頂空固相微萃取-氣相色譜法測定山楂果膠酯化度

王榮芳,楊曉博,陳劍橋,李喜悅,崔　同

(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000)

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頂空固相微萃取-氣相色譜法測定山楂果膠酯化度

王榮芳,楊曉博,陳劍橋,李喜悅,崔同*

(河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000)

利用頂空固相微萃取與氣相色譜聯用(HS-SPME-GC)的方法測定山楂果膠的酯化度(包括甲酯化和乙酯化),對影響檢測結果的萃取頭種類、萃取溫度、平衡時間、萃取時間、鹽離子濃度、解吸溫度、解吸時間進行了優化。結果表明,HS-SPME-GC測定山楂果膠酯化度較優條件為:5 mL山楂果膠溶液中加48.8%硫酸鈉,在40 ℃下平衡20 min,用75 μm CAR-PDMS萃取頭在40 ℃下萃取30 min,然后在280 ℃的GC進樣口解析60 s。該方法線性良好r≥0.9983,檢出限10～15 mg/L,加標回收率為95.6%～116.2%。該方法快速、簡便、準確。

山楂果膠,酯化度,頂空固相微萃取,氣相色譜

山楂(CrataequspinnatifidaBge)屬于薔薇科山楂屬植物,是我國北方地區重要的栽培水果,其果實中有豐富的果膠,含量約為鮮重的4%[1]。果膠具有凝膠性、增稠性、乳化性、穩定性等功能特性,被廣泛地用于食品、藥品、化妝品領域中。它的這些理化性質直接取決于其化學結構,尤其是其α-1,4半乳糖醛酸結構單元的酯化度是影響果膠凝膠特性的主要因素[2-3]。因此,評價果膠的膠凝特性,必須準確測定果膠酯化度[4]。測定果膠酯化度的方法可以分為直接測定法和脫酯后測定法,直接測定法主要采用圖譜分析技術,如NMR法[5]、FT-IR法[6-7],這些方法操作簡便但需要精密儀器,而且有時會受共存雜質的干擾。脫酯后測定法是針對果膠皂化反應后釋放出的羧基或者甲醇進行分析,包括堿液滴定法[8-9]、醇氧化法[10]、毛細管電泳法[11]、硼氫化法[12]。頂空固相微萃取(HS-SPME)是一種集采樣,萃取,濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品微萃取新技術[13],具有操作時間短、樣品用量少、儀器設備簡單,操作快速、便攜,重現性好、精度高、檢測限低等優點,是一種較理想的氣相色譜(GC)的樣品前處理技術。

本實驗采取頂空固相微萃取與GC結合,探索建立一種可以同時測定山楂果膠甲酯化和乙酯化程度的方法,為山楂果膠改性及其功能評價提供一種方便、快捷的新方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

山楂品種為大金星,購于河北省保定市果品批發市場;甲醇(色譜純)Honeywell Burdick & Jackson公司;乙醇(分析純)、NaCl(純度99.5%)、Na2SO4(純度99.5%)天津天力化學試劑有限公司;純凈水哇哈哈食品飲料有限公司。

6820型氣相色譜儀美國Agilent 公司;SGH-300型高純氫發生器、SGK-2LB型低噪音空氣泵北京東方精華苑科技有限公司生產;固相微萃取裝置Supelco公司生產,固相微萃取纖維頭:50/30 μm DVB/CAR/PDMS型、75 μm CAR/PDMS型和100 μm PDMS型;RJ-TDL-40B型離心機無錫市瑞江分析儀器有限公司;KQ5200DE型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司生產;FD-1B-50型冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司生產;HH-2型恒溫水浴鍋國華電器有限公司生產。

1.2實驗方法

1.2.1山楂果膠的制備按照專利方法[14]從山楂果實中制備得到山楂膳食纖維。參考王娜等[15]的方法從山楂膳食纖維中提取山楂果膠:山楂膳食纖維中加入20倍體積蒸餾水,95 ℃熱水攪拌提取,經離心(4000 r/min,3 min),收集上清液,重復4次上述過程,再將收集的上清液真空濃縮至原體積的1/3,加入2倍體積的95%乙醇沉淀果膠,離心(4000 r/min,3 min)得到果膠沉淀,加2倍體積的丙酮洗果膠沉淀,再加入2倍體積的蒸餾水溶解果膠沉淀,真空濃縮至原來的1/3,最后將濃縮的果膠溶液冷凍干燥,得到薄片狀固體山楂果膠,置于干燥器中備用。

1.2.2萃取頭的處理萃取頭每次使用前均進行活化。將萃取頭Hub端接入手柄后插入GC進樣口進行活化,活化條件分別為:50/30 μm DVB/CAR/PDMS為270 ℃,1 h;75 μm CAR/PDMS為300 ℃,1 h;100 μm PDMS為250 ℃,0.5 h。同時監測系統壓力,防止漏氣。

1.2.3樣品前處理準確稱取0.200 g冷凍干燥的山楂果膠,加入20 mL純凈水,使之完全溶解,用1 mL 1 mol/L的NaOH溶液調pH至13,室溫下皂化30 min,再用1 mL 1 mol/L HCl溶液調果膠溶液pH至7。

1.2.4頂空固相微萃取條件取皂化的果膠溶液注入含有Na2SO4的頂空瓶中,隔墊密封,在60 ℃下超聲30 min使Na2SO4溶解,取出后渦旋混勻,在水浴中平衡一定時間,將SPME萃取頭插入頂空瓶中萃取一定時間,立即將萃取頭在GC進樣口解析,進行GC分析。每份樣品重復3次。

1.2.5單因素實驗

1.2.5.1萃取頭種類的選擇在平衡時間為20 min,萃取溫度為40 ℃,萃取時間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸時間為60 s,解吸溫度為280 ℃時,考察了50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 3種萃取頭的萃取對萃取效果的影響。

1.2.5.2萃取溫度對萃取效果的影響當果膠溶液中的甲醇和乙醇在氣-液兩相達到平衡時,它們在氣相中濃度的高低受很多因素的影響,而萃取的溫度是一個很重要的因素。本實驗在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,平衡時間為20 min,萃取時間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸時間為60 s,解吸溫度為280 ℃時,考察了不同萃取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對HS-SPME-GC萃取效果的影響。

1.2.5.3平衡時間對萃取效果的影響在一定的溫度下,被分析組分在氣-液兩相達到平衡需要一定時間,本實驗在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,萃取時間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸時間為60 s,解吸溫度為280 ℃時,比較了不同平衡時間(10、20、30、40、50 min)對HS-SPME-GC萃取效果的影響。

1.2.5.4萃取時間對萃取效果的影響萃取時間即從萃取頭進入頂空瓶到萃取達到平衡的時間。這個時間由被分析組分的分配系數、物質的擴散速率、萃取頭的吸附能力等因素決定。本實驗在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,平衡時間為20 min,48.8% Na2SO4,解吸時間為60 s,解吸溫度為280 ℃時,比較了不同萃取時間(5、10、20、30、40 min)對HS-SPME-GC萃取效果的影響。

1.2.5.5鹽濃度對萃取效果的影響溶液中添加電解質,可增強溶液的離子強度,可以降低其在水中的溶解度,有利于促進目標成分揮發到氣相中而增加分析的靈敏度。當使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,平衡時間為20 min,萃取時間為30 min,解吸時間為60 s,解吸溫度為280 ℃時,比較了不同添加量的NaCl、Na2SO4對HS-SPME-GC固相萃取效果的影響。

1.2.5.6解吸溫度對萃取效果的影響GC進樣口的溫度即為解吸溫度,溫度過低解吸不完全或造成二次進樣;溫度過高會對SPME萃取頭涂層損害較大。而甲醇、乙醇都屬于易揮發性化合物,溫度不需要過高,因而,在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,平衡時間為20 min,萃取時間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸時間為60 s時,比較了不同解吸溫度(240、250、260、270、280、290、300 ℃)對HS-SPME-GC固相萃取效果的影響。

1.2.5.7解吸時間對萃取效果的影響解吸時間與待分析組分的解吸完全程度直接相關。在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,平衡時間為20 min,萃取時間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸溫度為280 ℃條件下,考察不同解吸時間(30、60、90、120 s)對解吸效果的影響

1.2.6色譜條件色譜柱:毛細管柱TG-WAXMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);檢測器:氫火焰離子化檢測器;載氣:高純氮,流速1 mL/min,分流比為1∶50。氣化室溫度:280 ℃;檢測器:300 ℃;升溫程序:35 ℃保持6 min,以20 ℃/min升至80 ℃;再以50 ℃/min升至230 ℃保持10 min。

1.2.7標準曲線制作精確稱取400 mg甲醇和100 mg乙醇,加水定容至100 mL,配制成4000 mg/L甲醇和1000 mg/L乙醇標準儲備溶液。貯備液密封保存,甲醇、乙醇標準溶液均由儲備液稀釋得到。

用甲醇標準儲備液稀釋得到濃度分別為2000、1000、400、200、100、20 mg/L的甲醇標準溶液,乙醇標準儲備液稀釋得到濃度分別為500、250、100、50、25、5 mg/L的乙醇標準溶液。按照1.2.4步驟頂空萃取,按照1.2.6色譜條件進行測定。分別以甲醇、乙醇標準液濃度為橫坐標(X,mg/L),以甲醇、乙醇峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線,求回歸方程。

1.3數據處理

使用Excel進行數據處理并作圖。

2　結果與分析

2.1頂空固相微萃取條件的優化

2.1.1萃取頭種類的選擇從50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 3種萃取頭的萃取結果分析表明,這3種萃取頭對甲醇、乙醇均有一定程度的萃取效果。其中,100 μm PDMS的萃取效果最差,得到甲醇、乙醇的峰面積均很小;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取得到的雜峰較多,在甲醇出峰位置有雜峰干擾;而75 μm CAR/PDMS萃取效果最佳,且雜峰較少,因此,選擇萃取頭75 μm CAR/PDMS。

2.1.2萃取溫度對萃取效果的影響結果如圖1所示。從圖1可以看出,當萃取溫度為40 ℃時,甲醇和乙醇的萃取量均達到最大,再繼續升高溫度時它們的萃取效果沒有明顯的變化。因此,選擇萃取溫度為40 ℃。

圖1　萃取溫度對萃取效果的影響Fig.1　Effect of extraction temperature on the extraction rate

2.1.3平衡時間對萃取效果的影響從圖2可以看出,當平衡時間少于20 min,萃取量增加,當平衡時間為20 min時,果膠溶液中甲醇和乙醇的萃取量達到最大。因此,選擇平衡時間為20 min。

圖2　平衡時間對萃取效果的影響Fig.2　Effect of balance time on the extraction rate

2.1.4萃取時間對萃取效果的影響從圖3可以看出,當萃取時間小于30 min時,甲醇和乙醇的萃取量都在增加,但是乙醇增加量大于甲醇;當萃取時間為30 min時,兩者的萃取量最大。因此,選擇萃取時間為30 min。

圖3　萃取時間對萃取效果的影響Fig.3　Effect of extraction time on the extraction rate

2.1.5鹽離子濃度對萃取效果的影響從圖4可以看出,雖然NaCl也有促進目標成分揮發的效果,但作用強度不及Na2SO4,當Na2SO4添加量達到飽和(48.8%)時,兩者萃取量均達到最大。因此選擇48.8% Na2SO4。

圖4　鹽濃度對萃取效果的影響Fig.4　Effect of salt concentration on the extraction rate

2.1.6解吸溫度對萃取效果的影響結果如圖5所示。從圖5可以看出,當溫度為280 ℃,甲醇、乙醇均完全解吸,因此,選擇解吸溫度為280 ℃。

圖5　解吸溫度對萃取效果的影響Fig.5　Effect of desorption temperature on the extraction rate

2.1.7解吸時間對萃取效果的影響從圖6可以看出,當時間為60 s時,甲醇、乙醇峰面積達到最大值,延長解吸時間峰面積不再增加,因此,選擇解吸時間為60 s。

圖6　解吸時間對萃取效果的影響Fig.6　Effect of desorption time on the extraction rate

2.2方法評價

2.2.1方法的精密度按照優化的固相微萃取條件進行萃取后,按1.2.6的色譜條件重復進樣分析(n=5),以評價檢測儀器的精密度。數據統計結果見表1。

表1　甲醇、乙醇的精密度分析(n=5)

2.2.2方法的回歸方程、線性范圍、最低檢出限按照1.2.7配制標準溶液標準曲線,按照1.2.6的色譜條件進行分析,以進樣濃度為自變量(X,mg/L),峰面積為因變量(Y),分別求出甲醇、乙醇的線性回歸方程、相關系數及線性范圍。最低檢出限以3倍信噪比(S/N)所對應的進樣濃度求得,結果見表2。

表2　對照品的回歸方程、相關系數、線性范圍及最低檢出限

2.2.3方法的加標回收實驗采用加標回收實驗以評價檢測方法的準確度。分別稱取已知質量的對照品分別按其在山楂果膠中常規含量水平加入山楂果膠樣品中,按照1.2.3所述樣品前處理,平行5份;按照優化的固相微萃取條件進行萃取后,按1.2.6色譜條件分別測定未加標和加標樣品,計算組分的加標回收率,結果見表3。

表3　甲醇、乙醇的回收率

2.2.4實際樣品分析按1.2.3所述方法重復進行山楂果膠樣品前處理(n=3),按照優化的固相微萃取條件進行萃取,按1.2.6的色譜條件進行含量分析,對照品和樣品色譜圖如圖7所示,酯化度分析結果見表4。

圖7　混合對照品(A)和山楂果膠樣品(B)的GC色譜圖Fig.7　GC chromatograms of references(A)and hawthorn pectin sample(B)注:1:甲醇,2:乙醇。

類型酯化度(%)甲酯化56.13±1.35乙酯化1.76±1.41

從圖7中可以看出,甲醇和乙醇達到很好的分離。而表4的結果表明,山楂果膠樣品的總酯化度(包括甲酯化和乙酯化)達到57.89%,屬于一種高甲氧基果膠,而其中的乙酯化度相對較低,僅有1.76%。

3　結論

通過對頂空固相微萃取條件進行優化,建立了一種HS-SPME-GC測定山楂果膠甲酯化和乙酯化的方法,較優條件為:75 μm CAR-PDMS萃取頭,萃取溫度40 ℃,平衡時間20 min,萃取時間30 min,加48.8%硫酸鈉,進樣解吸溫度280 ℃,解吸時間60 s。方法操作簡單,測定結果準確可靠,可為相關研究提供了新的檢測方法。

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Determination of the esterification degree of hawthorn pectin by headspace solid-phase microexrtaction and gas chromatography

WANG Rong-fang,YANG Xiao-bo,CHEN Jian-qiao,LI Xi-yue,CUI Tong*

(College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China)

Headspace solid-phase microextraction and gas chromatography(HS-SPME-GC)were used for the qualitative determination of the esterification degree(methyl esterification and ethyl esterification)of haw pectin samples. HS-SPME experimental conditions,such as the type of fibers,extraction temperature,balance time,extraction time,salt concentrations,desorption temperature,desorption time were optimized. The best HS-SPME-GC performance was achieved under the following conditions:5 mL pectin solution in headspace glass vial with addition of 48.8% Na2SO4,20 min balance time and 30 min extraction time at 40 ℃ using 75 μm CAR-PDMS fiber and 60 s desorption time in the GC inlet at 280 ℃. The correlation coefficient r was greater than 0.9983,the detection limits of the method were 10～15 mg/L,the recovery rates were 95.6%～116.2%. The proposed method is simple,fast and accurate with high reproducibility.

hawthorn pectin;esterification degree;headspace solid-phase microextraction;gas chromatography

2016-01-15

王榮芳(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：農產品加工及貯藏工程，E-mail：15131220593@163.com。

崔同(1956-)，男，教授，研究方向：天然產物活性成分分析，E-mail：cuitong98@aliyun.com。

河北省自然科學基金項目(C2015204187)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)16-0056-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.002