Bohai sea-9145重組脂肪酶基因工程菌的發酵表達條件優化

冉凡嬌,孫　謐,包　靜,郝建華

(1.農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室,青島市海洋酶工程重點實驗室,中國水產科學研究院黃海水產研究所,山東青島 266071;2. 上海海洋大學食品學院,上海 201306)

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Bohai sea-9145重組脂肪酶基因工程菌的發酵表達條件優化

冉凡嬌1,2,孫謐1,*,包靜1,郝建華1

(1.農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室,青島市海洋酶工程重點實驗室,中國水產科學研究院黃海水產研究所,山東青島 266071;2. 上海海洋大學食品學院,上海 201306)

為提高大腸桿菌(E.coli)基因工程菌產Bohai sea-9145重組脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)的能力,有效制備Bohai sea-9145脂肪酶。采用單因素實驗、Plackett-Burman實驗和Box-Behnken響應面設計實驗,對該重組酶基因工程菌的發酵表達條件進行了優化。最終確定的最佳條件是:接種量為1.5%,培養基的初始pH為8.0,誘導劑IPTG的添加時間為3.5 h,終濃度為0.5 mmol/L,誘導時間為15 h,誘導溫度為16 ℃,搖床轉速為200 r/min,經優化后該菌的產酶量是優化前的9.72倍。

Bohai sea-9145重組脂肪酶,基因工程菌,產酶條件優化,響應面分析

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是一類主要水解甘油三酯的酰基水解酶,可以將甘油三酯降解生成甘油二酯、單甘油酯和脂肪酸,是一種重要的工業酶制劑[1]。在食品[2-3]、制藥[4]、有機合成[5]、皮革[6]、日用化工[7]等方面具有非常廣闊的應用前景。

海洋微生物的生活環境較陸地微生物復雜多樣,來自海洋的微生物酶類比陸地微生物酶作用范圍更廣,應用前景更廣闊,已經成為各國科學家廣泛關注的熱點。Bohai sea-9145脂肪酶是一種來自海洋的新型低溫堿性脂肪酶,具有極大的發展潛力,其脂肪酶基因lipYp(1116 bp)來源于海洋酵母YarrowialipolyticaBohai sea-9145,該酵母于2004年由邵鐵娟等[8]從2000多份渤海海區海水海泥樣品中分離出來;隨后,董宏偉等[9]對該酶的分離純化條件及理化性質進行了研究,得到達到電泳純的脂肪酶,分子量為(40.0±1) ku;李忠磊等[10]采用基因重組和分子生物學相關技術,將該酶基因進行了異源表達。

本文的研究是在該酶大腸桿菌基因工程菌BL21的基礎上進行的,基因工程菌易繁殖、易培養、代謝快的特點使該酶的制備得以簡化,但產酶效率仍然不高,其酶液活力僅為121.38 U/mL。本文主要通過單因素實驗、Plackett-Burman實驗和Box-Behnken響應面分析設計實驗相結合的方法,對Bohai sea-9145大腸桿菌基因工程菌的發酵表達條件進行優化,提高該脂肪酶的制備效率。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

海洋解脂耶氏酵母(Y.lipolyticaBohaisea-9145)由本研究團隊自渤海海泥中分離并鑒定保存;埃希氏大腸桿菌(EscherichiacoliBL21 PET22-LiYp,E.coli)基因工程菌由本研究團隊構建并提供;對硝基苯基月桂酸酯(p-nitropHenyl laurate,pNP-laurate)、對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)、卡那霉素(kanamycin,Kana)、氨芐青霉素(ampicillin,Amp)和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)購自Sigma公司;蛋白胨和酵母粉購自英國Oxoid公司;Prestained Protein Marker購自New England Bio Labs公司;其它試劑均購自國藥集團;LB液體培養基胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,氯化鈉1%;LB固體培養基LB液體培養基加2%的瓊脂。

SHIMADZU UV-2550島津分光光度計購自日本島津公司;SHAKER型恒溫培養搖床購自上海市離心機械研究所;SW-CJ型超凈工作臺購自中外合資蘇州安泰空氣技術有限公司;20PR-52D高速冷凍離心機購自日立公司;LKB2219恒溫水浴購自瑞典BROMMA公司;ORION Model 818 pH計購自美國奧立龍;JY96-ⅡN型超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝科技生物股份有限公司;Bio-Rad Mini III蛋白電泳儀購自美國伯樂公司。

1.2實驗方法

1.2.1溶液的配制100 mg/mL Kana貯存液配制:1 g Kana溶于10 mL雙蒸水中,0.22 μm的濾膜過濾除菌,分裝后-20 ℃保存;2.38 g IPTG溶于10 mL雙蒸水或去離子水中,0.22 μm的濾膜過濾除菌,分裝后-20 ℃保存;脂肪酶測活A液,83.33 mg pNP-laurate溶于異丙醇定容至25 mL,4 ℃保存;脂肪酶測活B液,4.0 g Triton X-100溶于100 mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液中,定容至1 L,4 ℃保存。

1.2.2脂肪酶活性的測定參照李忠磊[10]和Hatzinikolaou[11]等的方法并加以改進。適宜條件下pNP-laurate作為底物,可被脂肪酶等摩爾的分解為pNP,其最大吸收峰在410 nm,因而檢測產物中的pNP在410 nm處的吸光度即可確定脂肪酶的酶活力。

將100 μL A液和1.5 mL B液混合置于35 ℃水浴中預熱3 min,隨后加入100 μL酶液(對照組選擇100 ℃滅活的酶液),繼續水浴6 min,反應結束后加入2.0 mL乙醇并冰浴終止反應,410 nm下測定其吸光值。

脂肪酶活力單位(U)定義為,在35 ℃,pH8.0的條件下,每分鐘催化底物水解產生1.0 μmol pNP所需的酶量。

1.2.3大腸桿菌工程菌發酵產酶的單因素實驗

1.2.3.1培養基初始pH對產酶的影響調整LB培養基的初始pH分別為6、7、7.5、8、8.5、9,保持其他條件相同對重組酶基因工程菌進行培養。培養結束后收集菌體并破碎細胞,檢測酶活性,以酶活力最高的數據為100%,計算相對酶活(以下同上)。

1.2.3.2接種量對產酶的影響調整培養基的初始pH為“1.2.3.1”項的最優值,將種子液分別按0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的接種量接種,其它條件同“1.2.3.1”。培養結束后收集菌體并破碎細胞,檢測酶活性。

1.2.3.3誘導劑添加時間對產酶的影響調整培養基的初始pH為“1.2.3.1”項的最優值,按“1.2.3.2”項的最適接種量接種,在37 ℃、200 r/min的條件下分別培養2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6 h,加入誘導劑IPTG進行誘導,并在每個時間段取樣測大腸桿菌的菌體濃度OD600,尋找最佳誘導時機。培養結束后收集菌體并破碎細胞,檢測酶活性。

1.2.3.4誘導劑終濃度對產酶的影響調整培養基的初始pH為“1.2.3.1”項的最優值,按“1.2.3.2”項的最適接種量接種,在“1.2.3.3”項優化的最佳時間加入誘導劑IPTG,調整其終濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、1.4 mmol/L。培養結束后收集菌體并破碎細胞,檢測酶活性。

1.2.3.5誘導溫度對產酶的影響根據以上實驗結果調整培養基的初始pH、接種量、誘導劑添加時間分別為最優值,讓加入誘導劑后的菌液分別在8、16、22、30、37 ℃下誘導培養過夜。培養結束后收集菌體并破碎細胞,并檢測酶活性。

1.2.3.6誘導時間對產酶的影響根據以上實驗結果分別調整培養基的初始pH、接種量、誘導劑添加時間、誘導溫度為最優值,將菌液分別誘導6、8、10、12、14、16、18、20、22 h。收集菌體并破碎細胞,檢測酶活性。

1.2.3.7搖床轉速對菌體產酶的影響根據以上實驗結果分別調整培養基的初始pH、接種量、誘導劑添加時間、誘導溫度、誘導時間為最優值,在搖床轉速分別為80、100、140、180、200、220、240 r/min的條件下進行培養。培養結束后收集菌體并破碎細胞,檢測酶活性。

1.2.4響應面法優化發酵條件

1.2.4.1用Plackett-Burman實驗篩選主要影響因子根據單因素實驗選取培養基初始pH、接種量、誘導劑添加時間、誘導劑終濃度、誘導時間、誘導溫度和搖床轉速共7個因素進行PB實驗，實驗設計見表1,為響應面法優化產酶條件篩選主要影響因子[12]。

1.2.4.2利用Box-Behnken響應面設計確定最佳配方根據PB實驗結果,本設計選取誘導劑添加時間、誘導溫度、誘導時間作為響應面實驗的主要影響因子(其他條件按單因素實驗最優結果),各因素及水平如表2所示。

表1　Plackett-Burman設計因子水平

表2　響應面因子及水平

1.3數據處理

單因素實驗每個因素重復三次,采用Microsoft Office Excel 2003處理數據并作圖;Plackett-Burman和Box-Behnken實驗采用Design Expert 8.0.5.0軟件進行數據處理并作圖。

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果

2.1.1培養基初始pH對產酶的影響外部環境的pH會影響基因工程菌的生長和代謝,一般來說大腸桿菌的最適生長pH在6.0～8.0范圍內,不同類型的重組工程菌,適合其外源蛋白表達的pH是不同的。如圖1所示,當培養基初始pH在7.5～8.5范圍內時較適合外源蛋白的表達,因而相對酶活較高,當pH為8.0時,相對酶活達到最大值。因此,本實驗確定培養基的初始pH為8.0。

圖1　培養基初始pH對菌株產酶的影響Fig.1　The effect of different initial pH of the medium on the production of enzyme

圖2　不同接種量對菌株產酶的影響Fig.2　The effect of different amount of inoculation on the production of enzyme

2.1.2接種量對產酶的影響如圖2所示,當接種量從0.5%增加到1.5%時,隨著接種量的增大,相對酶活呈上升趨勢,這是因為在此過程中細菌生長速度的加快使菌濃度增加,蛋白表達量升高,酶活隨之增大,當接種量為1.5%時,相對酶活達到最大值,當接種量繼續增大時,由于細菌生長過快,代謝產物積累過多,影響了后期蛋白的表達,產酶量開始降低。因此,本實驗確定的最佳接種量為1.5%。

2.1.3誘導劑添加時間對產酶的影響誘導劑添加的越晚,菌體密度越高,但菌體相對較老,蛋白表達效率會降低。誘導劑添加的越早,細菌越快從生長階段進入表達階段,但由于菌體總密度較低,因而蛋白表達量不高[13]。因此需要對該菌的菌體濃度進行分析,并選擇合理的時間添加誘導劑。如圖3所示,當OD600在0.6～0.8的范圍內,即種子液培養后的2.5～4 h內添加誘導劑IPTG時,相對酶活處于較高狀態,當培養至3.5 h(OD600=0.75)添加誘導劑IPTG時,相對酶活達到最高值。因此,本實驗確定誘導劑IPTG的添加時間為3.5 h(即OD600=0.75時)。

圖3　誘導劑添加時間對菌株產酶的影響Fig.3　The effect of different timeto add inducing agent on the production of enzyme

2.1.4誘導劑終濃度對產酶的影響誘導劑IPTG的濃度與蛋白表達的速度相關,高濃度的IPTG會加快外源蛋白的表達,但是IPTG具有一定的細胞毒性,濃度過高時會降低細胞的活性。從圖4中可以看出當誘導劑濃度在0.3～0.7 mmol/L時,菌體表達外源蛋白的速率較高,酶活維持在相對較高的狀態,當誘導劑終濃度為0.5 mmol/L時的相對酶活最大。因此,本實驗確定誘導劑的終濃度為0.5 mmol/L。

圖4　誘導劑終濃度對菌株產酶的影響Fig.4　The effect of different inducerconcentration on ezyme production

2.1.5誘導溫度對產酶的影響降低溫度可以減緩菌體生長的速度,降低蛋白表達的速率,延長蛋白表達的時間。如圖5所示,當誘導溫度為8 ℃時,由于溫度過低,外源蛋白表達的速率較低,因而酶活較低;當誘導溫度為16 ℃時,相對酶活最高;當誘導溫度繼續升高時,外源蛋白表達速率加快,形成的不溶性包含體增多,因而酶活逐漸降低。從圖6 SDS-PAGE電泳圖中可以看出,當誘導溫度為16 ℃時的蛋白表達量最高,這一結果與圖5結果相符合,說明16 ℃是該酶表達蛋白的最佳誘導溫度。因此,本實驗確定誘導溫度為16 ℃。

圖5　不同誘導溫度對菌株產酶的影響Fig.5　The effect of different induced temperature on the production of enzyme

圖6　不同誘導溫度樣品蛋白的SDS-PAGE條帶Fig.6　SDS-PAGE analysis of the protein by different induce temperature注:M:標準蛋白;1～5:8、16、22、30、37 ℃誘導的樣品。

2.1.6誘導時間對產酶的影響如圖7所示,當誘導時間為6～14 h時,菌體密度逐漸升高,蛋白合成旺盛,酶活隨誘導時間的延長而提高,在14 h時達到最高值,當誘導時間超過14 h時,菌體由于生長時間過長而衰退,酶活逐漸降低。SDS-PAGE分析結果如圖8所示,當誘導時間為14 h時的蛋白含量最高,說明誘導總時間為14 h時可以較好的表達重組酶蛋白。因此,本實驗確定誘導時間為14 h。

圖7　不同誘導時間對菌株產酶的影響Fig.7　The effect of different induced time on the production of enzymy

圖8　不同誘導時間下樣品蛋白的SDS-PAGE條帶Fig.8　SDS-PAGE analysis of the protein by different induce time注:M:標準蛋白;1～9:誘導6、8、10、12、14、16、18、20、22 h的目的條帶。

2.1.7不同搖床轉速對產酶的影響如圖9所示,當搖床轉速從80 r/min增加到200 r/min時,發酵液中的溶氧隨轉速增加而升高,菌體生長速度加快,酶活逐漸增加,當搖床轉速為200 r/min時酶活最高,轉速繼續增加后,發酵液中泡沫增多,影響溶氧,菌體生長減緩,酶活降低。因此,本實驗確定搖床轉速為200 r/min。

圖9　不同搖床轉速對菌株產酶的影響Fig.9　The effect of different rotation speed on enzyme production

2.2響應面法優化產酶條件

2.2.1Plackett-Burman實驗篩選主要影響因素PB實驗結果見表3,方差分析見表4。從表4可以看出,誘導劑添加時間、誘導溫度、誘導時間的p值均小于0.05,是顯著影響因子,三者貢獻值之和達89.31%,其中誘導劑添加時間的貢獻值為58.24,是最顯著的影響因子。

表4　PB實驗分析

表3　PB實驗設計及結果

2.2.2Box-Behnken響應面設計法確定最佳配方本實驗在單因素實驗及PB實驗結果的基礎上,以Bohai sea-9145脂肪酶酶活作為響應值Y,采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應值之間的函數關系,設計三因素三水平的響應面分析實驗,通過回歸方程,優化工藝參數,預測響應值,并對影響實驗結果的因子及其交互作用進行評價,確定最佳發酵表達條件。每組實驗做三組平行,取其平均值,實驗設計及結果如表5所示。

表6　響應面模型的方差分析表

表5　Box-Behnken設計方案及結果

從表6可以看出該響應面模型是顯著的,F值為829.46表示僅有0.01%的可能是由噪音引起的,其中,A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2的p值均小于0.05，是顯著模型項,同時失擬F值為3.85(p=0.1127)表示該模型的失擬項不顯著,方程的R2等于0.9979,說明酶活實測值與預測值擬合度較好,該模型能較好的解釋菌株產酶量的變化。二次多項式回歸方程為:

Y=1170.74+82.79A+25.65B+43.46C-14.28AB+29.43AC+9.23BC-357.54A2-140.63B2-165.36C2

根據上面的方程繪制的響應面分析如圖10所示,從圖10中可以看出AB、AC的曲面較明顯,交互作用較大,A-誘導劑添加時間和B-誘導溫度與酶活的關系呈標準的拋物線型,且有一極大值點,說明酶活隨誘導溫度升高和誘導劑添加時間的增加而提高,當誘導劑添加時間為3.5 h,誘導溫度為16 ℃時的酶活達到其極大值點,當誘導劑添加時間繼續延長,誘導溫度繼續升高時酶活降低,說明此時的誘導劑添加時間及溫度不適宜外源蛋白的表達,對AC的交互作用同理可分析。

圖10　兩因子之間相互作用的3D圖Fig. 10　Contour plot of effects of the interaction of two factors on the production of lipase

2.2.3驗證實驗對回歸方程求導可以得到模型的極值點,理論上當誘導劑添加時間為3.68 h,誘導溫度為16.54 ℃,誘導時間為15.16 h時,單位酶活達到其最大響應值,理論最大酶活為1180.38 U/mL。

為方便實驗操作,將實驗條件定為:誘導劑添加時間為3.5 h,誘導溫度16 ℃,誘導時間15 h,在該條件下進行搖瓶發酵,實際測定的平均單位酶活為1170.56 U/mL,該值與理論值相接近,證明此響應面模型是可靠的,可以有效優化該基因工程菌的發酵表達條件。

3　結論

本文以單因素實驗、Plackett-Burman和Box-Behnken響應面設計實驗相結合的方法,對影響Bohai sea-9145重組脂肪酶工程菌產酶的各因素進行分析,得出的結論如下:

Bohai sea-9145重組脂肪酶工程菌的最佳發酵表達條件為：調整培養基的初始pH為8.0,按1.5%的接種量接種,在種子液培養3.5 h后加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導劑IPTG,在16 ℃、200 r/min的條件下誘導15 h。經過上述優化后，該基因工程菌所產重組脂肪酶的酶活最高為1170.56 U/mL,是優化前的9.72倍,該結果極大提高了Bohai sea-9145海洋重組脂肪酶的制備效率,為該酶的進一步研究奠定基礎。

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Optimization of fermentation and expression conditions for production of marine lipase by Bohai sea-9145

RAN Fan-jiao1,2,SUN Mi1,*,BAO Jing1,HAO Jian-hua1

(1.Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries,Ministry of Agriculture,Qingdao Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering,Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China;2.College of Food Science & Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

To effectively improve the production of the Bohai sea-9145 lipase,single factor experiment,PB experiment and BB surface response experiment were used to optimize the fermentation conditions of the recombinant strain Bohai sea-9145. The optimal conditions were as follows:the initial pH value of the medium was 8.0,the inoculation amount was 1.5%,and after 3.5 hours of incubation,the expression of the lipase was induced by adding IPTG to a final concentration of 0.5 mmol/L at 16 ℃ for 15 hours with the shaking speed of 200 r/min. After optimization,the final activity of the recombinant lipase was increased by 9.72 times.

Bohai sea-9145 recombined lipase;genetic engineering bacteria;fermentation conditions;analysis of response surface

2016-03-11

冉凡嬌(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品工程， E-mail:ranfanjiao@sina.com。

孫謐(1962-)，女，研究員，研究方向：海洋產物資源與酶工程，E-mail:sunmi@ysfri.ac.cn。

國家自然科學基金-聯合基金項目(U1406402-5)；國際科技合作與交流專項(2014DFG30890)資助。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0178-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.027