頂空固相微萃取-氣質聯用法測定奶茶中的香蘭素和乙基香蘭素

徐　幸,彭飛進,舒　平,狄家衛,趙浩軍,王　坤

(1.大理州質量技術監督綜合檢測中心,云南大理 671000;2.云南華測檢測認證有限公司,云南昆明 650217)

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頂空固相微萃取-氣質聯用法測定奶茶中的香蘭素和乙基香蘭素

徐幸1,彭飛進2,舒平1,狄家衛1,趙浩軍1,王坤1

(1.大理州質量技術監督綜合檢測中心,云南大理 671000;2.云南華測檢測認證有限公司,云南昆明 650217)

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜質譜聯用技術(GC/MS),建立了測定奶茶中香蘭素和乙基香蘭素的分析方法。選取了75 μm carboxen/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)萃取纖維,考察了萃取溫度、萃取時間和鹽濃度等因素對萃取效率的影響。采用3,4-亞甲二氧苯乙酮作為內標,對香蘭素和乙基香蘭素進行定量。結果表明,在檢測范圍0.5～25.0 μg內,該方法對香蘭素(R2=0.9974)和乙基香蘭素(R2=0.9987)具有良好的線性關系,固體樣品中香蘭素和乙基香蘭素的檢出限分別為0.5 mg/kg和0.3 mg/kg,液體樣品中檢出限分別為0.05 mg/kg和0.03 mg/kg,香蘭素的平均回收率為88.99%～105.15%,相對標準偏差(RSDs)為2.40%～9.26%,乙基香蘭素的平均回收率為91.57%～105.13%,相對標準偏差為2.35%～8.49%。該方法操作簡便、準確可靠,適合于奶茶中香蘭素和乙基香蘭素的分析要求。

香蘭素,乙基香蘭素,頂空固相微萃取-氣質聯用法(HS-SPME-GC/MS),奶茶

香蘭素(Vanillin),又名3-甲氧基-4-羥基苯甲醛,乙基香蘭素(Ethyl vanillin),又名3-乙氧基-4-羥基苯甲醛,香蘭素可從天然的香莢蘭或水果中提取[1-2],也可人工合成,是食品中重要的香味添加劑。但其安全性仍存在爭議,歐盟的研究曾報道,大量使用香蘭素對人體具有危害性[3],奶茶是添加奶味香精的主要產品,日常消費量較大,有企業標準化生產的速溶固體奶茶,也有個體零售自調比例的液體奶茶,建立檢測奶茶中香蘭素與乙基香蘭素的方法,既有利于生產企業對產品質量的控制,也利于監管部門對市場上零售的液體奶茶進行風險監測,保障食品安全。

目前食品中添加香蘭素和乙基香蘭素的產品主要涉及嬰幼兒配方奶粉、飲料、蛋糕、牛奶等,檢測方法包括液相色譜法[4-6]、液質聯用法[7-9]、毛細管電泳法[10]、氣相色譜法[11-12]和氣質聯用法等[13-15]。而前處理通常需富集凈化,要使用大量有機溶劑提取,對環境及檢驗人員的健康不利[16],為減少污染以及保護操作人員,近年來發展出新的前處理方法,即固相微萃取技術(solid phase micro extraction,SPME),來萃取香蘭素和乙基香蘭素[17-18]。然而采用SPME檢測時,由于頂空氣化效率不穩定,外標法定量會影響檢測結果的準確性,而添加與目標物性質類似的內標物,可保證定量的準確性。

本研究采用頂空固相微萃取和氣質聯用法,內標法定量,建立奶茶中香蘭素與乙基香蘭素的檢測方法,并對市售的固體和液體奶茶產品進行檢測,為生產企業對產品的質量控制,以及監管部門的風險監測,提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

速溶固體奶茶、液體奶茶市售;香蘭素標準品美國Sigma-Aldrich公司,純度≥99.0%;乙基香蘭素標準品美國Sigma-Aldrich公司,純度≥99.0%;3,4-亞甲二氧苯乙酮德國CNW公司,純度≥97.0%;無水乙醇德國Meker公司,色譜純;氯化鈉(NaCl)為國產分析純。

1.2實驗方法

1.2.1固相萃取條件的選擇萃取時間為60 min,不添加NaCl,先考察30、40、50、60、70、80 ℃作為萃取溫度,目標物峰面積隨萃取溫度變化的情況。萃取溫度設定為70 ℃,不添加NaCl,考察在10、20、30、40、50、60 min萃取時間下香蘭素與乙基香蘭素峰面積的變化。萃取溫度設定為70 ℃,萃取時間為30 min,研究每5 mL標準溶液中添加0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g NaCl添加量對萃取效果的影響。

1.2.2樣品處理固體樣品:稱取0.50 g奶茶粉末置于20 mL的頂空瓶中,加入5 mL溫度為40 ℃的超純水,振蕩溶解奶茶粉末,再加入50 μL的3,4-亞甲二氧苯乙酮標準儲備液(100 mg/L的無水乙醇溶液)作為內標,加入2.0 g NaCl溶于水中,設定樣品的預熱溫度為70 ℃。

液體樣品:稱取5.00 g奶茶溶液置于20 mL的頂空瓶中,加入50 μL的3,4-亞甲二氧苯乙酮標準儲備液(100 mg/L的無水乙醇溶液)作為內標,加入2.0 g NaCl溶于液體樣品中,設定樣品的預熱溫度為70 ℃。

1.2.3氣質聯用分析的條件在預熱溫度為70 ℃的條件下,采用75 μm CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶萃取30 min。萃取完成后,將萃取頭插入溫度為240 ℃的氣質聯用儀進樣口,解吸5 min。分別考察了三種不同極性的色譜柱對目標物的分離效果:J&W DB-WAX石英毛細柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、J&W DB-1701石英毛細柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、J&W DB-5MS石英毛細柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:70 ℃保持5 min,以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃,保持1 min;載氣(He)流速為1.2 mL/min;不分流進樣;質譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量為70 eV;傳輸線溫度240 ℃;離子源溫度180 ℃;阱溫為100 ℃;選擇離子存儲模式(SIS)掃描,特征離子及保留時間見表1。

表1　目標物的保留時間和特征離子

1.2.4香蘭素和乙基香蘭素含量的測定數據采集和后處理采用240離子阱質譜儀工作站軟件進行,分別以香蘭素和乙基香蘭素對3,4-亞甲二氧苯乙酮的峰面積比值作為縱坐標,檢測到的香蘭素和乙基香蘭素的含量作為橫坐標進行線性回歸,通過線性方程,計算出待測樣品中香蘭素和乙基香蘭素的含量。計算公式如下:CS=m1×1000/(m2×1000)

其中,m1為儀器檢測出的目標物的含量(μg),m2為樣品的質量(g),CS為樣品中目標物的質量濃度(mg/kg)。

（四）強化生態環境保護能力保障體系。增強科技支撐，開展大氣污染成因與治理、水體污染控制與治理、土壤污染防治等重點領域科技攻關，

1.2.5方法驗證配制香蘭素和乙基香蘭素的無水乙醇混合標準溶液,濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L,以1.0 mg/L 3,4-亞甲二氧苯乙酮無水乙醇溶液為內標物,建立校準曲線,按照三倍信噪比(S/N)計算檢出限,十倍信噪比(S/N)計算定量限。

回收率與精密度實驗選擇高、中、低三個水平的濃度進行測定,每個濃度進行六次平行測定。通過對市售液體與固體奶茶進行隨機抽樣檢測來驗證方法的可行性。

1.3數據處理

對標準溶液與待測樣品試液進行兩次平行測定,結果取算數平均值,采用Microsoft Office Excel 2010進行統計分析處理,計算相對標準偏差。

2　結果與分析

2.1儀器條件的選擇

圖1　香蘭素(a)、乙基香蘭素(b)和3,4-亞甲二氧苯乙酮(c)的全掃描質譜圖Fig.1　Full scan mass spectrum of vanillin(a),ethyl vanillin(b)and 3′,4′-(methylenedioxy)acetophenone(c)

通過離子阱氣質聯用儀全掃描模式,獲得了香蘭素、乙基香蘭素和3,4-亞甲二氧苯乙酮的質譜圖,圖1為本實驗使用10 mg/L的標準溶液全掃描所得的質譜圖,由質譜圖可以看出目標物的特征離子,由此來選定目標物的定量與定性離子,采用選擇離子存儲模式(SIS)對特征離子進行掃描。

標準溶液的提取離子色譜圖如圖2所示,對于采用氣相色譜或者氣質聯用的方法測定香蘭素和乙基香蘭素,有文獻報道采用了毛細柱5MS[17]、1701[13]或WAX[19]作為分離柱,考慮到香蘭素和乙基香蘭素具有極性,在弱極性的DB-5MS色譜柱上保留時間較短,且拖尾現象嚴重,與文獻報道結果一致[13]。在中等極性色譜柱DB-1701上,香蘭素和乙基香蘭素分離效果較好,但內標物3,4-亞甲二氧苯乙酮與香蘭素的分離效果不佳,而在極性色譜柱DB-WAX上,三種組分的分離效果均較好,故本實驗選擇極性色譜柱DB-WAX作為分析柱。

圖2　目標物在不同毛細柱上的色譜圖:5MS(a)、1701(b)和WAX(c)Fig.2　Chromatograms of targets on different capillarycolumns:5MS(a),1701(b)and WAX(c)

2.2固相微萃取條件的選擇

香蘭素和乙基香蘭素分子雖然含有苯環,但具有羥基和醛基等極性基團,根據有機物與溶劑“相似相溶”的原則,選擇能吸附極性和弱極性物質的CAR/PDMS復合萃取頭[20],且香蘭素和乙基香蘭素具有揮發性,適合采用頂空萃取法。此外,添加無機鹽可降低揮發性物質在水中的溶解度[21],同時適當提高萃取溫度和延長平衡時間可使目標物充分平衡[22],而達到提高萃取效率和方法穩定性的效果。

2.2.1溫度對萃取效率的影響固相微萃取效率與溫度之間具有正相關性,通常萃取溫度升高,目標物峰面積隨之升高[22]。由圖3可知,隨著萃取溫度的升高,香蘭素和乙基香蘭素的靈敏度升高,在70 ℃時達到較高的響應值,鑒于目標物在80 ℃時沒有明顯高于70 ℃時的峰面積,因此選擇萃取溫度為70 ℃。

圖3　萃取溫度對香蘭素和乙基香蘭素萃取效果的影響Fig.3　Effect of temperature on the extraction of vanillin and ethyl vanillin

2.2.2時間對萃取效率的影響萃取時間也是影響萃取效率的重要因素,不同萃取時間下香蘭素與乙基香蘭素峰面積的變化情況如圖4所示,30 min以內萃取頭對目標物的吸附量,隨著萃取時間的增加而增大,30 min時已基本達到平衡,繼續增加萃取時間目標物的峰面積未明顯增加,為節約分析時間,選擇為30 min作為本實驗的萃取時間。

圖4　萃取時間對香蘭素和乙基香蘭素萃取效果的影響Fig.4　Effect of time on the extraction of vanillin and ethyl vanillin

表2　香蘭素和乙基香蘭素在奶茶基質中的回收率和精密度實驗(n=6)

2.2.3無機鹽對萃取效率的影響添加無機鹽會降低目標物在溶劑中的溶解度,使其較易從水相中揮發出來[23],添加不同量的NaCl對萃取效果的影響結果如圖5所示,添加NaCl的量在2.0 g以內時,目標物的峰面積隨著加入NaCl量的增加而增大,但繼續增加NaCl的量反而使目標物的峰面積減少,這可能是因為加入NaCl后,在降低目標物在溶劑中溶解度的同時,也增大了溶液的粘度,降低了目標物的擴散速率[24]。綜合考慮,在本實驗中選擇每5 mL標準溶液中添加2.0 g的NaCl。

圖5　NaCl的添加量對香蘭素和乙基香蘭素萃取效果的影響Fig.5　Effect of salt amounts on the extraction of vanillin and ethyl vanillin

2.3方法的線性范圍與檢出限

分別以香蘭素和乙基香蘭素對3,4-亞甲二氧苯乙酮的峰面積比值作為縱坐標,儀器檢測到的香蘭素和乙基香蘭素的含量作為橫坐標進行線性回歸,結果表明香蘭素和乙基香蘭素在0.5～25.0 μg時,香蘭素的回歸方程為Y=0.0466X+0.1053(R2=0.9974),乙基香蘭素的回歸方程為Y=0.0914X+0.2264(R2=0.9987),相關系數良好。按三倍信噪比(S/N)計算檢出限,在固體樣品中香蘭素和乙基香蘭素的檢出限分別為0.5 mg/kg和0.3 mg/kg,定量限為1.5 mg/kg和1.0 mg/kg。而在液體樣品中檢出限分別為0.05 mg/kg和0.03 mg/kg,定量限為0.15 mg/kg和0.10 mg/kg。在奶茶樣品中添加與檢出限濃度一致的香蘭素和乙基香蘭素,采用上述的檢測方法驗證可以檢出。

2.4方法的回收率與精密度

分別在固體和液體奶茶基質中添加香蘭素和乙基香蘭素高、中、低三個水平的回收率實驗,每份樣品重復測定6次,結果見表2,香蘭素的平均回收率為88.99%～105.15%,相對標準偏差為2.40%～9.26%,乙基香蘭素的平均回收率為91.57%～105.13%,相對標準偏差為2.35%～8.49%。

2.5實際樣品的測定

根據本實驗所建立的方法對隨機購買的10份速溶固體奶茶,以及8份液體奶茶進行檢測,結果如表3所示,所有樣品均檢出香蘭素和乙基香蘭素,由檢測結果可見奶茶中添加香蘭素的量整體較乙基香蘭素高,其中香芋味的固體奶茶中香蘭素的添加量最高,含量達到804.98 mg/kg,固體奶茶中乙基香蘭素添加量最高的為原味奶茶,含量為49.06 mg/kg,而液體奶茶中香蘭素和乙基香蘭素的添加量沒有固定的規律,這可能由于液體奶茶沒有經過標準化工業生產,僅由售賣人員現場配制,導致香精的添加量無法恒定。

表3　實際樣品的檢測結果(mg/kg)

3　結論

采用頂空固相微萃取和氣質聯用技術,添加3,4-亞甲二氧苯乙酮作為內標物,建立了奶茶中香蘭素和乙基香蘭素的檢測方法。此方法前處理方式簡單,香蘭素和乙基香蘭素在0.5～25.0 μg時,有良好的線性關系,相關系數分別為香蘭素為R2=0.9974,乙基香蘭素為R2=0.9987,添加三個濃度的回收率實驗表明,香蘭素的平均回收率為88.99%～105.15%,相對標準偏差為2.40%～9.26%,乙基香蘭素的平均回收率為91.57%～105.13%,相對標準偏差為2.35%～8.49%。該方法提高了檢測效率,且無需采用有機溶劑提取,對環境和操作人員都具有保護作用,同時本文還對市售的奶茶樣品進行隨機抽樣檢測,檢測結果顯示所抽檢的奶茶中均檢出香蘭素和乙基香蘭素,而香蘭素的量整體較乙基香蘭素高,檢出范圍為0.86～804.98 mg/kg,這可為今后的食品安全風險監測,以及企業對產品的質量控制,提供參考依據。

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Determination of vanillin and ethyl vanillin in milky tea by HS-SPME-GC/MS

XU Xing1,PENG Fei-jin2,SHU Ping1,DI Jia-wei1,ZHAO Hao-jun1,WANG Kun1

(1.Dali Comprehensive Inspection Centre of Quality and Technical Supervision,Dali 671000,China;2.Centre Testing International Co.,Ltd.,Kunming 650217,China)

A method for headspace solid phase micro extraction(HS-SPME)and gas chromatography mass spectrometry(GC/MS)was developed for the determination of vanillin and ethyl vanillin in milky tea. 75 μm carboxen/polydimethylsiloxane(CAR/PDMS)fiber was selected for extraction in this study. The parameters affecting extraction efficiency such as extraction temperature,extraction time and salt concentration were investigated. 3′,4′-(methylenedioxy)acetophenone was used as an internal standard for quantifying vanillin and ethyl vanillin. The results showed that the linear relationships between ratio of peak area and concentration of vanillin(R2=0.9974)and ethyl vanillin(R2=0.9987)were good enough from 0.5 to 25.0 μg. The limits of detection for vanillin and ethyl vanillin were 0.5 mg/kg and 0.3 mg/kg in solid samples,and they were 0.05 mg/kg and 0.03 mg/kg in liquid samples,respectively. The average recoveries of vanillin were 88.99%～105.15%,and the relative standard deviations(RSDs)were 2.40%～9.26%. The average recoveries of ethyl vanillin were 91.57%～105.13%,and the RSDs were 2.35%～8.49%. This method is convenient and reliable,and it is suitable for the determination of vanillin and ethyl vanillin in milky tea.

vanillin;ethyl vanillin;headspace solid phase micro extraction and gas chromatography mass spectrometry(HS-SPME-GC/MS);milky tea

2016-02-19

徐幸(1983-),女,博士,工程師,研究方向:食品質量安全檢測,E-mail:xuxing1983@163.com。

云南省衛生廳制修訂食品安全地方標準項目(云衛[2014]DB003)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)16-0079-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.007