鈣離子通道抑制劑處理下發芽大豆主要生理生化和γ-氨基丁酸的代謝變化

尹永祺,李　童,王淑雯，史穎悟,高　璐,饒勝其,楊振泉,方維明

(揚州大學食品科學與工程學院,江蘇揚州 225127)

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鈣離子通道抑制劑處理下發芽大豆主要生理生化和γ-氨基丁酸的代謝變化

尹永祺,李童,王淑雯，史穎悟,高璐,饒勝其,楊振泉,方維明*

(揚州大學食品科學與工程學院,江蘇揚州 225127)

為研究鈣離子通道抑制劑對NaCl脅迫下發芽大豆生理代謝和γ-氨基丁酸(GABA)富集的影響,通過NaCl聯合質膜鈣離子通道抑制劑(LaCl3)和內膜鈣離子通道抑制劑(Heparin)處理大豆籽粒,分析發芽期間主要生理生化和GABA代謝酶活力的變化。結果顯示,發芽大豆經NaCl聯合LaCl3處理后,其生長發育較單獨NaCl處理進一步受到抑制,芽長顯著降低,經Heparin處理芽長無顯著性變化,而二者呼吸速率均顯著增加。相較單獨NaCl處理,NaCl聯合LaCl3或Heparin處理后其子葉中GABA代謝酶活力均顯著下降,LaCl3處理后子葉和胚中GABA含量分別為NaCl處理的50%和79%,而Heparin處理則分別為70%和66%,表明抑制內源鈣庫的釋放對NaCl脅迫下GABA富集的影響小于抑制質膜鈣離子通道。

發芽大豆,γ-氨基丁酸,NaCl脅迫,鈣離子通道抑制劑

γ-氨基丁酸(GABA)于2009年被中國衛生部批準為新資源食品,其屬于非蛋白質氨基酸,作為抑制性神經遞質在哺乳動物中樞神經系統中發揮作用,具有改善大腦血液循環、促進腦組織新陳代謝、改善神經機能、降血氨、抗驚厥、降血壓以及恢復腦細胞等多種生理功能[1-3]。

研究發現,植物籽粒發芽期間,尤其在鹽脅迫[4]和低氧[5]等非生物脅迫下發芽,其GABA含量數以倍計的提高。因此,植物籽粒在逆境條件下發芽累積GABA受到國內外功能食品研究者的高度關注。然而,植物籽粒在脅迫條件下發芽其生長同樣受到嚴重抑制,導致其生物產量下降[6]。據報道,鹽脅迫下的發芽大豆施用CaCl2后可恢復正常生長,且仍能大量累積GABA[7]。據此,推測外源Ca2+可緩解逆境脅迫對植物生長的抑制作用并促進GABA累積,但其作用機制尚不明確。植物細胞受到外界信號刺激時,其既可通過質膜鈣離子通道釋放胞外鈣庫,亦可利用細胞內膜上的鈣通道使鈣離子從胞內鈣庫進入細胞質,促使細胞質內鈣離子含量升高,其后細胞質中的CaM與鈣離子結合并激活相應靶酶或靶蛋白,從而導致細胞生理生化反應[8-9]。因此,為探討鈣離子通道在發芽大豆生長及累積GABA中發揮的作用,本研究分析質膜鈣離子通道抑制劑(LaCl3)和內膜離子通道抑制劑(Heparin)處理對NaCl脅迫下發芽大豆生長狀況、生化代謝的影響,并研究其對發芽大豆子葉和胚中GABA含量以及GABA合成酶活性的調控作用,以期初步揭示鈣離子通道介導NaCl脅迫下發芽大豆生理生化及GABA代謝的作用機理。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大豆(GlycinemaxL. Merr)籽粒購于2015年,產自中國東北吉林省,封裝于密閉容器中,4 ℃保存備用;GABA標準品美國Sigma公司;乙腈色譜純;其余試劑均為國產分析純。

Agilent 1200 Series高效液相色譜儀Agilent公司;UV-7504C型紫外可見分光光度計上海欣茂儀器有限公司;BCD-257SL型冰箱青島海爾股份有限公司;PHS-3C pH計上海精密科學儀器有限公司;ZXDP-A2080電熱恒溫培養箱 上海智誠有限公司;高速冷凍離心機上海安亭科學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1樣品制備稱取20 g籽粒飽滿的大豆,經去離子水沖洗后置于1%(v/v)次氯酸鈉水溶液中浸泡消毒15 min,消毒大豆用去離子水沖洗至pH中性后于30 ℃浸泡4 h;將浸泡后大豆置于發芽機于30 ℃避光發芽,分別設以下處理并進行發芽:對照(去離子水);NaCl脅迫處理(50 mmol/L NaCl);NaCl脅迫加LaCl3處理(50 mmol/L NaCl+5 mmol/L LaCl3);NaCl脅迫加Heparin處理(50 mmol/L NaCl+5 mmol/L Heparin);發芽4 d期間,每隔1 d更換培養液至培養結束,期間定時取樣測定相關指標。

1.2.2指標測定與方法

1.2.2.1芽長隨機選取30粒發芽大豆,用游標卡尺測定其芽長。

1.2.2.2呼吸速率參照小籃子法[10]測定。

1.2.2.3脯氨酸含量取樣品0.5 g于試管中,加入5 mL 3%磺基水楊酸,經沸水浴提取10 min,期間不斷晃動;吸取2 mL提取液于另一具塞試管,加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮,混勻后沸水浴30 min,冷卻后加入4 mL甲苯搖蕩30 s,靜置取上清液至10 mL離心管于3000 g離心5 min,取離心后上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色皿中,以甲苯為空白于520 nm處測定其光密度值[10]。

1.2.2.4谷氨酸脫羧酶(GAD)活性參照Zhang等[11]方法進行測定。

1.2.2.5氨基醛脫氫酶(AMADH)活性稱取1 g發芽大豆,加入預冷酶提取液1∶2(w/v):0.1 mol/L pH8.0 磷酸鉀緩沖液,5 mmol/L DTT,1 mmol/L EDTA,10%(w/v)蔗糖,12000×g離心30 min,上清液即為粗酶液;取適量酶液加入0.1 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液,內含1 mmol/L NAD+,加入終體積為1 mmol/L的4-氨基丁醛啟動反應,37 ℃于340 nm處連續測定吸光值,以每分鐘OD340 nm變化0.01個單位為1個酶活力單位(U)[12]。

1.2.2.6GABA含量參照Bai等[13]方法進行測定。

1.3數據統計與處理

實驗結果以平均值±標準差表示。數據采用統計分析軟件18.0(SPSS,18.0)進行統計分析,均值間比較采用Tukey多重比較,在0.05水平上進行顯著檢驗(p<0.05)。

2　結果與分析

2.1鈣離子通道抑制劑對發芽大豆主要生理生化指標的影響

2.1.1形態特征圖1直觀顯示發芽大豆經NaCl及其聯合鈣離子通道抑制劑處理后,其生長狀態明顯受到影響,其中經NaCl聯合LaCl3處理的發芽大豆受抑制情況更嚴重,表觀上可看出發芽4 d時,Heparin處理組的生長較單獨NaCl處理組無明顯差異。

圖1　鈣離子通道抑制劑對發芽大豆形態的影響Fig.1　Effect of calcium channel inhibitor treatment on morphology of germinating soybean注:CK:對照;N:NaCl;NL:NaCl+LaCl3;NH:NaCl+Heparin,圖2～圖7同。

2.1.2芽長由圖2可看出,發芽期間各處理下的發芽大豆芽長均隨發芽時間延長呈增加趨勢,發芽4 d后各處理間芽長具有顯著差異(p<0.05)。NaCl聯合LaCl3處理的芽長顯著低于對照處理與NaCl處理,發芽4 d時其芽長分別為對照組和NaCl處理組的30%和51%;相對而言,發芽4 d經NaCl聯合Heparin處理的豆芽與NaCl無顯著差異;NaCl聯合LaCl3處理組對芽長起到的抑制作用顯著高于NaCl聯合Heparin處理組。

圖2　鈣離子通道抑制劑對發芽大豆芽長的影響Fig.2　Changes in sprout length of germinating soybeanunder calcium channel inhibitor treatments注:圖中字母表示顯著性檢驗結果,不同小寫字母表示不同處理間差異達顯著水平(p<0.05)；圖3～圖7同。

2.1.3呼吸速率發芽期間各處理的豆芽呼吸速率均呈增長狀態,NaCl脅迫下,各處理的豆芽呼吸速率都受到了抑制(圖3),發芽4 d后,NaCl聯合鈣離子通道抑制劑處理組的呼吸速率均顯著高于單獨NaCl處理。前期(發芽2 d)NaCl聯合Heparin處理的豆芽呼吸速率受抑制作用較小,其與對照并無顯著性差異。兩種鈣通道抑制劑在發芽期間對發芽大豆的影響不同,這可能是因為兩種鈣離子通道的作用機制不同造成的差異,LaCl3可結合質膜Ca2+泵上的Mg2+催化位點,抑制Ca2+泵作用進而阻礙Ca2+跨膜運輸,而Heparin抑制細胞內膜上的鈣釋放通道,致使產生的鈣信號強度不同,發芽大豆的生理狀態產生差異[9,14]。

圖3　鈣離子通道抑制劑處理下發芽大豆呼吸速率的變化Fig.3　Changes in respiratory rate of germinating soybean under calcium channel inhibitor treatments

2.1.4脯氨酸含量發芽期間各處理下發芽大豆中脯氨酸含量均呈增加趨勢(圖4)。NaCl脅迫導致發芽大豆子葉中脯氨酸含量顯著增加,發芽4 d時其子葉中含量為對照的2倍,而胚中卻顯著下降;經NaCl聯合LaCl3處理后其子葉中含量較NaCl脅迫無顯著變化,胚中則顯著增加。NaCl聯合Heparin處理4 d后其子葉和胚中脯氨酸含量均顯著低于NaCl及其聯合LaCl3處理。目前學界對于脯氨酸在植物中所發揮的作用有著不同的觀點,低溫、低氧和干旱等非生物脅迫均能引起植物中脯氨酸含量顯著增加,鹽脅迫下煙草、擬南芥、大豆和番茄等多種植物亦顯著積累脯氨酸并提高了其抗脅迫能力,表明脯氨酸的積累可增加植物對滲透脅迫的耐受性[15];然而,亦有研究認為脯氨酸是植物傷害性指標,與植物抗脅迫并無相關性[16],研究發現一些高粱屬植物[17]和大豆[18]經脅迫處理,其脯氨酸含量顯著增加并未提高植物的耐鹽能力。本研究中,NaCl脅迫下,大豆在發芽期間子葉中脯氨酸含量顯著高于對照,而胚中其含量顯著降低,表明脯氨酸累積量與植物的器官類型有關。而Ca2+通道對于脯氨酸的調控影響可能從側面證實脯氨酸只是植物傷害性指標,與植物抗脅迫并無直接相關性。

圖4　鈣離子通道抑制劑對發芽大豆游離脯氨酸含量的影響Fig.4　Effect of calcium channel inhibitor on proline content of germinating soybean

2.2鈣離子通道抑制劑對發芽大豆GABA富集的影響

2.2.1GAD活性在植物中,GABA代謝包括GABA支路和多胺降解兩條途徑,GABA支路中GAD將谷氨酸直接脫羧生成GABA,因此GAD是GABA支路的限速酶[19]。由圖5可看出,單純經NaCl脅迫處理的發芽大豆子葉和胚中GAD活力顯著高于對照。4 d發芽大豆經NaCl聯合LaCl3或Heparin處理,其子葉中GAD活力均顯著低于單純經NaCl處理(p<0.05),胚中聯合LaCl3處理組顯著下降,而聯合Heparin處理組則與NaCl處理無顯著差異。這可能是由于植物GAD中存有鈣調素結合域,其活性受到細胞質內Ca2+濃度的影響,Matsumoto等利用Ca2+通道激活劑提高了蘆筍細胞內Ca2+濃度,進而提高GAD活力,因此,施用Ca2+通道抑制劑后導致了GAD活力下降,然而不同抑制劑對于GAD活力影響具有差異。

圖5　鈣離子通道抑制劑處理下發芽大豆GAD活性的變化Fig.5　Changes in GAD activity of germinating soybeanunder calcium channel inhibitor treatment

2.2.2AMADH活性AMADH是多胺降解途徑中的限速酶,其可將多胺經胺氧化酶氧化產生的4-氨基丁醛脫氫生成GABA[20]。由圖6可知,發芽期間各處理下發芽大豆AMADH活力變化趨勢具有顯著差異。NaCl脅迫處理4 d顯著提高了大豆子葉中AMADH活力(p<0.05),其活力為對照的1.38倍,而胚中則無顯著變化(p>0.05)。發芽4 d后,經NaCl聯合LaCl3或Heparin處理發芽大豆子葉中AMADH活力較NaCl處理組顯著下降,胚中LaCl3組則顯著低于NaCl及其聯合Heparin處理組。

圖6　鈣離子通道抑制劑處理下發芽大豆AMADH活性變化Fig.6　Changes in AMADH activity of germinating soybeanunder calcium channel inhibitor treatment

2.2.3GABA含量圖7顯示各處理下發芽大豆子葉和胚中GABA含量都隨發芽時間顯著增加(p<0.05)。發芽4 d,單純經NaCl處理的大豆子葉和胚中GABA含量顯著高于對照,子葉中為對照的1.61倍,胚中則為1.87倍。NaCl聯合LaCl3或Heparin處理后GABA含量與對照相比差異不顯著,但均顯著低于單純經NaCl處理,這是由于GABA合成兩途徑中的限速酶GAD和AMADH的活力受到Ca2+通道抑制劑的影響(圖5和圖6)。發芽4 d時，NaCl聯合LaCl3處理后,子葉和胚中GABA含量分別為NaCl處理的50%和79%,NaCl聯合Heparin處理則分別為70%和66%,表明Ca2+通道參與調控植物中GABA代謝,且抑制內源鈣庫的釋放對NaCl脅迫下GABA富集的影響小于抑制質膜鈣離子通道。

圖7　鈣離子通道抑制劑處理下發芽大豆GABA含量的變化Fig.7　Changes in GABA expression in germinating soybeanunder calcium channel inhibitor treatment

3　結論

相較單獨NaCl處理,大豆籽粒發芽4 d期間經NaCl聯合LaCl3(質膜鈣離子通道抑制劑)處理,發芽大豆的芽長顯著下降,發芽大豆生長受到進一步抑制,同時,鈣離子通道抑制劑顯著抑制了發芽大豆各部位脯氨酸含量;施用兩種鈣離子通道抑制劑均顯著降低了發芽大豆子葉中GAD和AMADH活力,而胚中GABA代謝限速酶活力變化趨勢不一致,且相較聯合Heparin處理,聯合LaCl3處理對GABA代謝限速酶活力影響較大,進而阻礙發芽大豆中GABA累積,但抑制效果存在差異,內源鈣庫的釋放對NaCl脅迫下GABA富集的影響小于質膜鈣離子通道。

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Physiological change and the regulation of γ-aminobutyric acid accumulation in germinated soybean under inhibitors of calcium channel treatment

YIN Yong-qi,LI Tong,WANG Shu-wen,SHI Ying-wu,GAO Lu,RAO Sheng-qi,YANG Zhen-quan,FANG Wei-ming*

(College of Food Science and Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225127,China)

The effect of membrane calcium channel inhibitor(LaCl3)and endometrium calcium channel inhibitor(Heparin)on the main physiological metabolism and γ-aminobutyric acid(GABA)accumulation in soybeans during germination under NaCl stress were investigated. Under NaCl combining LaCl3treatment,the growth of germinating soybeans was further suppressed,the sprout length decreased significantly,while no significant change was observed under heparin treatment. However,the respiratory rate both increased significantly under LaCl3and heparin treatment. Compared with NaCl treatment,rate-limiting enzyme activities of GABA metabolism in cotyledon decreased significantly under NaCl plus LaCl3or heparin treatment. Under LaCl3treatment,GABA content was 50% and 79% of the NaCl treatment in cotyledon and embryo,respectively. However,under heparin treatment,GABA content in cotyledon and embryo was 70% and 66% of the NaCl treatment,respectively. This result indicates that the inhibit effect of endogenous calcium stores on GABA content was smaller than membrane calcium channel.

germinated soybean;γ-aminobutyric acid;NaCl stress;inhibitor of calcium channel

2016-01-15

尹永祺(1988-)，男，博士，講師，研究方向：植物功能物質富集機理及技術，E-mail：yqyin@yzu.edu.cn。

方維明(1965-)，男，博士，教授，研究方向：農產品加工及貯藏，E-mail：wmfang@yzu.edu.cn。

國家自然科學基金青年科學基金項目(31501401)；江蘇省自然科學基金青年基金(BK20150448)；江蘇省高校自然科學研究面上項目資助(15KJB550010);江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目(SJLX16_0901)。

TS210.1

A

1002-0306(2016)16-0122-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.016