17種植物揮發油對食源微生物抑菌活性研究

潘旭遲,傅昱晟,許劍鋒,朱靖豪

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

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17種植物揮發油對食源微生物抑菌活性研究

潘旭遲,傅昱晟,許劍鋒*,朱靖豪

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

采用抑菌圈實驗研究17種天然源植物揮發油對大腸桿菌(E.coli),沙門氏菌(S.a.),金黃色葡萄球菌(S.aureus)和李斯特菌(Lis)的抑菌效果,通過Matlab的評價,篩選得到10種具有廣譜抑菌性且抑菌效果較好的產品進行最小抑菌濃度(Minimum Iinhibitory Concentration,MIC)和最小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)實驗,并利用氣相色譜-質譜法(Gas Chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析得到效果最好的留蘭香油的有效活性成分。結果表明:留蘭香油對4種實驗細菌均有較強的抑制作用,其MIC均在6.25 mg·mL-1,MBC均在50 mg·mL-1,有效活性成分為檸檬烯(13.71%)和左旋香芹酮(71.34%),其中左旋香芹酮對E.coli和S.aureus具有更強的抑菌效果,MIC及MBC均在12.5 μg·mL-1。佐以掃描電鏡實驗,發現加入左旋香芹酮后培養的細菌會產生皺縮或破裂現象,說明左旋香芹酮可抑制實驗細菌的生長繁殖,最終導致細菌死亡。初步表明在留蘭香油中左旋香芹酮是主要抑菌成分。

留蘭香,抑菌,大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,沙門氏菌,掃描電鏡,氣相色譜-質譜,MATLAB軟件

食源性疾病是較為常見的一類影響人類健康的問題,在美國,每年有1/6的人由于食用被微生物污染的食物而導致疾病發生[16],為使得食品能夠保證較為長久的新鮮程度,多在食品中添加防腐劑,以提高食品的抗菌、抗氧化性能[1]。目前使用最多的為化學防腐劑,如苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類等[2]。有研究表明:苯甲酸鈉在人體胃腸道的酸性條件下會轉換成毒性較強的苯甲酸,有可能引起胃腸功能的減退,增加肝臟的負擔[3]。因此在崇尚綠色、安全、天然的今天,人們尋找“天然源防腐劑”以代替人工防腐劑,在食品行業的發展中也將成為一項勢在必行的重要課題[4]。本文以天然源植物揮發油為原料,對其抑菌效果進行分析評估,以此尋找與目前人工防腐劑抑菌效果相當的產品。

許多研究報道了天然源植物揮發油對食源性致病菌的抑制效果,如:鄧業成[5]等人研究了4種植物精油的抑菌活性及其在漱口水中的應用;孫立春[6]等人制備了14種植物提取物,并證明其中五倍子及石榴皮醇提取物的抑菌效果更優于同質量濃度的山梨酸鉀;呂爽[7]等人則對比分析椒樣薄荷與蘇格蘭留蘭香精油的抑菌活性,為其多角度開發提供依據。本文則在現有研究基礎上改進實驗方案,采用更大量的天然源植物揮發油作為樣品進行抑食源性致病菌生長效果的比較,并利用矩陣運算、統計分析函數及Matlab的評價,進一步針對效果最好的留蘭香油進行GC-MS抑菌活性成分分析及掃描電鏡的研究,旨在篩選天然源植物揮發油中具有廣譜抑菌性及抑菌效果較好的產品,以此為天然食品防腐劑的選擇提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

檸檬油、香茅油、艾葉油、金銀花油、茶樹油、荊芥油、陳皮油、丁香油、百里香油、冬青油、大蒜精油、紫蘇葉油、留蘭香油、水溶性生姜精油、姜油樹脂、芹菜籽油、肉豆蔻吉安市聚鵬天然香料油;左旋香芹酮標準品HPLC≥98%,阿拉丁;檸檬烯HPLC≥98%,上海源葉生物科技有限公司;供試菌包括大腸桿菌(E.coliATCC25922)、沙門氏菌(S.a. CMCC50041)、金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC25923)、李斯特菌(LisATCC19115)中國科學院微生物研究所;胰蛋白胨大豆瓊脂、胰酪胨大豆肉湯培養基、MH肉湯青島高科園海博生物技術有限公司;二甲基亞砜、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、戊二醛2.5%、無水乙醇、鋨酸均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;碘硝基四唑紫(INT)生工生物工程(上海)股份有限公司。

MLS-3750全自動高壓蒸汽滅菌鍋日本三洋;ESCO垂直流超凈工作臺新加坡ESCO公司;BPH-9082電熱恒溫培養箱上海百典;SHP-2008恒溫培養振蕩器上海世平實驗設備有限公司;DHG-9073B5-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱上海新苗醫療器械制藥有限公司;VOYAGER氣相色譜-質譜聯用儀美國Finnigan公司。

1.2實驗方法

1.2.1 抑菌圈實驗參考Chan[8]等方法測定抑菌圈直徑。將17種天然源植物揮發油分別配制成質量濃度為0.5 g·mL-1的水溶液。將活化后的E.coli、S.a.、S.aureus、Lis接種量分別調整至106、105、106、104cfu/mL。用移液槍取0.1 mL,均勻涂布在制備好的平板上,置于37 ℃的恒溫培養箱中10 min,用無菌鑷子將濾紙片貼在培養基表面,輕壓紙片以確保接觸良好。吸5 μL樣品滴于濾紙片表面并做好標記。37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h,觀察抑菌圈大小并測定其直徑,3組平行取平均值。

1.2.3MIC和MBC的測定參考微量肉湯稀釋法[9-10],采用篩選的10種揮發油進行MIC及MBC的測定。將篩選后的10種揮發油樣品溶解在DMSO中,樣品質量濃度配制成100 mg·mL-1,經二倍系列稀釋,得到系列質量濃度為:100、50、25、12.5、6.25、3.13 mg·mL-1。實驗組每孔加入50 μL菌液和50 μL樣品,對照組只加50 μL菌液和50 μL DMSO,將96孔板置于恒溫培養箱中37 ℃條件下培養24 h,取出,每孔加入10 μL的INT溶液,染色30 min后觀察顏色變化:活細胞經INT染色后為紫色,無活細胞則不變色,顏色沒有變化的最小濃度即為MIC;培養48 h后,顏色沒有變化的最小濃度即為MBC。

1.2.4留蘭香油的GC-MS分析[11-13]色譜柱:HP-5彈性石英毛細管柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:初始溫度60 ℃,以2 ℃/min升溫至260 ℃;載氣(He)流速1.0 mL/min,進樣量0.2 μL;分流比20∶1。

質譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;離子源溫度270 ℃;激活電壓1.5 V;質量掃描范圍m/z 29～420;掃描間歇1.0 s;倍增器電壓280 V。

1.2.5檸檬烯和左旋香芹酮標準品抑菌實驗

1.2.5.1抑菌圈實驗參考Chan[8]等方法測定抑菌圈直徑。將檸檬烯、左旋香芹酮標準品配制成0.5 mg·mL-1的水溶液。將活化后的E.coli、S.a.、S.aureus、Lis接種量分別調整至106、105、106、104cfu/mL。用移液槍取0.1 mL,均勻涂布在制備好的平板上,置于37 ℃的恒溫培養箱中10 min,用無菌鑷子將濾紙片貼在培養基表面,輕壓紙片以確保接觸良好。吸5 μL樣品滴于濾紙片表面并做好標記。37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h,觀察抑菌圈大小并測定其直徑,3組平行取平均值。

1.2.5.2MIC和MBC的測定參考微量肉湯稀釋法[9-10],采用檸檬烯、左旋香芹酮標準品進行MIC及MBC的測定。將標準品濃度配制成100 μg·mL-1,經二倍系列稀釋,得到系列質量濃度為:100、50、25、12.5、6.25、3.13 μg·mL-1。實驗組每孔加入50 μL菌液和50 μL樣品,對照組只加50 μL菌液和50 μL DMSO,將96孔板置于恒溫培養箱中37 ℃條件下培養24 h,取出,每孔加入10 μL的INT溶液,染色30 min后觀察顏色變化:活細胞經INT染色后為紫色,無活細胞則不變色,顏色沒有變化的最小濃度即為MIC;培養48 h后,顏色沒有變化的最小濃度即為MBC。

1.2.6掃描電鏡分析[14]根據標準品MIC、MBC實驗效果,選取效果更優的左旋香芹酮進行掃描電鏡分析。將經活化后的E.coli、S.a.、S.aureus、Lis接種于新鮮的TSB培養基中,調整在實驗菌中左旋香芹酮標準品濃度為25 μg·mL-1(2×MIC),在37 ℃,150 r/min條件下搖床振蕩培養12 h。先后用戊二醛和鋨酸固定后,乙醇脫水、烘干備用。掃描電鏡實驗時將其進行離子濺射金后,即可進行掃描電鏡觀察。1.2.7 數據處理實驗數據均為3次重復實驗的均值,數據用Excel 2010進行處理,計算其均值與標準差。

表1　17種天然源植物揮發油抑菌圈實驗結果(mm)

注:-表示在此條件下無抑菌圈產生。

2　結果與分析

2.1揮發油抑菌圈直徑及MIC、MBC

2.1.1揮發油抑菌圈直徑對表1數據進行分析,水溶性生姜精油及芹菜籽油對實驗細菌不具有抑菌效果,荊芥油、紫蘇葉油、姜油樹脂、肉豆蔻則僅對其中2種細菌具有抑菌效果,且效果不顯著;而留蘭香油、丁香油效果更好,抑菌圈大小均在14.5 mm及以上,其中留蘭香油、丁香油對S.a.抑菌效果最好,高達18.9 mm及以上。由表2結合F值分析,排除ω2中抑菌圈直徑全為0的揮發油的干擾因素,抑菌普適性最強者為丁香油,留蘭香油次之,檸檬油位于第三位。而在個別菌的抑制效果上,檸檬油對于Lis抑制效果較其他油更好,丁香油在抑制S.a.效果上最好,留蘭香油對E.coli及S.aureus的抑制效果相對更佳,因此不同揮發油對于不同菌種也會產生特別的抑制效果,可結合實際應用選擇最適揮發油,從ω3～ω6的評定可得,留蘭香油最佳。

2.1.2揮發油MIC與MBC實驗結果從表3可得,艾葉油在實驗最大100 mg·mL-1質量濃度下對實驗細菌還未能起抑制作用,實驗中抑菌效果最差。冬青油和金銀花油在100 mg·mL-1時對S.a.不具有抑菌效果,效果不佳。就抑菌范圍,檸檬油、茶樹油、丁香油及留蘭香油抑菌范圍最廣,對4種實驗細菌均具有較好的抑制效果,其中丁香油對S.aureus的抑制效果更優,MIC為3.13 mg·mL-1,對于Lis的抑菌效果與同質量濃度揮發油相比略遜一籌。相比之下,留蘭香油對于4種細菌的抑制效果更為穩定,都在6.25 mg·mL-1。從MBC實驗結果可得,檸檬油對E.coli、茶樹油對S.a殺菌效果不明顯,只能在一定質量濃度下起到抑菌效果。丁香油和留蘭香油對于E.coli、S.a.、S.aureus的MBC均在50 mg·mL-1,但是留蘭香油在Lis上的MBC比丁香油更小,即在Lis上的殺菌效果比丁香油效果更好。

表2　17種天然源植物揮發油綜合評估

表3　10種天然源植物揮發油對4種供試菌的MIC、MBC實驗結果

注:/:表示在抑菌圈實驗中樣品對該實驗細菌不產生抑制效果;-:表示在MIC、MBC實驗中實驗樣品的最大質量濃度100 mg·mL-1對該菌不產生抑制作用,但在抑菌圈實驗中具有抑菌效果;表5同。

2.2GC-MS分析留蘭香油的主要成分

根據GC-MS色譜圖峰形,直接采用數據分析軟件進行數據庫搜索后定量分析得到其中化合物含量在1%以上的有5種化合物,依次為:桉樹醇、二氫香芹酮、乙酸二氫香芹酮、左旋香芹酮及檸檬烯,其中,桉樹醇、二氫香芹酮、乙酸二氫香芹酮含量在1.37%～2.31%,檸檬烯含量在13.71%,左旋香芹酮含量在71.34%,五種化合物共占留蘭香油90.51%。其中左旋香芹酮及檸檬烯含量遠大于其他幾種化合物,與現有研究中報道[13,15]的留蘭香油主要成分基本一致,證明了實驗的準確性。故針對這兩種化合物進行進一步研究分析。

圖1　留蘭香油GC-MS圖Fig.1　GC-MS of spearmint oil

2.3檸檬烯與左旋香芹酮的抑菌實驗結果

對留蘭香油活性成分進行抑菌實驗,結果見表4、表5。在抑菌圈實驗中,同等質量濃度的左旋香芹酮皆優于檸檬烯,且對于S.a.的抑菌圈直徑達到19.3 mm。就抑菌范圍及抑菌效果來說,檸檬烯在最大質量濃度時對S.a.沒有抑菌效果,且對S.a.和S.aureus同樣不具有殺菌效果。而左旋香芹酮不但對于4種實驗細菌的MIC均在12.5 μg·mL-1且都具有殺菌效果,其中以對E.coli和S.aureus的殺菌效果最好,MBC在12.5 μg·mL-1。又因左旋香芹酮在留蘭香油中含量最高,可初步判定,留蘭香油中主要起抑菌效果的成分為左旋香芹酮,檸檬烯輔之。

表4　檸檬烯及左旋香芹酮抑菌圈直徑實驗結果(mm)

表5　檸檬烯及左旋香芹酮對4種供試菌的MIC、MBC實驗

2.4掃描電鏡分析

左旋香芹酮作用前后的E.coli、S.a.、S.Aureus和Lis的菌體形態分別如圖2～圖5所示。對照組的菌體表面光滑、外觀飽滿、折光性好,而實驗組的菌體則產生皺縮、干癟,且菌體表面有明顯的凹陷,證明左旋香芹酮對于實驗細菌具有抑制生長繁殖,破壞細胞膜,使細胞膜通透性增加,大分子物質泄露的作用,最終導致細菌細胞死亡。

圖2　左旋香芹酮處理前后的E.coli對比圖Fig.2　Scanning electron mictographs of E.coli treated with L(-)-Carvone注：對照組：60000×;實驗組：50000×。

圖3　左旋香芹酮處理前后的S.a.對比圖(50000×)Fig.3　Scanning electron mictographs of S.a. treatedwith L(-)-Carvone(50000×)

圖4　左旋香芹酮處理前后的S. Aureus對比圖(50000×)Fig.4　Scanning electron mictographs of S. Aureus treatedwith L(-)-Carvone(50000×)

圖5　左旋香芹酮處理前后的Lis對比圖(50000×)Fig.5　Scanning electron mictographs of Lis treatedwith L(-)-Carvone(50000×)

3　結論與討論

本文以17種天然源植物揮發油抑菌效果的研究為基礎,從抑菌圈實驗和96孔板微量稀釋實驗結果表明,檸檬油、茶樹油、丁香油及留蘭香油對4種實驗細菌都具有較好的抑制效果,其中丁香油及留蘭香油對實驗細菌都起到良好殺菌作用。數據分析可得,不同揮發油在不同菌種的抑制效果上也有不同:例如百里香油對E.coli和S.aureus抑制效果弱,對Lis無抑制效果,但對S.a.在6.25 mg·mL-1即有抑菌作用。因此在作為肉類香辛料同時,可調整用量或與其他揮發油復配作為防腐劑應用于食品中,在成本上可以得到控制,便于食品工業大規模生產。丁香油和留蘭香油綜合抑菌效果最好,其中在Lis的殺菌效果上,留蘭香油的MBC更小于丁香油,可認為留蘭香油的殺菌效果優于丁香油。GC-MS分析得到留蘭香油的抑菌活性成分中含量最高的2個化合物為檸檬烯(13.71%)與左旋香芹酮(71.34%),并通過抑菌實驗,證明在留蘭香油中主要起抑菌效果的為左旋香芹酮。

通過掃描電鏡對比左旋香芹酮作用前后的細菌細胞形態,發現加入左旋香芹酮的細菌發生皺縮、干癟、且菌體表面有明顯的凹陷,證明了左旋香芹酮對于實驗細菌具有抑制生長繁殖,破壞細胞膜,使細胞膜通透性增加,大分子物質泄露的作用,最終可以導致細菌細胞死亡。因此可嘗試通過包合、微囊技術或使用天然助溶劑助溶等方法增加左旋香芹酮溶解度,便于添加到食品中使用。相比添加助溶劑不利于熱加工、有香味等,包合及微囊技術有助于掩蓋化合物本身香味,但同時也存在抑菌效果不良的風險,因此也需根據實際應用選擇最適添加方法。

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Study on the active ingredients for antibacterial activities of volatile oils from 17 kinds of natural plants

PAN Xu-chi,FU Yu-sheng,XU Jian-feng*,ZHU Jing-hao

(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Antibacterial effects of volatile oils from 17 kinds of natural plants onEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Salmonellasspp. andListeriamonocytogeneswere investigated in this study.Inhibition zone and Matlab were employed to determine that the spearmint oil was the optimal solution for inhibiting the bacteria,the MIC and MBC were 6.25 mg·mL-1and 50 mg·mL-1respectively. Furthermore,the active ingredients of spearmint oil were identified as limonene(13.71%)and L(-)-carvone(71.34%)by using GC-MS,which had better antibacterial activity againstE.coliandS.aureus,both MIC and MBC were 12.5 μg·mL-1. The comprehensive analysis indicated that L(-)-carvone was the main factor for bacterial inactivation. And the SEM results showed bacterial cells were crumpled and ruptured after L(-)-carvone treatment,which demonstrated this substance could effectively suppress bacterial growth and reproduction.

spearmint;antibacterial;E.coli;S.aureus;Salmonellas;scanning electron microscope(SEM);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);MATLAB

2016-02-17

潘旭遲(1995-)，女，本科在讀，研究方向：生物技術(海洋生物制藥)，E-mail：panxuchi1514@126.com。

許劍鋒(1968-)，博士，副教授，研究方向：海洋天然藥物，E-mail：jfxu@shou.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0107-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.013