酶法制備的豆渣可溶性膳食纖維組成分析及其抗氧化性能研究

龔思思,湯小明,鄭　俊,趙　強,熊　華

(南昌大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

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酶法制備的豆渣可溶性膳食纖維組成分析及其抗氧化性能研究

龔思思,湯小明,鄭俊,趙強*,熊華

(南昌大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

采用纖維素酶、α-淀粉酶酶解,乙醇分級沉淀法制備得到三種不同組分的豆渣可溶性膳食纖維(SDF-1、SDF-3、SDF-5),并采用氣相色譜法、紅外光譜法、體外抗氧化法等對其成分及抗氧化活性進行研究。成分分析結果表明,SDF-1中含有的總糖和半乳糖醛酸含量均為最高,分別為53.44%和20.43%,而SDF-5中還原糖含量最高,為10.56%;SDF-1由Ara、Man、Glu和Gal所組成,摩爾比為1.21∶1.60∶4.90∶1.33;SDF-3與SDF-5均由Rha、Ara、Xyl、Man、Glu和Gal所組成,摩爾比分別為2.00∶4.05∶0.98∶0.84∶0.96∶13.64和1.46∶4.75∶1.04∶2.10∶1.64∶23.92。體外抗氧化的結果表明,SDF-5具有最強的清除DPPH、ABTS+自由基和Fe3+還原力3種抗氧化活性。

豆渣,可溶性膳食纖維,酶解,成分分析,抗氧化

膳食纖維(DF)是指膳食中所有不能被人體消化道內的分泌物消化分解的多糖,包括非淀粉多糖、抗性淀粉和木質素等[1]。根據其溶解特性不同分為不溶性膳食纖維(IDF),如纖維素、木質素等和可溶性膳食纖維(SDF),包括某些植物細胞的儲存物和分泌物及微生物多糖[2]。SDF較IDF作用突出,具有促進腸道益生菌群增殖、控制血糖指數、降低血脂、血清總膽固醇與低密度脂蛋白等生理功能[3]。

大豆作為世界上主要的糧食和油料作物,是重要的植物蛋白和植物油來源。大豆在加工分離蛋白、豆粉和豆腐等豆制品過程中會產生大量的副產物即豆渣。豆渣中仍殘留較多的營養成分,尤其是豆渣中膳食纖維含量達60%。由于新鮮豆渣營養豐富、含水量大,易腐敗變質,飼用易脹氣等問題的存在,長期以來少部分豆渣用作牲畜的飼料,大部分被直接丟棄,不僅資源浪費且污染環境。

國內外提取膳食纖維的方法主要有化學法[4]、酶解法[5]、微生物發酵法[6]、膜分離法[7]、超高壓處理法等[8]。酶解法因條件溫和、對環境污染小,應用前景廣闊[9]。林文庭等[10]以番茄渣為原料,研究酶法提取膳食纖維的工藝,其提取出的SDF和IDF得率分別為6%和40%。近年來,關于膳食纖維清除自由基的報道越發受到關注,且已經證實SDF具有較好的抗氧化性[11]。目前,有關研究主要是豆渣SDF的提取和含量測定,對其化學組成及生理活性等則報道較少。本文采用纖維素酶、α-高溫淀粉酶復合酶解法提取豆渣SDF,通過三氯乙酸除蛋白、乙醇分級沉淀等方法分離純化SDF,并對其成分及抗氧化活性進行了分析,為豆渣可溶性膳食纖維的應用提供數據支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮豆渣江西維爾寶食品生物有限公司提供;石油醚、四硼酸鈉、硫酸銅、酒石酸鈉、三氯乙酸、氯化鐵、鐵氰化鉀、鹽酸羥胺、吡啶、EDTA、3,5二硝基水楊酸等均為分析純;半乳糖醛酸、無水木糖、單糖標品(鼠李糖,阿拉伯糖,D-木糖,D-甘露糖,D-葡萄糖,半乳糖,即Rha,Ara,Xyl,Man,Glu,Gal)中國藥品生物制品檢定所;葡萄糖、維生素C等上海淮捷化學試劑公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)美國Sigma公司;纖維素酶(2000 u/g)、α-高溫淀粉酶(120 KUN/g)諾維信生物技術有限公司。

LXJ-IIB型離心機上海安亭科學儀器廠;KJeltec8400型凱氏定氮儀FOSS公司;DFY-500型萬能粉碎機溫嶺市林大機械有限公司;T6紫外分光光度計北京普析通用儀器有限公司;Thermo Nicolet NEXUS 470紅外光譜儀美國Thermo Electron公司;2010型氣相色譜儀美國安捷倫公司;RV10旋轉蒸發儀德國IKA公司。

1.2實驗方法

1.2.1豆渣前處理新鮮豆渣,在60 ℃鼓風干燥箱中平鋪攤薄烘干,粉碎,用石油醚脫脂(m/v=1∶5,3次),揮去溶劑備用。

1.2.2制備豆渣可溶性膳食纖維參考文獻方法并做修改[12],取脫脂豆渣粉200 g,加入2000 mL去離子水,調節溫度50 ℃,加入中性蛋白酶2 g,酶解150 min,再離心(3000 r/min、20 min),取下層沉淀進行洗滌、烘干后重新加入2000 mL去離子水,調節pH6.0,依次用纖維素酶(50 ℃,pH6.0,1 h)、α-淀粉酶酶解(95 ℃，pH5.8～6.2、1 h)進行酶解,酶解物離心(8000 r/min、20 min)取上清液,加入同體積三氯乙酸(10%,m/v)溶液進行脫蛋白,然后加入不同體積倍數無水乙醇(1、3、5倍)沉淀水解液,無水乙醇清洗,冷凍干燥,得到三種不同組分的可溶性膳食纖維SDF-1、SDF-3、SDF-5。

1.2.3可溶性膳食纖維組分測定

1.2.3.1總糖含量測定參考文獻方法進行測定[13]。標準曲線繪制:采用苯酚-硫酸法,分別取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL葡萄糖標準溶液(100 μg/mL)于比色管中,加水至1.00 mL,加入1.0 mL 5.0%苯酚,迅速搖勻后,緩慢加入5.0 mL濃硫酸,混勻,以1.0 mL蒸餾水作空白,30 ℃條件下反應20 min后于490 nm處測定吸光度以繪制標準曲線。樣品測定:取一定體積樣品溶液,加水至2.0 mL后按以上操作步驟測吸光值Ai,1.0 mL蒸餾水代替1.0 mL 6.0%苯酚的吸光值為Aj,1.0 mL蒸餾水代替樣液做空白,樣品溶液的吸光值A=Ai-Aj,根據標準曲線計算樣品中總糖濃度。

1.2.3.2還原糖含量的測定參考文獻方法進行測定[14]。木糖標準曲線的繪制:取木糖標準溶液(1 mg/mL)0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL于比色管中,加水至1.00 mL,再向其中加入 0.6 mL DNS顯色劑,混勻后在沸水中反應5 min,冷卻至室溫,加蒸餾水至5 mL,搖勻,以1.0 mL蒸餾水作空白,于540 nm處測定吸光度值,以此制作木糖標準曲線。取樣品適量,同上述測定,根據標準曲線計算含量。

1.2.3.3半乳糖醛酸含量測定實驗步驟[15]:準確量取0.00、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL半乳糖醛酸標品溶液(1 mg/mL)于帶塞試管中,各管加水至1 mL置于冰水浴中冷卻,然后分別向各管加入5 mL四硼酸鈉-濃硫酸溶液,混勻后,置于沸水中15 min后拿出冷卻至室溫,再分別向各管加0.2 mL咔唑液,以一號管為空白在室溫下反應2 h,于523 nm測定吸光度值,制作標準曲線。取樣品適量,同上述測定,根據標準曲線計算含量。

1.2.3.4可溶性膳食纖維單糖組成氣相分析酸水解:稱取10 mg樣品于安瓿管中,加入2.0 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸,真空封管于100 ℃反應12 h,待反應完全后,冷卻至室溫,于70 ℃水浴并用N2吹干,制備得到單糖混合物。

制備糖腈乙酰化物:分別稱取6種標準單糖(鼠李糖,阿拉伯糖,D-木糖,D-甘露糖,D-葡萄糖,半乳糖)1.0、1.5和2.5 mg混合置于樣品管中制成混標樣,各加入鹽酸羥胺10 mg,吡啶0.5 mol進行溶解,置于90 ℃恒溫水浴中振蕩30 min,冷卻至室溫后分別加入乙酸酐0.5 mL,繼續放入90 ℃恒溫水浴中振蕩30 min,冷卻至室溫過膜進樣。取經酸水解處理后的豆渣可溶性膳食纖維樣品經上述步驟,進行衍生處理后制成糖腈乙酰化物。

儀器工作參數:Agilent 6890氣相色譜儀,DB1701石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),固定液為SE-54;載氣N2,進樣量1.0 μL,進樣口溫度250 ℃,色譜柱溫250 ℃,檢測器FID,250 ℃,分流比1∶20,升溫程序為70 ℃持續2 min,70～180 ℃,升溫速度20 ℃/min,180～250 ℃,升溫速度3 ℃/min,250 ℃保持20 min。

1.2.4傅立葉紅外光譜分析取干燥的可溶性膳食纖維樣品與KBr研磨后壓片,用Nicolet 5700傅立葉變換紅外光譜儀在400～4000 cm-1區域內進行掃描,對可溶性膳食纖維的構型進行初步分析。

1.2.5可溶性膳食纖維體外抗氧化性研究

1.2.5.1DPPH自由基清除率測定參考文獻[16-17]方法修改為:以無水乙醇為溶劑配制成1×10-4mol/L DPPH自由基溶液,加入2 mL SDF溶液,充分混合后避光反應30 min,于517 nm處測吸光值Asample;同時測定DPPH與2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度Acontrol,以及2.0 mL相應濃度的樣液與2.0 mL無水乙醇混合液的吸光度Aj。用95%乙醇代替反應液作空白對照,以抗壞血酸作為對照。DPPH清除率計算式為:

1.2.5.2ABTS+自由基清除能力實驗參考文獻方法進行測試[18-19]:取等體積7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀混合,在室溫下避光反應12 h,再用pH7.4,0.2 mol/L的PBS稀釋60倍。取2.5 mL不同濃度的SDF溶液中加入2 mL ABTS工作液,避光反應6 min,以蒸餾水作空白,在734 nm處測定吸光度Asample,同時測定2.5 mL蒸餾水與2.0 mL ABTS溶液的吸光度Acontrol,自由基以及2.5 mL相應濃度的樣液與2.0 mL去離子水混合液的吸光度Aj。以抗壞血酸作為對照,ABTS+自由基清除率計算式為:

1.2.5.3還原能力實驗參照文獻[20]方法修改為:向不同濃度(0～0.6 mg/mL)SDF樣液中分別加入1.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH6.6)與1.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液,混合搖勻,于50 ℃反應20 min后加入1.5 mL 10%的三氯乙酸溶液終止反應,再加入3 mL去離子水和0.6 mL 0.1%的FeCl3溶液,搖勻后于700 nm處測定吸光值,以0.6 mL蒸餾水代替0.1% FeCl3溶液作空白,以抗壞血酸作為對照。還原能力即以吸光值表示,吸光值越大代表還原能力越強。

1.2.6數據處理實驗設計都是三次平行兩個重復,數據多表示為平均值±標準差的形式,差異顯著性分析限定為p<0.05,利用一維方差分析的Tukey test檢驗。

2　結果與討論

2.1豆渣SDF的基本組分

豆渣可溶性膳食纖維成分分析如表1。SDF-1含有的總糖含量最高(53.44%),SDF-3總糖濃度最低(23.91%),SDF-5總糖為36.34%;其對應的還原糖含量則顯著增高,分別為1.28%、2.56%和10.56%。即隨著乙醇加入量的增大,還原糖含量呈現明顯增加的趨勢,而可溶性還原糖的含量與抗氧化能力緊密相關。然而,SDF-1、SDF-3、SDF-5三者中所含的半乳糖醛酸含量分別為20.43%、10.33%和7.96%,呈現顯著降低的趨勢(p<0.05);其中SDF-1中所含的半乳糖醛酸含量最高,SDF-5樣品中半乳糖醛酸含量最低,說明SDF-1中膠質類物質含量較高,這可能是由于體系中低濃度的乙醇并未使其解體所導致。

表1　可溶性膳食纖維基本組分

注:同列所標字母相異者表示差異顯著(p<0.05)。

2.2豆渣SDF的單糖組成

豆渣SDF乙酰化物的氣相色譜(GC)圖見圖1。

圖1　單糖混標(SP)與SDF糖腈乙酰化物的氣相色譜圖Fig.1　GC of sugar nitrile acetic ester derivatives of monosaccharide standard mixture and SDFs

表2　豆渣SDF中單糖的組成

由圖1可知各單糖在此色譜條件下得到了良好的分離。根據各混合標準單糖的氣相色譜圖確定各單糖的保留時間以及含量計算結果,見表2。SDF-1水解產物的衍生物在氣相色譜柱上分出4個峰,所對應的單糖分別是阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,組成摩爾比為1.21∶1.60∶4.90∶1.33;SDF-3的單糖組成與SDF-5相似,分出6個峰,所對應的單糖分別為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,摩爾比分別為2.00∶4.05∶0.98∶0.84∶0.96∶13.64和1.46∶4.75∶1.04∶2.10∶1.64∶23.92。由此可知,SDF-1中半乳糖含量最高;SDF-3、SDF-5單糖組成中半乳糖含量最高;且隨著乙醇濃度的增大,單糖組成發生了較大的變化。同時還可以看出,豆渣SDF的單糖組成種類較多,各SDF樣品均含有阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖,說明豆渣可溶性膳食纖維是一類組成復雜、結構多樣的雜多糖。

2.3豆渣SDF紅外分析

通過對紅外光譜特征峰的推斷,結合資料的報道[21],如鼠李糖、半乳糖在3300～3200 cm-1和1700～650 cm-1都有吸收峰,且鼠李糖、半乳糖都有羰基(C=O)和醚鍵(-C-O-C)等官能團的存在,因此可以進一步確定豆渣SDF中含有鼠李糖和半乳糖等單糖組分。豆渣SDF的傅里葉紅外光譜圖如圖2所示,SDF-1、SDF-3和SDF-5都在3400 cm-1附近都有強吸收峰,代表著-OH的伸縮振動;在2930 cm-1處都有一個吸收峰,代表C-H的伸縮振動;1630 cm-1有一個吸收峰則表明SDF中有羰基(C=O)官能團的存在。1540 cm-1吸收峰是N-H的變角振動,為RCONHR的酰胺II吸收帶,證明有蛋白質存在,進一步證實豆渣SDF含有糖的蛋白綴合物,而SDF-1和SDF-5則更為明顯。SDF-1、SDF-3和SDF-5在1250 cm-1處有一個吸收峰,代表COOH中O-H的變角振動,可以判斷其中含有-CHO和-COOH基團,從而進一步證實SDF中含有糖醛酸。SDF-3和SDF-5在833 cm-1處出現了甘露糖的特征吸收峰。SDF-1和SDF-3在1070 cm-1附近的吸收峰則表明醚鍵(-C-O-C)的存在。另外,在1430 cm-1和1412 cm-1附近有兩個吸收峰,這兩個吸收峰與-OCH3的伸縮振動密切相關,這表明SDF樣品中的某些糖醛酸可能被酯化了[22]。SDF-3、SDF-5在893 cm-1附近有一個極弱的吸收峰,說明它們中都含有少量的β-糖苷鍵。

圖2　豆渣SDF的傅里葉紅外光譜圖Fig.2　Fourier infrared spectrum of okara soluble dietary fiber

2.4豆渣SDF的抗氧化活性

2.4.1DPPH自由基清除率通過DPPH自由基清除能力來評價樣品的抗氧化能力,常以清除率和50%清除率IC50表示,清除率越高和IC50值越小都說明抗氧化能力越強。三種豆渣SDF清除DPPH自由基結果如圖3所示。由圖3可知SDF-5對DPPH自由基的清除能力最強,且隨著SDF濃度增大,DPPH清除能力逐漸增強。當SDF-5濃度為0.9 mg/mL時,DPPH的清除能力達到91.48%,接近抗壞血酸(VC)清除DPPH的效果,IC50值小于0.4 mg/mL。賀亮等[23]研究發現苦楝子多糖的IC50為5.02 mg/mL,馬惠玲等[24]研究發現蘋果渣果膠多糖對DPPH的清除作用因不同提取工藝有很大差異,其鹽洗組分IC50達到11.5 mg/mL,對比可見SDF-5有著較好的抗氧化活性。而SDF-1、SDF-3對DPPH的清除能力較弱,且隨濃度增大,其清除能力增加不明顯,且兩者對DPPH的清除能力相差不大。在測定范圍0～0.9 mg/mL內,SDF-1、SDF-3及SDF-5對DPPH的清除能力分別在0～11.68%,0～15.47%和0～91.48%。在清除DPPH自由基能力方面,SDF-1、SDF-3與SDF-5存在較大差異,這可能是由于三者成分及含量不同,尤其是SDF-5還原糖的含量分別是SDF-1和SDF-3的10或5倍,這也可能是SDF-5清除DPPH自由基能力更強的原因。

圖3　豆渣SDF對DPPH自由基清除率Fig.3　DPPH radical scavenging effect of okara soluble dietary fiber

2.4.2ABTS+自由基清除率本實驗分別測定了豆渣的三種SDF與VC對ABTS+自由基的清除能力,發現其與DPPH有著相同的變化趨勢,如圖4。結果表明,三種SDF對ABTS+自由基均有一定的清除能力,且隨著SDF濃度增高,對ABTS+自由基的清除能力逐漸增強,當樣品濃度為0.4 mg/mL時SDF-1、SDF-3和SDF-5對ABTS+自由基的清除能力分別為14.69%、15.55%和90.31%,說明SDF-5清除能力最強而SDF-1最弱。另外,SDF-5的IC50為0.16 mg/mL,仍高于VC的IC50值(<0.01 mg/mL),說明SDF-5抗氧化能力弱于VC,但相比其它多糖物質,其抗氧化效果仍較為顯著,如鐵皮石斛多糖對ABTS+自由基清除率在其濃度為3 mg/mL時達最高85.6%[25],而SDF-5對ABTS+自由基清除率達到90.31%時濃度僅為0.4 mg/mL。綜上可知,豆渣中的活性多糖主要集中于SDF-5。

圖4　豆渣SDF對ABTS+自由基清除率Fig.4　ABTS+ radical scavenging effect of okara soluble dietary fiber

圖5　豆渣SDF還原Fe3+能力Fig.5　Reducing power of okara soluble dietary fiber

2.4.3還原能力測定結果如圖5所示,可知豆渣SDF樣品的還原能力都隨著濃度的增大而增大,且SDF-5的抗氧化力明顯高于SDF-1及SDF-3,這與之前所測定的DPPH和ABTS+自由基清除率結果符合。在整個測試范圍內,SDF-3的還原能力較SDF-1小,這與之前它們對DPPH、ABTS+自由基的清除率不一致,產生的原因可能是SDF-1中的某些小分子糖具有潛在的還原能力。

綜上三種抗氧化性測試結果可知,SDF-5具有較強的抗氧化活性。有研究表明[26],在一定分子量范圍內,多糖活性主要集中在小分子量部分,SDF-5為高濃度乙醇沉淀下來的雜多糖,分子量小,還原糖含量較高,因此SDF-5活性更高。

3　結論

SDF-1、SDF-3及SDF-5的成分組成類似但含量差異顯著,SDF-1中含有的總糖和半乳糖醛酸含量均為最高,分別為53.44%和20.43%,而SDF-5中還原糖含量最高,為10.56%;氣相色譜分析表明SDF-1由Ara、Man、Glu和Gal所組成,質量比為1.21∶1.60∶4.90∶1.33;SDF-3與SDF-5均由Rha、Ara、Xyl、Man、Glu和Gal所組成,質量比分別為2.00∶4.05∶0.98∶0.84∶0.96∶13.64和1.46∶4.75∶1.04∶2.10∶1.64∶23.92。體外抗氧化的結果表明,SDF-5較SDF-1及SDF-3具有顯著的清除DPPH、ABTS+自由基能力和Fe3+還原力,其中清除DPPH、ABTS+自由基的IC50值分別為<0.4 mg/mL和0.16 mg/mL,并優于多種文獻報道的可溶性膳食纖維,表現較強的抗氧化活性,具有一定的開發利用潛能。有關SDF-5抗氧化活性強于SDF-1及SDF-3的原因及其抗氧化機理,還有待進一步的分析研究。

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Composition analysis and antioxidant activities of okara soluble dietary fiber prepared by a variety of enzymes

GONG Si-si,TANG Xiao-ming,ZHENG Jun,ZHAO Qiang*,XIONG Hua

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

In this study,enzymatic preparation with cellulase andα-amylase and ethanol fractionation precipitation method were used to obtain three different okara soluble dietary fiber(SDF-1,SDF-3,SDF-5),and their composition and antioxidant activity were investgated by gas chromatography,infrared spectroscopy,andinvitroevaluation method.The results showed that the total sugar and galacturonic acid content contained in SDF-1 were the highest,53.44% and 20.43%,respectively,while SDF-5 had the highest reducing sugar content of 10.56%. GC analysis revealed that SDF-1 was composed of Ara,Man,Glu and Gal with a molar ratio of 1.21∶1.60∶4.90∶1.33,both SDF-3 and SDF-5 were composed of Rha,Ara,Xyl,Man,Glu and Gal,with a molar ratio of 2.00∶4.05∶0.98∶0.84∶0.96∶13.64 and 1.46∶4.75∶1.04∶2.10∶1.64∶23.92,respectively. SDF-5 exhibited the strongest antioxidant activities in three okara SDFs,evidenced by its ability to scavenge DPPH and ABTS radicals,high reducing power. Based on the results above,it could establish foundation for further development and utilization of soluble dietary fiber from okara.

okara;soluble dietary fiber;enzymatic hydrolysis;composition analysis;antioxidant activities

2016-02-17

龔思思(1990-)，女，碩士研究生，研究方向:食品資源的開發與應用,E-mail:523082977@qq.com。

趙強(1981-)，男，博士，副研究員，研究方向:食品生物加工、食品資源開發與綜合利用,E-mail:qiangzhao@ncu.edu.cn。

國家“863”計劃項目(2013AA102203-5)。

TS210.9

A

1002-0306(2016)16-0117-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.015