Mycobacterium sp. BFZ304轉化植物甾醇產9α-羥基雄烯二酮培養基的響應面優化

柳相鶴,張瑞婕,趙樹欣,張保國,史吉平

(1.天津科技大學生物工程學院,天津 300457;2.中國科學院上海高等研究院,上海 201210 3.上海科技大學生命學院,上海 201210)

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Mycobacteriumsp. BFZ304轉化植物甾醇產9α-羥基雄烯二酮培養基的響應面優化

柳相鶴1,2,張瑞婕2,3,趙樹欣1,張保國2,*,史吉平2,3

(1.天津科技大學生物工程學院,天津 300457;2.中國科學院上海高等研究院,上海 201210 3.上海科技大學生命學院,上海 201210)

本研究以Mycobacteriumsp. BFZ304作為實驗菌株,研究了不同碳源、氮源、磷酸鹽等培養基成分對Mycobacteriumsp. BFZ304發酵轉化植物甾醇生產9α-羥基雄烯二酮的影響。在單因素實驗的基礎上,以9α-羥基雄烯二酮的產量為衡量指標,采用響應面法優化了轉化培養基的組成,并建立了玉米漿、葡萄糖、硝酸鈉、磷酸氫二銨變化的二次回歸方程,探討了各因子對9α-羥基雄烯二酮產量的影響。最終確定最適宜的轉化培養基為葡萄糖10 g/L、玉米漿40 g/L、硝酸鈉6 g/L、磷酸氫二銨0.7 g/L。在此條件下,底物植物甾醇添加量為10 g/L時,9α-羥基雄烯二酮的產量可達到4.86 g/L,底物植物甾醇的轉化率比優化前提高了近40%,具有極好的產業化前景。

Mycobacteriumsp. BFZ304,植物甾醇,9α-羥基雄烯二酮,響應面

甾體藥物作為僅次于抗生素的第二大藥物,人們對其的需求量不斷增加[1-2]。目前,以生物轉化方法催化合成甾體藥物越來越受到重視,相較于傳統化學合成方法,生物轉化具有產率高、專一性強、條件較溫和且環境友好等多種優勢,使其逐漸成為醫藥工業合成甾體藥物的先進技術手段[3-4]。9α-羥基雄烯二酮(9α-OH-AD)是一類重要的甾體醫藥中間體,利用9α-OH-AD作為前體物可以合成氫化可的松、17α-羥基黃體酮、依普利酮、β米松、地塞米松、可的松等多種重要的甾體原料藥,具有重要的商業價值[5-6]。利用分枝桿菌等微生物轉化植物甾醇生產甾體醫藥中間體9α-OH-AD,是當下甾體醫藥工業體系的一條重要工藝路線。因此利用不同微生物轉化甾醇制備9α-OH-AD的研究逐漸成為甾體激素類行業中又一個研究熱點[7-10]。在甾體微生物轉化過程中,微生物菌株的生長與培養基組成密切相關,培養基中的各種成分,對菌株的生長以及細胞內酶的表達都具有很大的影響[11-12]。同時培養基成分是影響微生物甾體轉化活性的主要因素,因此對培養基進行優化是提高微生物轉化甾醇生成9α-OH-AD的有效途徑。

考察培養基組分對產酶的影響通常采用的優化手段多為單因素實驗。因其未考慮各因素之間的交互作用,故無法提供未考察區域的信息,以及進行預測和控制。響應面法可同時對多因子水平及其交互作用進行優化與評價,并能快速有效地確定多因子系統的最優條件。近年來采用響應面法對生物反應過程進行優化已有一些報道,并取得了較好的優化結果[13-14]。

利用微生物轉化植物甾醇生產9α-OH-AD的內容在國內卻鮮有報道,本文通過單因素和響應面分析實驗優化培養基成分來提高分支桿菌轉化植物甾醇的發酵轉化效率,本研究通過微生物轉化方法,以Mycobacteriumsp. BFZ304作為實驗菌種,植物甾醇為底物,通過單因素和響應面分析實驗優化生物轉化培養基成分來提高底物轉化效率和產物的得率,以期為進一步工業化生產奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

Mycobacteriumsp. BFZ304本研究室自主篩選后鑒定保存;植物甾醇HPLC純度95%，江蘇越紅飼料有限公司;玉米漿N上海西王淀粉糖有限公司;山梨醇、牛肉膏、葡萄糖、淀粉、蛋白胨、酵母粉、甘油等有機碳氮源上海生工生物工程有限公司;(NH4)2HPO4、NaNO3、甲醇、乙酸乙酯等化學試劑均為分析純，國藥集團(上海)化學試劑有限公司;平板培養基酵母粉15 g,葡萄糖6 g,NaNO35.4 g,(NH4)2HPO40.6 g,瓊脂20 g,定容到1 L,pH7.8;種子培養基酵母粉15 g,葡萄糖6 g,NaNO35.4 g,(NH4)2HPO40.6 g,定容到1 L,pH7.8;初始轉化培養基葡萄糖5 g,蛋白胨5 g,NaNO36 g,NaH2PO40.5 g,定容到1 L,pH7.8。

RID-10A/SPD-20A型高效液相色譜儀日本島津公司;GC-2010Plus氣相色譜儀日本島津公司;PB-10型pH計德國Sartorius;BSA 224SCW型電子天平德國Sartorius;DU730型紫外分光光度計德國Beckman;BX51型顯微鏡日本OLYMPUS;ZHWY-2102C型恒溫培養振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2微生物培養及初始甾體轉化條件

將實驗室保藏的Mycobacteriumsp. BFZ304用平板培養基活化,于恒溫培養箱中30 ℃培養2～3 d后挑取單克隆接種到液體種子培養基中,30 ℃、130 r/min搖床培養48 h,獲得液體種子。實驗培養基中接入5%的液體種子,于30 ℃、130 r/min條件下搖床培養48 h后,補加10 g/L的植物甾醇進行發酵轉化,每隔12 h取樣測定相關物質的含量。植物甾醇轉化率計算公式如下:植物甾醇轉化率(%)=(產物9α-OH-AD濃度/投加底物植物甾醇濃度)×100

1.3培養基的優化方法

1.3.1氮源單因素實驗本研究以40 g/L的含氮水平添加玉米漿、酵母粉、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨作為氮源,其他條件不變,與以蛋白胨為主要氮源的轉化培養基作比較,實驗平行三次。

1.3.2碳源單因素實驗本研究以20 g/L的含碳水平添加山梨醇、蔗糖、甘油、乳糖、淀粉作為碳源,其他條件不變,與以葡萄糖為主要碳源的轉化培養基作比較,實驗平行三次。

1.3.3磷酸鹽單因素實驗保持其他條件不變,以10 g/L的含磷水平分別添加磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨,進行發酵轉化,根據9α-OH-AD濃度的大小確定最佳的磷酸鹽,實驗平行三次。

1.3.4響應面分析實驗方法根據單因素的實驗結果,選用葡萄糖、玉米漿、磷酸氫二銨、硝酸鈉為考察因素,采用Design-Expert 8.0軟件設計實驗并進行響應面分析,設計四因素三水平的響應面分析實驗,實驗因子和編碼水平如表1。

表1　響應面實驗因素水平表

1.4植物甾醇及9α-OH-AD的測定方法

對于一些自身結構中存在共軛結構的甾體化合物,如本研究中的目的產物9α-OH-AD可以利用高效液相色譜檢測該化合物在UV 254 nm下的吸收值,通過比對標準對照或者建立的標準曲線,可以測定產物的相對水平。對于在紫外光下無吸收的底物植物甾醇則可以通過氣相色譜檢測甾體化合物的含量。高效液相色譜(HPLC)檢測法:采用C18反相層析柱(Agilent Extend-C18,4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為70%甲醇:30%水(v/v),流速為1.0 mL/min;柱溫為32 ℃;紫外檢測波長為254 nm;進樣體積為20 μL。

氣相色譜(GC)檢測法:將發酵樣品用乙酸乙酯萃取后,與同體積的濃度為1 g/L的膽固醇內標參照物混合用于GC分析。采用島津2010 Plus氣相色譜儀進行GC分析;檢測器為FID檢測器,色譜柱為二甲基聚硅氧烷柱(30 m×0.25 mm× 0.25 μm);入口溫度為300 ℃,柱溫箱為320 ℃,FID檢測器溫度為300 ℃;載氣為氮氣,壓力為81.7 kPa,柱流量為1 mL/min,氫氣流量為40 mL/min,空氣流量為400 mL/min,氮氣流量為9.3 mL/min;進樣體積為1 μL;洗針溶液為乙酸乙酯。

1.5數據處理

本實驗通過Design-Expert 8.0軟件進行響應面實驗設計及數據分析并對最優結果進行預測驗證,采用Origin Pro8.5軟件進行數據處理。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1氮源的優化氮源主要用來構成菌體細胞物質和代謝產物,是微生物細胞需要量非常大的元素。不同氮源對Mycobacteriumsp. BFZ304轉化植物甾醇生成9α-OH-AD的影響如圖1所示。從圖1中可以看出,在多種氮源存在下,Mycobacteriumsp. BFZ304都可以轉化植物甾醇生成9α-OH-AD,幾種有機氮源中以玉米漿作為氮源時9α-OH-AD濃度最高達到2.98 g/L。可能是因為玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白和生長素,能為菌體生長提供更多的營養物質,有利于甾醇側鏈降解酶的合成。在無機氮源中以硝酸鈉為氮源時,9α-OH-AD的產量最大達到2.632 g/L,而以硫酸銨時,9α-OH-AD濃度最低。可能是因為當氨根離子被代謝后,培養基中生成H2SO4,導致pH降低,不利于反應的進行。由此實驗結果可知,微生物Mycobacteriumsp. BFZ304在轉化過程中既需要有機氮源的參與也需要無機氮源,其能夠較快利用無機氮源,在利用無機氮源的基礎上分解利用有機氮源,因此本實驗選擇玉米漿和硝酸鈉同時作為氮源用于后續的研究。

圖1　氮源對9α-OH-AD濃度的影響Fig.1　Effect of nitrogen source type on the concentration of 9α-OH-AD

2.1.2碳源的優化碳源作為分支桿菌培養基的基本成分之一,能夠為分支桿菌的生長代謝提供能量。同時它也是菌體細胞組成的原料,是菌體生長發育必需的能源物質,某些碳源是分支桿菌側鏈降解相關酶的誘導物,選擇適宜的碳源有利于定向促進某些酶的合成,增強分支桿菌的活性[15]。本研究中添加的不同碳源對Mycobacteriumsp. BFZ304轉化植物甾醇生成9α-OH-AD的影響如圖2所示。Mycobacteriumsp. BFZ304可以利用不同的碳源,但不同碳源類型對9α-OH-AD產量影響較大。當以葡萄糖為碳源時,9α-OH-AD的產量為2.21 g/L,高于其他的幾種碳源。因為葡萄糖是單糖,所以Mycobacteriumsp. BFZ304相對更容易利用葡萄糖,故選用葡萄糖作為Mycobacteriumsp. BFZ304轉化培養基的最佳碳源。

圖2　不同碳源對9α-OH-AD濃度的影響Fig.2　Effect of carbon source type on the concentration of 9α-OH-AD

2.1.3磷酸鹽的優化磷是核酸、蛋白質和輔酶的主要成分,可改變菌體的能荷狀態,磷酸鹽也是培養基中重要的緩沖鹽,使得培養基中pH不會隨菌體產酸而引起劇烈的變化[16]。Mycobacteriumsp. BFZ304對不同的磷酸鹽利用效果不盡相同,由圖3可知添加磷酸氫二銨的發酵液中9α-OH-AD含量最高,達到2.308 g/L,因此,選擇磷酸氫二銨作為最適磷酸鹽用于后續的研究。

圖3　磷酸鹽對9α-OH-AD濃度的影響Fig.3　Effect of phosphate on the concentration of 9α-OH-AD

2.2響應面實驗設計優化結果

2.2.1模型的建立及顯著性檢驗利用Design-Expert 8.0軟件進行統計分析。根據表2的實驗結果,對表中數據進行多元回歸擬合,得到Mycobacteriumsp. BFZ304發酵轉化植物甾醇產9α-OH-AD濃度(Y)對葡萄糖(X1)、玉米漿(X2)、硝酸鈉(X3)、磷酸氫二銨(X4)的多項回歸方程為:

Y=-6.8742+8.1052+2.0416+5.7826+69.8081+0.1090-1.2287+8.2500+0.4995-4.600+23.9889-4.3684-0.2744-6.8099-572.1833。

對實驗結果進行方差分析,結果如表3所示。

表2　響應面分析實驗結果

從表3可以看出建立的回歸模型極顯著(p<0.0001)說明方程擬合度較好;失擬項p=0.1007>0.05,說明失擬項不顯著,殘差由隨機誤差引起,模型選擇正確;復相關系數=0.9531,表明預測值和實測值之間具有很高的相關性;調整性決定系數=0.9062,表明方程模型可信度較高,能夠較好地描述實驗結果。

由表3可知,四因素中對9α-OH-AD產量影響從大到小的順序為X1、X4、X3、X2。X2對9α-OH-AD產量影響不顯著,X3對9α-OH-AD產量影響顯著,X1、X4的影響為極顯著,4因子的交互及二次項的影響均為極顯著。

2.2.2相應面優化及分析4因子的交互圖見圖4～圖9。

葡萄糖和玉米漿對9α-OH-AD產量的影響如圖4所示,當葡萄糖的添加量一定時,9α-OH-AD的產量隨著玉米漿添加量的增加而增大,但當玉米漿的添加量大于40 g/L時,9α-OH-AD的產量呈下降趨勢。當玉米漿的添加量一定時,隨著葡萄糖添加量的增加,9α-OH-AD的產量隨之增大,但當葡萄糖的添加量繼續增大時,9α-OH-AD產量逐漸降低。其他圖所反映出來的升降趨勢與圖4一致,故分析略。

三維圖反映出的結果與方差分析表所反映出的結果一致。在此基礎上,通過Design-Expert8.0軟件,進行分析計算,可得到Mycobacteriumsp. BFZ304發酵轉化植物甾醇產9α-OH-AD的最佳培養基配方為:葡萄糖10.00 g/L、玉米漿40.00 g/L、硝酸鈉6.00 g/L、磷酸氫二銨0.70 g/L,在此條件下9α-OH-AD的產量預測值可達4.96 g/L。

圖4　葡萄糖和玉米漿對9α-OH-AD產量影響的響應面立體分析圖Fig.4　Response surface for the effect of cross-interaction between corn steep liquor and glucose on the yield of 9α-OH-AD

圖5　葡萄糖和硝酸鈉對9α-OH-AD產量影響的響應面立體分析圖Fig.5　Response surface for the effect of cross-interaction between NaNO3 and glucose on the yield of 9α-OH-AD

圖6　葡萄糖和磷酸氫二銨對9α-OH-AD產量影響的響應面立體分析圖Fig.6　Response surface for the effect of cross-interaction between (NH4)2HPO4 and glucose on the yield of 9α-OH-AD

表3　9α-OH-AD產量多項式回歸模型方差分析

圖7　玉米漿和硝酸鈉對9α-OH-AD產量影響的響應面立體分析圖Fig.7　Response surface for the effect of cross-interaction between NaNO3 and corn steep liquor the yield of 9α-OH-AD

圖8　玉米漿和磷酸氫二銨對9α-OH-AD產量影響的響應面立體分析圖Fig.8　Response surface for the effect of cross-interaction between (NH4)2HPO4and corn steep liquor on the yield of 9α-OH-AD

圖9　硝酸鈉和磷酸氫二銨對9α-OH-AD產量影響的響應面立體分析圖Fig.9　Response surface for the effect of cross-interaction between(NH4)2HPO4 and NaNO3 on the yield of 9α-OH-AD

2.2.3響應面優化實驗結果的驗證考慮到實際操作的方便性,將以上組合校正為葡萄糖10 g/L、玉米漿40 g/L、硝酸鈉6 g/L、磷酸氫二銨0.7 g/L,在此條件下進行驗證實驗,結果如圖10所示。發酵轉化96 h時,產物9α-OH-AD的產量達到最大,為4.86 g/L,此時底物植物甾醇的殘留量為2.99 g/L,植物甾醇的轉化率為70.12%。

圖10　分支桿菌轉化植物甾醇生成9α-OH-AD的轉化過程Fig. 10　Time-course of the accumulation of products during phytosterol conversion by Mycobacterium sp.

3　結論

通過單因素優化實驗進行了培養基成分的篩選,確定了Mycobacteriumsp. BFZ304發酵轉化植物甾醇生產9α-OH-AD的培養基配方成分。在單因素實驗的基礎上,采用響應面實驗設計,對Mycobacteriumsp. BFZ304發酵轉化植物甾醇生產9α-OH-AD培養基進行了優化,通過實驗數據進行分析與評價,得到影響9α-OH-AD產量的二次多項式回歸模型,并對該模型進行顯著性檢驗。最終得到優化培養基組成為:葡萄糖10 g/L、玉米漿40 g/L、硝酸鈉6 g/L、磷酸氫二銨0.7 g/L,在此條件下9α-OH-AD的產量最高,預測值為4.96 g/L。對優化后的培養基進行驗證實驗,得到的結果為9α-OH-AD的產量為4.86 g/L,底物植物甾醇的殘留量為2.99 g/L,基本接近理論預測值,證明該模型合理。Mycobacteriumsp. BFZ304發酵轉化植物甾醇生產9α-OH-AD的培養基通過單因素及響應面的優化后,底物植物甾醇的轉化率達到70.12%,與初始轉化培養基植物甾醇轉化率(31.54%)相比提高了近40%。

目前國內外對微生物轉化植物甾醇生成9α-OH-AD的研究很少。其中袁家代等在分枝桿菌中異源表達3-甾酮-9α-羥基化酶基因,構建了9α-OH-AD菌株,植物甾醇經過該菌轉化后,發酵液中9α-OH-AD的含量僅為0.453 mg/L[17]。楊亞力等利用篩選到的偶發分枝桿菌轉化甾醇,9α-OH-AD的含量也小于1 g/L[18]。雖然本研究已經將底物的轉化率大大提高,但是還有很多底物未能被微生物所利用而損失掉,因此下一步工作可通過添加一些促進劑增大底物植物甾醇與菌體細胞的接觸面積進一步優化轉化工藝,提高植物甾醇的轉化率。

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Optimization of medium composition ofMycobacteriumsp. BFZ304 for the transformation of phytosterol to 9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione by response surface analysis

LIU Xiang-he1,2,ZHANG Rui-jie2,3,ZHAO Shu-xin1,ZHANG Bao-guo2,*,SHI Ji-ping2,3

(1.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China;3.College of Biotechnology,Shanghai Tech University,Shanghai 201210,China)

The influence of different carbon sources,nitrogen source,phosphate on 9α-OH-AD producted byMycobacteriumsp. BFZ304 was studied. On the base of single factors experiments,using 9α-OH-AD production as index response surface analysis was applied to optimize the fermentation medium composition. The quadratic regression analysis was applied to get the optimal level of main factors(corn steep liquor,glucose,NaNO3、(NH4)2HPO4). Finally determined the optimal medium were as follows:corn steep liquor 40 g/L,glucose 10 g/L,NaNO36 g/L,(NH4)2HPO40.7 g/L. Under these optimal conditions,the production of the 9α-OH-AD was high up to 4.86 g/L when the concentration of the feeding was 10 g/L,increased by 40% compared with the original medium. It would have a disirable prosfect.

Mycobacteriumsp. BFZ304;phytosterol;9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione;response surface analysis

2016-03-04

柳相鶴(1989-),女,碩士研究生,研究方向:甾體藥物微生物轉化,E-mail:liuxianghe2013@163.com。

張保國(1979-),男,博士,研究方向:甾體藥物微生物轉化,E-mail:zhangbg@sari.ac.cn。

國家自然科學基金(41106125)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0172-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.026