞增殖率的計算同1.2.3。

1.2.5細胞內活性氧(ROS)水平測定收集對數生長期的PC12細胞,調整密度至5×105個/mL,以2 mL/孔接種于6孔培養板。分別加入C1和C2預處理12 h,樣品的濃度為50、100 μg/mL。隨后換液、洗滌,加入200 μmol/L的H2O2(預實驗確定6孔板內此濃度下細胞的存活率在60%左右)處理4 h,收集細胞。參照試劑盒說明,加入DCFH-DA(10 μmol/L)探針孵育20 min,以無血清培養基洗滌細胞3次。細胞內熒光強度用熒光分光光度計測定,激發波長為488 nm,發射波長為521 nm,以細胞懸液的平均熒光強度表示細胞總的ROS水平。

1.2.6LDH釋放量、細胞內MDA含量和抗氧化酶活性的測定細胞處理及培養條件同1.2.5,樣品的濃度為25、50和100 μg/mL。實驗結束時收集培養上清液和細胞,按照試劑盒說明,分別以比色法測定上清液中LDH釋放量,TBA法測定細胞內MDA含量、羥胺法測定PC12細胞內SOD活力,比色法測定細胞內GSH-Px活性,鉬酸銨比色法測定CAT活性。細胞蛋白濃度以Folin-酚法[13]測定。

1.2.7Caspase-3的酶活性的測定細胞分組、處理及培養條件同1.2.6,實驗結束時收集細胞,加裂解液,冰浴中裂解15 min。于4 ℃,20000×g離心10 min。取上清,按照試劑盒說明,加入底物Ac-DEVD-pNA,測定Caspase-3的酶活性。細胞蛋白濃度以Bradford法[13]測定。

1.2.8氨基酸組成分析采用鹽酸水解法[14]分別處理冰島刺參膠原蛋白多肽C1和C2后,使用氨基酸自動分析儀測定其主要氨基酸含量。

1.2.9統計學處理數據為至少4次的平行數據結果,以平均數±標準差表示,采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析,同時采用LDS法進行兩兩比較,采用SNK法進行組間比較,以p<0.05為差異有顯著性,p<0.01為差異極顯著。

2　結果與分析

2.1對正常PC12細胞增殖活力的影響

PC12細胞株源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤,該細胞株可高分化為交感神經樣細胞,且同時具有神經分泌細胞和神經元的性質,已被廣泛用于神經細胞保護活性的研究[15]。由圖1可見,冰島刺參膠原蛋白多肽C1和C2對PC12細胞的生長無顯著性影響(p>0.05),表明不同分子量冰島刺參膠原蛋白多肽對神經細胞無細胞毒作用。

圖1　C1和C2對PC12細胞增殖的影響Fig.1　Effects of C1 and C2 on PC12 cells proliferation rates

2.2對H2O2損傷PC12細胞存活率的影響

H2O2作為重要的ROS成分之一,在細胞培養體系中可分解羥基自由基(·OH),引起神經細胞的氧化應激損傷。由圖2可見,H2O2(80 μmol/L)能極顯著性地抑制PC12細胞生長(p<0.01),與正常對照組比較,其增殖率下降為67.61%。采用C1和C2預處理細胞后,當劑量大于50 μg/mL時,PC12細胞的增殖活性均極顯著地提高(p<0.01),且呈現出明顯的劑量-效應關系。其中,冰島刺參C2組最低起效濃度為12.5 μg/mL,低于C1組(25 μg/mL),其余各劑量組效果相當。董玉婷[16]等研究了鱈魚皮膠原蛋白多肽對小鼠B16黑素瘤細胞的作用,實驗結果顯示,不同分子量的超濾組分對細胞的生長均有促進作用,并且分子量段越小的組分,最低有效濃度越小。以上結果表明,多肽的吸收速率與其分子量相關,C2組分子量小,因此更易進入細胞發揮其生理功能。

圖2　C1和C2對H2O2損傷PC12細胞的保護作用Fig.2　Protective effects of C1and C2on PC12 cells injury induced by H2O2注:與模型對照組比較,*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

2.3對H2O2損傷PC12細胞內ROS水平的影響

圖3　C1和C2對H2O2損傷PC12細胞內ROS的影響Fig.3　Effects of C1 and C2 on intracellular ROS in PC12 cells injured by H2O2注:與正常對照組比較,##表示差異極顯著(p<0.01);與模型對照組比較,*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01)。

2.4對H2O2損傷PC12細胞LDH釋放量和MDA含量的影響

為了進一步評價冰島刺參膠原蛋白多肽對自由基損傷神經細胞的保護作用,進一步測定了細胞LDH的釋放量和MDA含量。經H2O2損傷后,PC12細胞的膜結構及完整性被破壞,細胞內酶LDH大量釋放,培養上清中LDH含量為正常組的1.96倍(表1)。與模型對照組相比,經冰島刺參膠原蛋白多肽預處理后,C1和C2各劑量組LDH釋放量平均降低了26.31%(p<0.01)和32.26%(p<0.01),呈現出了顯著和極顯著保護作用,其中C2各劑量組的效果均優于C1。實驗結果表明,不同分子量的冰島刺參膠原蛋白多肽均能有效減少H2O2對細胞的損傷,降低LDH的釋放量,維持細胞膜結構及其完整性。MDA是脂質過氧化的最終產物,可直接反映機體內自由基含量的變化和受自由基攻擊的程度。由表1可見,經C1和C2預處理后,細胞內的MDA含量呈劑量依賴性下降,其中高劑量組MDA含量分別下降了37.10%和46.29%。

表2　C1和C2對H2O2損傷PC12細胞抗氧化酶活性的影響

凌玉芳等[19]研究了乳清蛋白酶解物對PC12細胞氧化損傷防護作用的體外研究,結果發現,乳清蛋白酶解產物對H2O2誘導氧化損傷的PC12細胞具有顯著的防護作用。其中樣品組MDA顯著低于模型組,與本實驗結果一致,說明兩種多肽均可顯著抑制ROS引發的脂質過氧化反應,有效減少脂質過氧化產物的產生。但是與本實驗結果不同的是乳清蛋白酶解產物對LDH水平的影響不顯著,原因可能樣品處理細胞的方式不同。本實驗中細胞是經過樣品預處理12 h后再進行H2O2損傷,而非兩者同時作用于細胞。因此,C1和C2可預防性的改善細胞內的氧化還原水平,從而可以更好的抵御H2O2對細胞膜的損傷,減少細胞內酶的外漏。

表1　C1和C2對H2O2損傷PC12細胞LDH和MDA的影響

注:與正常對照組比較,##表示差異極顯著(p<0.01);與模型對照組比較,*表示差異顯著(p<0.05),**表示差異極顯著(p<0.01);表2、圖4同。

2.5對H2O2損傷PC12細胞內抗氧化酶的影響

王奕等[22]研究發現日本刺參膠原蛋白多肽可顯著提高光老化模型小鼠血清和皮膚中SOD、GSH-Px和CAT活性。林琳[23]等研究證實,魷魚皮膠原蛋白多肽具有抗氧化活性,對羥自由基和超氧陰離子具有較好的清除效果,并可提高動物體內SOD、GSH-PX活力,降低丙二醛MDA含量。與其結果類似,本實驗中,C1和C2均可顯著提高H2O2誘導損傷的神經細胞中SOD、CAT和GSH-Px的活性,提示冰島刺參膠原蛋白多肽不僅可通過清除ROS減少神經細胞氧化損傷,還可以通過提高自身抗氧化酶活性,增強細胞抵御氧化應激損傷的能力來保護神經細胞。

2.6對H2O2損傷PC12細胞中Caspase-3酶活性的影響

Caspase-3是細胞凋亡程序中的終末執行酶,可剪切procaspase-3、6、7和9,以及許多Caspase底物如PARP,促進細胞骨架降解和DNA片段化,最終導致細胞凋亡[24]。有研究報道,線粒體內ROS的累積會直接或間接損傷線粒體膜,造成線粒體膜電位下降,線粒體膜間腔內細胞色素C釋放入胞漿,從而激活Caspase-3[25]。如圖4所示,與正常對照組相比,H2O2誘導后PC12細胞的Caspase-3酶活性較正常對照組極顯著上升(p<0.01)。凌玉芳[19]研究發現,乳清蛋白酶解物對H2O2誘導損傷細胞的凋亡有抑制作用,可以降低H2O2引起的Caspase-3酶活性的提高。本實驗中,采用不同濃度的C1和C2預保護后,Caspase-3酶活性較模型對照組均顯著降低(p<0.05),各劑量組平均酶活分別下降了20.84%和36.17%。經SNK分析,C2抑制Caspase-3酶活性升高的效果優于C1。表明冰島刺參膠原蛋白多肽在細胞內通過減少細胞內ROS的累積,保護細胞內膜結構完整性,阻止了細胞凋亡關鍵酶Caspase-3的激活。

圖4　C1和C2對H2O2損傷PC12細胞Caspase-3酶活性的影響Fig.4　Effects of C1 and C2 on Caspase-3 activity in PC12 cells injured by H2O2

2.7冰島刺參膠原蛋白多肽的主要氨基酸組成

由于特殊的生態環境,海洋生物富含結構新穎、功能獨特的高生物活性藥用成分。與陸生膠原肽相比,海洋膠原蛋白肽也具有許多獨特的生理功能和理化性質[26]。大量研究表明,海洋膠原蛋白多肽具有廣泛的抗氧化活性,且其抗氧化活性與肽鏈的氨基酸組成和氨基酸的性質(酸性氨基酸、疏水性、親水性及芳香族氨基酸的含量和種類)等因素相關[22-23,27]。有研究證明,疏水性氨基酸的多肽可通過抑制脂質中氫的釋放或與氧結合,減緩脂質過氧化反應進程,進而保護脂質體系與膜質完整性[28]。除疏水性氨基酸外,酸性氨基酸的側鏈氨基及羧基基團可與金屬離子螯合,并減弱其引發的一系列自由基鏈式反應,從而達到抗氧化效果[29]。

由表3可見,冰島刺參膠原蛋白多肽C1和C2中抗氧化氨基酸含量均十分豐富,尤其是還原性氨基酸總量上,C1和C2的含量分別高達52.87 mg/100 mg和57.66 mg/100 mg,顯著高于崔鳳霞[18]報道的仿刺參(A.japonicus)膠原肽(47.69%)、墨西哥刺參(I.fuscus)膠原肽(48.91%)和菲律賓刺參(P.graeffei)膠原肽(25.46%)。在疏水性氨基酸和酸性氨基酸方面,C2的含量分別為33.38%和28.79%,均高于C1。彭新顏[27]等研究發現,經超濾后分子量在1～4 ku的藍點馬鮫魚皮抗氧化肽段·OH清除率高達55.1%,顯著優于超濾前水解物。與其報道類似,本實驗中分子量<6 ku的C2具有更好的抗氧化活性,提示低分子量段的冰島刺參膠原蛋白多肽在保護神經細胞活性方面效果更佳,可能與其肽鏈結構以及氨基酸組成相關。

表3　冰島刺參膠原蛋白多肽的主要活性氨基酸組成

注:a:還原性氨基酸;b:疏水性氨基酸;c:酸性氨基酸。

3　結論

本實驗研究發現,不同分子量的冰島刺參膠原蛋白肽均可顯著降低細胞內氧化應激水平,并可以通過提高自身抗氧化酶活性和抑制凋亡因子Caspase-3激活兩條途徑來保護受損的神經細胞。低分子量段的膠原蛋白肽抗氧化活性更優,可能與其肽鏈結構和氨基酸組成相關。本研究為海參膠原蛋白多肽在治療阿爾茲海默病中的應用提供了理論依據,同時也為低值海參的深加工及高值化利用提供了新的思路。

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Protective effects of collagen polypeptides fromCucumariafrondosaon oxidative damage in PC12 cells

ZHAO Qin1,LIN Dong2,LIU Hai-mei1

(1.School of Food Engineering,Ludong University,Yantai 264025,China;2.School of Pharmacy,Binzhou Medical University,Yantai 264003,China)

Objective:To investigate the protective effects of collagen polypeptides with different molecular weights fromCucumariafrondosaon neural cells damaged by oxidative stress. Methods:Well-differentiated PC12 cells had been culturedinvitro,to establish an oxidative damage model of neural cells by hydrogen peroxide(H2O2). PC12 cells were pretreated with different concentrations of C1and C2,accordance with the final concentration 0,12.5,25,50,100 μg/mL. The viability of the cells was measured by MTT method. Cells were then divided into the control group,damage group(H2O2)and collagen polypeptides protection groups(collagen polypeptides+H2O2). The reactive oxygen species(ROS),the content of MDA,the outleakage of lactic dehydrogenase(LDH),the activities of antioxidase and Caspase-3 in PC12 cells were measured by corresponding kits. Results:When the dose was higer than 50 μg/mL,C1and C2could promote the growth of PC12 injured by H2O2observably(p<0.01). The level of intracellular ROS of high dose group cells were decreased significantly(p<0.05). The LDH release,the content of MDA of middle and high dose group cells were decreased significantly(p<0.01). The activities of SOD,GSH-Px and CAT of middle and high dose group cells were stimulated remarkably(p<0.05). The activity of apoptosis factor Caspase-3 was decreased significantly(p<0.05).Conclusion:Collagen polypeptides fromCucumariafrondosacould play a neuroprotective role in PC12 cells oxidative damaged by H2O2. The more significant effect of the collagen polypeptides with low molecular weight correlated to their amino acids composition in all probability.

Cucumariafrondosa;collagen polypeptides;PC12 cells;active amino acid;antioxidant

2016-04-11

趙芹(1983-)，女，博士，講師，研究方向：海洋生物活性物質，E-mail:candyffff@163.com。

山東省自然基金(ZR2015PC002,ZR2014BP016)；魯東大學人才引進基金(LY2012011)。

TS284

A

1002-0306(2016)18-0354-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.059