普洱茶茶褐素的分離研究

王天祿,杜麗平,劉　艷,馬立娟,肖冬光

(天津科技大學生物工程學院,天津 300457)

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普洱茶茶褐素的分離研究

王天祿,杜麗平*,劉艷,馬立娟,肖冬光

(天津科技大學生物工程學院,天津 300457)

為了了解普洱茶茶褐素的組成,對從普洱茶中提取的茶褐素進行了分離。通過比較不同樹脂對茶褐素的吸附與解吸能力,選擇AB-8大孔樹脂對普洱茶茶褐素進行分離,得到TBsP1和TBsP2兩個組分;進一步利用DEAE-52纖維素柱對TBsP1組分進行分離,得到6個組分;對茶褐素組分TBsP1、TBsP2以及TBsP1分離得到的6個組分的總糖、總酚和蛋白質的含量進行了分析,并進一步對各組分的單糖組成進行了分析。結果表明:不同組分的茶褐素其總糖、總酚和蛋白質的含量有一定的區別,TBsP1分離得到的4個主要組分單糖組成相似,含量不同,與從普洱茶生產原料曬青毛茶中提取的水溶性色素的單糖組成和含量有較大的差異。

普洱茶,茶褐素,AB-8大孔樹脂,DEAE-52,單糖組成

普洱茶是我國特有的,采用云南大葉種曬青毛茶經渥堆發酵制成,渥堆發酵過程中,茶多酚在微生物作用及濕熱作用下被氧化成茶黃素、茶紅素,茶黃素和茶紅素進一步氧化聚合[1],并結合多糖、蛋白質、脂質[2]等化合物形成茶褐素。茶褐素能溶于水而不溶于乙酸乙酯和正丁醇,是一類十分復雜的化合物,具有抗癌[3]、減肥降脂[4]、抗疲勞[5]等活性功能,化學組成及結構有待探明。

目前關于茶黃素的研究最為深入,已制備得到多種茶黃素單體[6],茶紅素的研究也取得一定進展[7],茶褐素則由于其組成、結構復雜,極性很大,分離純化的難度高,其研究進展緩慢。譚超[8]等利用原子力顯微鏡對不同分子量的茶褐素進行觀察,發現不同分子量的茶褐素粒子形貌并不均一。楊大鵬[9]利用硅膠層析對茶褐素進行分離,發現茶褐素為多羥基物質,含有烷基、羧基及苯環,主要的糖單位為葡萄糖。楊新河[10]等利用sephadex-LH20對茶褐素進行分級,得到六個級分,這些級分由兒茶素以外的多酚、蛋白質及多糖組成,但是各組分中總酚、總糖和蛋白質含量不同。

本研究從普洱茶中提取茶褐素,采用大孔樹脂將茶褐素分離成兩個不同極性的組分,再通過DEAE-52陰離子交換樹脂對極性較高,酚類含量低的組分按離子強度的差異進行分離,以期獲得數種不同性質的茶褐素部分,進一步對各部分的總糖、總酚和蛋白質的含量以及單糖糖組成進行研究,為研究茶褐素類物質組成、結構、功能提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

普洱茶天士力機采茶葉生產;陽離子交換樹脂001X7、D72、D61、D151,陰離子交換樹脂D280、D201、D301T,大孔吸附樹脂AB-8、D4006、NKA-9、D3520南開大學化工廠;DEAE-52陰離子交換樹脂北京華邁科生物技術有限公司;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)上海思域化工;三氟乙酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、硫酸、碳酸氫鈉、氯化鈉天津市光復科技有限公司，分析純;重蒸酚索萊寶;考馬斯亮藍G250、福林酚北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

N-1100旋轉蒸發儀日本東京理化;UV5200紫外可見分光光度計上海元析;Agilent 100高效液相色譜儀美國Agilent。

1.2實驗方法

1.2.1茶褐素的制備[9]普洱茶粉碎后,用95%乙醇浸提,每次8 h,浸提三次,至浸提液基本無色,除去醇溶性物質;剩余的茶粉用60 ℃熱水,按1∶20(w/v)的加水比浸提三次,合并三次浸提的茶湯,濾紙抽濾除去懸浮顆粒,60 ℃旋蒸濃縮,至濃縮液體積為濃縮前的1/10,依次用乙酸乙酯、二氯甲烷和正丁醇按1∶1(v/v)的比例對濃縮液進行萃取,每種有機溶劑萃取三次,得到剩余水層,60 ℃旋轉蒸發除去有機溶劑,凍干得到茶褐素粉末,復溶后4 ℃保存,備用。

1.2.2茶褐素化學成分測定總酚測定用福林酚法[11];總糖測定采用苯酚硫酸法[12];蛋白質的測定采用考馬斯亮藍法[13]。

1.2.3樹脂的選擇通過比較11種大孔樹脂對茶褐素的吸附和解吸情況,選擇合適的樹脂用于茶褐素的分離。

1.2.3.1樹脂的吸附率分別準確稱取2.0 g經過預處理后的各型號樹脂,置于50 mL廣口試劑瓶中,精確加入10 mL濃度為2 mg/mL的茶褐素溶液,以100 r/min速度于25 ℃恒溫搖床振蕩至吸附飽和后過濾,測定濾液中總酚、總糖的濃度,按式(1)計算樹脂的吸附率。

吸附率(%)=[(C0-Ce)/C0]×100

式(1)

式中:C0為吸附前茶褐素溶液中總酚(或總糖)濃度(mg/mL);Ce為吸附后茶褐素溶液中總酚(或總糖)濃度(mg/mL)。

1.2.3.2樹脂的解吸率用50%(v/v)乙醇溶液對吸附飽和的樹脂,于25 ℃下進行解吸,達到平衡后過濾,測定解吸液中總酚、總糖的濃度,按式(2)計算解吸率。

解吸率(%)=[Cr×Vr/(C0-Ce)×V0]×100

式(2)

式中:Cr為解吸液中的總酚(或總糖)濃度(mg/mL);Vr為解吸液的體積(mL);C0、Ce見式(1);V0為茶褐素溶液的體積(mL)。

1.2.4AB-8樹脂的靜態吸附研究

1.2.4.1靜態吸附曲線準確稱取經過預處理后的AB-8樹脂2.0 g分別置于18個30 mL廣口試劑瓶中,分別精確加入10 mL總酚濃度約0.4 mg/mL的茶褐素溶液,于25 ℃下進行靜態吸附,于30 min、1、2、4、6和8 h取一組(3瓶),過濾后測定溶液中總酚和總糖濃度,按公式(1)計算不同時間的吸附率。

1.2.4.2飽和吸附實驗準確稱取經過預處理后的AB-8樹脂2.0 g置于30 mL廣口試劑瓶中,分別精確加入10 mL總酚濃度為1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 mg/mL的茶褐素溶液,25 ℃靜態吸附8 h,測定溶液中茶褐素溶液的總酚濃度,按公式(3)計算樹脂的吸附量。

Q=(C0-Ce)×V0/W

式(3)

式中:Q為吸附量(mg/g);W為濕樹脂質量(g);C0、Ce見式(1);V0為茶褐素溶液的體積(mL)。

1.2.4.3pH對AB-8樹脂吸附的影響準確稱取經過預處理后的AB-8樹脂2.0 g,用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將總酚濃度0.4 mg/mL的茶褐素溶液的pH調為2.0、4.0、6.0、8.0和10.0,于25 ℃進行靜態吸附實驗,吸附飽和后,測定茶褐素溶液中總酚、總糖的濃度,并按式(1)計算樹脂的吸附率。

1.2.4.4乙醇濃度對AB-8樹脂解吸的影響配制濃度(v/v)為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇水溶液,分別對茶褐素飽和吸附的AB-8樹脂25 ℃下進行解吸,測定解吸液中的總酚濃度,并按式(2)計算解吸率。

1.2.5AB-8樹脂的動態吸附研究動態吸附在裝有AB-8樹脂的玻璃層析柱(1.6 cm×5 cm)中進行,樹脂體積約為10 mL(相當于6 g樹脂)。

1.2.5.1上樣濃度對AB-8樹脂動態吸附的影響準備總酚濃度分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL的茶褐素溶液,用1 mol/L HCl溶液調pH至4.0,準確取50 mL于25 ℃恒溫上樣,流速1 BV/h,上樣結束后用50 mL、pH4.0的去離子水沖樹脂柱,合并兩側的流出液,測定流出液中總酚和總糖的濃度,按式(1)計算吸附率。

1.2.5.2上樣流速對AB-8樹脂動態吸附的影響準確取50 mL總酚濃度為4.0 mg/mL的茶褐素溶液,用1 mol/L HCl溶液調pH至4.0,以流速為1、2、3、4、5、6 BV/h,25 ℃恒溫分別上樣,上樣結束后用等體積pH4.0的去離子水沖洗層析柱,收集流出液,并按式(1)計算其吸附率。

1.2.5.3上樣次數對茶褐素吸附的影響將上樣與沖洗的流出液合并,濃縮至約50 mL,測定濃縮流出液中的總酚和總糖濃度,重復上樣操作四次,計算每一次的吸附率。

1.2.5.4AB-8樹脂分離組分TBsP1與TBsP2AB-8樹脂通過重復上樣和洗脫收集未被吸附的組分TBsP1和被AB-8樹脂吸附后洗脫的組分TBsP2。

1.2.6DEAE-52陰離子交換樹脂對TBsP1組分進行分離

1.2.6.1DEAE-52線性洗脫準確稱取50.0 mg TBsP1溶解在1 mL去離子水中,在規格為1.6 cm×10 cm的DEAE-52層析柱中上樣,用1 mol/L NaCl溶液,于25 ℃進行線性梯度洗脫,流速3 BV/h,每5 mL收集一管洗脫液,用苯酚硫酸法測定490 nm下的吸光值,繪制線性洗脫曲線,確定梯度洗脫濃度。

1.2.6.2DEAE-52梯度洗脫準確稱取200.0 mg TBsP1溶于5 mL去離子水,上樣,用線性梯度洗脫中確定的NaCl濃度溶液于25 ℃洗脫,洗脫流速3 BV/h,最后用0.5 mol/L NaOH溶液對層析柱上的殘留物進行洗脫,用苯酚硫酸法測定490 nm下的吸光值,繪制洗脫曲線。收集各個洗脫組分，透析除鹽，凍干得到TBsP1的各分離組分。

1.2.7茶褐素的主要組分的單糖組成

1.2.7.1樣品處理根據Yuan等的方法對茶褐素主要組分的單糖組成進行分析[14]。準確稱取5.0 mg樣品溶于4 mL濃度為2 mol/L三氟乙酸中,充入氮氣封管,110 ℃水解4 h,加入4 mL甲醇后用氮氣吹干,重復3次,去除三氟乙酸;加入1 mL去離子水復溶,離心取上清,之后進行PMP衍生操作,得待檢測樣品。

1.2.7.2色譜條件色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18,4.6 mm× 250 mm i.d.,5 μm;流動相:0.1 mol/L磷酸鹽(pH6.7)緩沖液-乙腈(83∶17);柱溫:30 ℃;檢測波長:250 nm;流速:1 mL/min;進樣體積20 μL。

1.3數據處理

實驗中每個處理重復三次,Origin 8.1軟件作圖。

2　結果與分析

2.1樹脂的篩選

為了考察不同型號樹脂對茶褐素中酚類物質和糖類物質的吸附能力,按照1.2.3對11種型號的樹脂進行比較,實驗結果如圖1,由圖可知,11種樹脂對茶褐素的酚類和糖類的吸附能力明顯不同,001X7、D61、D72、D151和D4006樹脂對茶褐素的吸附能力較弱,其他類型的樹脂對茶褐素有較好的吸附,D301T對糖類和酚類的吸附能力都強,達不到將糖類和酚類分離的效果,D201和D280對茶褐素總酚和總糖吸附很強,解吸附發現:即使用2%(w/v)的NaOH溶液也難以解吸,說明其與茶褐素結合強度高,造成了死吸附,不適合對茶褐素進行分離。所以選擇NKA-9、D3520和AB-8樹脂進一步研究其解吸能力，結果如表1所示。

圖1　不同型號樹脂對茶褐素中總糖和總酚的吸附率Fig.1　Adsorption rate of different resins for total sugarand total phenol from puerh tea theabrownins

樹脂型號總酚解吸率(%)總糖解吸率(%)AB-890.5980.09D352081.8188.27NKA-977.0973.47

由表1可知,AB-8樹脂吸附茶褐素總酚的解吸率高達90%以上,是三種樹脂中解吸率最高的,而且對總糖的解吸率比較高,故選擇AB-8樹脂進行茶褐素的分離。

2.2AB-8樹脂對茶褐素的分離研究

2.2.1AB-8樹脂的靜態吸附與解析

2.2.1.1AB-8樹脂的茶褐素吸靜態附曲線由圖2可知,AB-8樹脂在吸附30 min時,總酚的吸附率就達62.95%,總糖吸附率達到19.34%,吸附1 h,總酚的吸附率達到了70.80%,總糖吸附率為30.97%,隨后吸附率變化不大。

圖2　AB-8樹脂靜態吸附曲線Fig.2　Static adsorption curve of AB-8 resin

2.2.1.2茶褐素總酚濃度對AB-8樹脂吸附的影響由圖3可知,當茶褐素中總酚濃度小于10 mg/mL時,AB-8樹脂的吸附量和濃度呈正比關系,當總酚濃度超過10 mg/mL時,AB-8樹脂對茶褐素中總酚的吸附量增加不大,AB-8樹脂對茶褐素中總酚的吸附量約為55 mg/g。

圖3　茶褐素總酚濃度對AB-8樹脂吸附的影響Fig.3　Effect of polyphenol concentration on adsorptioncapacity of AB-8 resin

2.2.1.3pH對AB-8樹脂吸附茶褐素的影響由圖4可知,pH對AB-8樹脂的吸附性能有一定的影響。粗提茶褐素溶液的pH大約為6.2～6.8,pH的變化會影響茶褐素中的酚羥基的解離,AB-8樹脂在pH為4.0時對總酚的吸附量達到最大,AB-8樹脂對總糖的吸附率隨著pH的上升而下降。pH過低或者過高都會影響氫鍵的形成,選擇pH4.0作為AB-8樹脂的最佳吸附pH。

圖4　pH對AB-8樹脂吸附率的影響Fig.4　Effect of pH on adsorption rates of AB-8 resin

2.2.1.4乙醇濃度對AB-8樹脂的茶褐素解吸影響由圖5可以看出,隨著乙醇濃度的提高茶褐素的解吸率逐漸上升,當乙醇濃度為60%時總酚的解吸率達91.64%,總糖的解吸率也達到了91.41%。當乙醇濃度達到70%時,總酚的解吸率開始降低,總糖的解吸率基本不變。推測茶褐素的極性較強,當乙醇濃度過高時可能會導致部分茶褐素的析出,從而使得解吸率下降。

圖5　乙醇濃度對解吸率的影響Fig.5　Effect of ethanol concentration on desorption rates of AB-8 resin

2.2.2AB-8樹脂的動態吸附

2.2.2.1上樣濃度對AB-8樹脂動態吸附的影響由圖6可知,當總酚濃度在小于4 mg/mL,總酚吸附率均在67%左右,當濃度高于4 mg/mL時吸附率迅速下降。可能是由于濃度過高會導致溶液中的茶褐素無法與樹脂充分接觸,達不到理想的吸附效果。

圖6　茶褐素濃度對吸附率的影響Fig.6　Effect of theabrwonin concentration on dynamic rates of AB-8 resin

2.2.2.2上樣流速對AB-8樹脂動態吸附的影響由圖7可知,當上樣流速小于4 BV/h時,吸附率都維持在65%,而流速高于4 BV/h時,吸附率大幅度降低。可能由于流速過高導致茶褐素與樹脂的接觸時間不夠,從而降低了吸附率。

圖7　上樣流速對吸附率的影響Fig.7　Effect of flow rates on dynamicadsorption rates of AB-8 resin

2.2.2.3重復上樣次數對吸附率的影響通過重復上樣和洗脫收集到未被吸附的組分TBsP1和被AB-8樹脂吸附后洗脫的組分TBsP2,由圖8可知,重復上樣3次和4次,AB-8樹脂對茶褐素中總酚和總糖的吸附率基本相同,選擇重復上樣3次。茶褐素經分離得到TBsP1和TBsP2,兩個組分的總糖、總酚和蛋白質含量如表2所示。

圖8　重復上樣次數對吸附率的影響Fig.8　Effect of sample-loading times on dynamic adsorption rates of AB-8 resin

組分總糖含量(%)總酚含量(%)蛋白質含量(%)TBs23.6925.539.53TBsP127.1817.104.44TBsP219.3328.9612.55

由表2可知,TBsP1組分中糖含量最高,達到27.18%,蛋白含量僅為4.44%,TBsP2中酚含量最高,為28.96%。選擇DEAE-52陰離子交換樹脂對TBsP1進一步分離,并對其單糖組成進行研究。

2.3DEAE-52陰離子交換樹脂分離TBsP1

按照1.2.6方法,繪制線性洗脫曲線如圖4a,確定洗脫用NaCl的濃度。根據圖9a中的出峰狀況,選擇去離子水、0.06、0.13、0.17、0.5 mol/L的NaCl進行洗脫,對未被洗脫的部分用0.5 mol/L的NaOH進行洗脫。

表4　茶褐素的主要分離組分的單糖組成

圖9　DEAE-52樹脂洗脫曲線Fig.9　DEAE-52 chromatography eluting curve注:a為DEAE-52樹脂線性洗脫曲線,b為DEAE-52樹脂梯度洗脫曲線。

由圖9b可知,經DEAE-52陰離子交換樹脂梯度洗脫峰較為對稱,可以認為各個茶褐素組分得到較好分離且組分性質較為單一,收集各個茶褐素組分,旋蒸濃縮,蒸餾水透析除去NaCl,凍干得到各個組分。按洗脫順序將各組分分別命名為TBsP1A、TBsP1B、TBsP1C、TBsP1D、TBsP1E、TBsP1F。各組分的得率分別為27.40%、9.56%、4.40%、3.08%、9.36%、19.76%。其總糖、總酚和蛋白質的含量如表3。

表3　DEAE-52陰離子交換柱分離的

由表3可知,經DEAE-52陰離子交換樹脂梯度洗脫得到的各個茶褐素組分的總糖,總酚以及蛋白含量均有區別。TBsP1A的總糖含量最高,為44.80%,總酚含量為2.60%;TBsP1B、TBsP1C、TBsP1D、TBsP1E中總糖和總酚的含量相近,TBsP1E中含有2.58%的蛋白質;TBsP1F中總酚含量要高于其他組分,蛋白質的含量也較高。

2.4茶褐素的主要分離組分的單糖分析

按照1.2.7用高效液相色譜對茶褐素分離所得單糖組分分析結果如表4所示。普洱茶生產原料曬青毛茶中提取的色素中Glc含量最高,摩爾百分比為57.77%,其次為Ara,摩爾百分比為18.28%。曬青毛茶經微生物作用后,茶褐素分離所得組分中單糖組成差異較大,其中Gal、Man、Rham、兩種酸性多糖有所增加,Glc的含量明顯變少。普洱茶茶褐素的不同分離組分的單糖摩爾百分比有差異,茶褐素的兩個粗分離組分中TBsP1中的GalA比例高于TBsP2,Glc比例低于TBsP2。TBsP1分離所得的幾個主要組分中,單糖的種類相似,摩爾百分比有區別,其主要單糖為GalA、Gal和Ara，另外兩個組分TBsP1C、TBsP1D量太少，未進行單糖組分分析。

3　結論

本文通過利用AB-8樹脂將茶褐素分離成兩種不同的極性的組分,兩個組分總糖、總酚、蛋白質含量不同,TBsP1中多糖含量較高,TBsP2中總酚含量最高。兩組分的單糖組成上也有區別,尤其是GalA和Glc的摩爾百分比差異較大。TBs-P1組分經DEAE-52分離后得到六種不同性質的組分,各個組分總糖、總酚和蛋白質含量均有區別,說明經過AB-8樹脂和DEAE-52樹脂分步層析分離,可以將不同性質的茶褐素組分進行分離。不同組分中多糖、多酚和蛋白質的結合程度也有所不同。茶褐素的主要分離組分單糖組成相似,各種單糖的摩爾百分比有差別,但與曬青毛茶相比差異較大,說明普洱茶發酵過程中,原料的糖類物質經微生物作用發生變化,并與多酚和蛋白質結合形成了茶褐素。有關普洱茶發酵過程中茶褐素形成方式、單糖組成的變化,各組分的結構特定、生理活性等還有待研究。

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Study on fractionation of theabrownins in Puerh tea

WANG Tian-lu,DU Li-ping*,LIU Yan,MA Li-juan,XIAO Dong-guang

(College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

In this paper,the adsorption and desorption properties of different macroporous resins for Puerh tea theabrownins was investigated,and AB-8 macroporous resins was selected for fraction. Two fractions,TBsP1 and TBsP2 were obtained from the separation of Puerh tea theabrownins by AB-8 macroporous resin. With using DEAE-52 cellulose chromatography for grading TBsP1,six theabrownins fractions were obtained. The monosaccharide compositions of TBsP1,TBsP2 and four major fractions of TBsP1 were analysised. The fractions of theabrownins were different in the contents of total sugar,total phenol and protein. The monosaccharides compositions of four major fractions were similar,and different in contents. Comparing with the water soluble pigments extracting from Puerh crude tea,the compositions and content of monosaccharides were significantly different.

Puerh tea;theabrownins;AB-8 macroporous resin;DEAE-52;monosaccharide composition

2015-12-29

王天祿(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：生物分離及現代釀造技術，E-mail：wangtianlu1990@126.com。

杜麗平(1967-)，女，博士，副教授，主要從事發酵工藝及分離分析方面的研究，E-mail：dlp123@tust.edu.cn。

教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”項目(IRT1166)。

TS272.2

A

1002-0306(2016)16-0136-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.019