響應面法優化重組運動發酵單胞菌極高密度乙醇發酵工藝

曹尚志,黃樂滔,羅　娟,上官敏敏,鄧　穎,汪浩勇

(湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室,湖北武漢 430068)

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響應面法優化重組運動發酵單胞菌極高密度乙醇發酵工藝

曹尚志,黃樂滔,羅娟,上官敏敏,鄧穎,汪浩勇*

(湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室,湖北武漢 430068)

采用基因工程技術,成功地構建了在無需氨基酸和維生素的條件下,能高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖發酵生成乙醇的重組菌Z.mobilisHYMX。為了提高發酵乙醇產量,利用響應面法優化了重組菌極高密度發酵的工藝條件。結果表明,最佳發酵條件為:葡萄糖濃度305 g/L,溫度34 ℃,pH6.5,尿素濃度3 g/L,接種量10%,發酵時間60 h。在此條件下重組單胞菌的乙醇產量達到153.1 g/L,比優化前提高了8.5%,比原型菌產量提高了105.14%。與工業酵母菌株PE-2相比重組菌節省了約12%的葡萄糖,節省了37.5%的時間。

重組運動發酵單胞菌,響應面法,發酵條件,乙醇產量

當今世界能源問題、環境問題日益嚴峻,對燃料乙醇的應用與發展的研究,不僅能為當代的生物能源開發利用提供借鑒,同時還可以緩解全球性的能源危機,減少傳統能源引起的環境問題[1]。能源危機促使乙醇發酵菌種的研究,用低成本產生最大化的乙醇以滿足日益增長的需要。酵母菌株PE-2是文獻報道最終乙醇產量最高的乙醇發酵菌種。30%的巴西乙醇工廠采用酵母菌株PE-2,全世界超過10%的乙醇來自酵母菌株PE-2發酵。Pereira FB,Guimaraes PMR等人用重組酵母菌株PE-2在葡萄糖濃度為343 g/L,發酵96 h條件下得到乙醇產量為151 g/L[2]。

運動發酵單胞菌(Z.mobilis)被認為是進行乙醇生產最合適的細菌之一,是良好的燃料乙醇生產菌種[3]。與其它微生物相比,該菌代謝途徑相對簡單,通過2-酮-3脫氧-6磷酸葡萄酸(ED)途徑高效專一代謝葡萄糖、果糖生產乙醇[4]。本文用Tn5轉座技術,向Z.mobilis基因組整合了13個基因(xylA、xylB、araB、araA、araD、manA、tktA、talB、metB、yfdZ、FAR、WS/DGAT、TesA),構建出重組菌Z.mobilisHYMX。

響應面分析法[5-7]可以進行實驗組合設計,其在實驗室和現實工廠生產研發中應用廣泛。為了使重組菌乙醇產量最大化,利用響應面分析法對重組菌高濃度葡萄糖的發酵工藝條件進行優化,對后續的高糖濃度發酵生產乙醇以及工業化研究具有指導意義。

表1　PB實驗水平

1　材料與方法

1.1材料與儀器

運動發酵單胞菌(Z.mobilis)來自ATCC31821;大腸桿菌(E.coliK12)由作者實驗室保藏;重組運動發酵單胞菌(Z.mobilisHYMX)本次構建;Pfu DNA聚合酶購自NEB公司;T4 DNA 接酶和各種限制性內切酶購自大連寶生物公司;質粒小量抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自長沙安比奧生物技術公司;酵母粉購自安琪酵母有限公司;葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、尿素及其余試劑均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

My cycle型PCR儀美國Bio-rad;Micro Pulser型電轉化儀美國Bio-rad;UV-2000型分光光度計上海尤尼柯儀器有限公司;GC7890F氣相色譜儀上海天美科學儀器有限公司;DYY7C電泳儀北京六一儀器;IMS-20全自動制冰機常熟學科電器有限公司;DNP-9052電熱恒溫培養箱上海精宏科學儀器廠;Tanon-2500凝膠成像系統上海天能科技有限公司;GC7890F氣相色譜儀上海天美科學儀器有限公司。

1.2培養基

種子與活化培養基:100 g/L葡萄糖,10 g/L酵母提取物,1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,調節至pH6.0,115 ℃滅菌30 min。

基礎發酵培養基:290 g/L葡萄糖,10 g/L酵母提取物,1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,調節至pH6.0,115 ℃滅菌30 min。厭氧條件下32 ℃發酵60 h。

無氨基酸和維生素培養基:不同質量濃度的還原糖(葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖),1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,調節至pH6.0,115 ℃滅菌30 min。厭氧條件下32 ℃發酵60 h。

1.3實驗方法

1.3.1重組菌Z.mobilisHYMX構建方法利用PCR重疊技術,將各個功能基因序列融合,構建出需要的轉座子。然后將克隆的轉座子連接到運動發酵單胞菌轉座載體上,最后將連接好的轉座載體轉座到Z.mobilis基因組上得到重組菌Z.mobilisHYMX[8]。

1.3.2重組菌還原糖利用及無氨基酸和維生素條件下的發酵驗證無氨基酸和維生素培養基成分如下:葡萄糖(100、140、180 g/L)、1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,pH6.0。10%接種量,厭氧條件下32 ℃靜置發酵60 h。

配制還原糖無氨基酸和維生素培養基成分如下:60 g/L(木糖、阿拉伯糖、甘露糖),1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,pH6.0。10%接種量,厭氧條件下32 ℃靜置發酵60 h。

1.3.3單因素實驗對影響運動發酵單胞菌基因工程菌發酵產乙醇的幾個因素做單因素實驗,主要有溫度、發酵時間、初始pH、初始葡萄糖濃度、接種量、尿素濃度。

選取5個溫度梯度:28、32、34、36、40 ℃,接種量10%,葡萄糖濃度290 g/L,尿素濃度1 g/L,pH6,發酵60 h;5個時間梯度:40、50、60、70、80 h,接種量10%,葡萄糖濃度290 g/L,溫度32 ℃,尿素濃度1 g/L,pH6;5個初始pH4、5、6、7、8,接種量10%,葡萄糖濃度290 g/L,溫度32 ℃,尿素濃度1 g/L,發酵60 h;5種初始葡萄糖濃度:270、280、290、300、310 g/L,接種量10%,溫度32 ℃,尿素濃度1 g/L,pH6,發酵60 h;5種接種量:5%、8%、10%、12%、15%(V/V),葡萄糖濃度290 g/L,溫度32 ℃,尿素濃度1 g/L,pH6,發酵60 h;5種尿素濃度:1、2、3、4、5 g/L,接種量10%,葡萄糖濃度290 g/L,溫度32 ℃,pH6,發酵60 h。

各種條件下培養基中還需加入10 g/L酵母提取物,1 g/L磷酸二氫鉀,0.5 g/L七水硫酸鎂,厭氧靜置發酵。

1.3.4Plackett-Burman實驗根據單因素實驗結果,分別為葡萄糖濃度(g/L)、初始pH、發酵溫度(℃)、發酵時間(h)、接種量(℃)、尿素濃度(℃);每個因素分別取高(1)、低(-1)兩個水平,應用Design-Expert8.0進行實驗設計和分析,以乙醇產量為響應值,共進行12組實驗，實驗設計見表1。

1.3.5爬坡實驗根據Plackett-Burman實驗,設計爬坡實驗,找到逼近最大響應值的區域。

1.3.6中心組合(CCD)實驗方法根據最陡爬坡實驗結果,顯著因素以中心點為零水平,用Design Expert 8.0軟件設計中心組合實驗并進行響應面分析，實驗設計見表2。

表2　CCD實驗水平

1.3.7乙醇測定的方法乙醇產量采用氣相色譜儀測定,計算方法為內標法,以正丁醇為內標物[9-10]。

2　結果與分析

2.1重組菌構建與初篩

本實驗以多種不同種屬來源細菌的基因組為模板,首先分別克隆了xylA、xylB、araB、araA、araD、manA、tktA、talB、metB、yfdZ、FAR、WS/DGAT和TesA,經過測序確認DNA序列無誤后,構建其能在Z.mobilis中表達的操縱子。將13個操縱子按圖1的順序連接成一個連續的DNA分子,構建Tn5轉座載體。其中,xylA、xylB、araB、araA、araD、manA、tktA、talB操縱子[11-12],使細菌獲得利用木糖、阿拉伯糖、甘露糖的能力。metB、yfdZ操縱子[13]使細菌可以在無氨基酸和維生素的培養基中生長和發酵生產乙醇。由于有文獻報道乙醇耐受細菌體內的脂肪酸含量明顯增加,構建了TesA、FAR和WS/DGAT[14-15]操縱子,用于增加細菌體內脂肪酸的含量。

實驗中將如圖1所示的Tn5轉座子整合到Z.mobilis的基因組上。取轉座載體10 μL與5 μL的Tn5轉座酶混合,37 ℃水浴2 h,取3 μL與Z.mobilisCP4感受態細胞混合,電擊后用種子培養基32 ℃培養4～6 h[16]。

將培養后的重組運動發酵單胞菌的菌液離心去上清,用無菌生理鹽水稀釋,涂板到30 g/L木糖、30 g/L阿拉伯糖或30 g/L甘露糖為唯一碳源的固體平板中培養。將PCR鑒定正確的陽性轉座子,加入等體積的40%滅菌甘油,放在-80 ℃冰箱保存。

圖1　轉座子的示意圖Fig.1　Schematic diagram of transposon

2.2重組菌還原糖利用及不添加氨基酸和維生素發酵驗證

由表3可知重組菌在三種葡萄糖濃度的無氨基酸和微生物培養基中發酵產量達到了50、69.5、88.5 g/L。說明重組菌可以在無氨基酸和無維生素培養基中高效發酵葡萄糖生產乙醇。

表3　無氨基酸和維生素的發酵驗證結果

由表4可知最終乙醇產量分別為20.5、18.2、24.3 g/L,說明重組菌可以很好的利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖生產乙醇。

表4　重組菌還原糖發酵驗證結果

2.3單因素實驗

2.3.1溫度對乙醇產量的影響不同溫度對乙醇產量的影響結果如圖2所示,開始時隨著溫度的提高,乙醇產量提高明顯,在32 ℃和34 ℃時乙醇產量分別為141.3 g/L和141.5 g/L。隨著溫度的進一步提高到36 ℃時,乙醇產量下降到129.6 g/L,下降了8.5%。當溫度達到40 ℃時,乙醇產量只有112.8 g/L,所以選取32 ℃是最合適的溫度,溫度繼續提高不僅不能提高乙醇產量還會提高成本消耗更多能量。

1.3 排除標準 ⑴20歲以下的AECOPD患者；⑵合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤等終末期疾病、嚴重代謝性疾病、嚴重肝腎功能障礙的患者；⑶非實施本病綜合救治原因死亡的患者。

圖2　溫度對乙醇產量的影響Fig.2　Effect of temperature on ethanol yield

2.3.2發酵時間對乙醇產量的影響不同發酵時間對乙醇產量的影響結果如圖3所示,隨著發酵時間的增加乙醇產量在增加,在70 h達到最大值145.4 g/L,發酵時間80 h時,乙醇產量有所下降,只有141.9 g/L,但是在發酵時間60 h時乙醇產量141.5 g/L與70 h相比乙醇產量相差較小,綜合考慮能耗成本等因素,選擇60 h為最合適發酵時間。

圖3　發酵時間對乙醇產量的影響Fig.3　Effect of fermentation time on ethanol yield

2.3.3初始pH對乙醇產量的影響不同初始pH對乙醇產量的影響結果如圖4所示,開始時pH的增大使乙醇產量增加,在pH6.0時乙醇產量最高為141.3 g/L。pH再增大,乙醇產量開始下降,所以pH6.0是最合適的發酵初始pH。

圖4　初始pH對乙醇產量的影響Fig.4　Effect of initial pH on ethanol yield

2.3.4葡萄糖濃度對乙醇產量的影響不同葡萄糖濃度對乙醇產量的影響如圖5所示,隨著葡萄糖濃度的增加乙醇產量在提高,在300 g/L時產量最高為145.3 g/L,但是在葡萄糖濃度達到310 g/L時,乙醇產量下降明顯,所以300 g/L的葡萄糖濃度為合適的發酵濃度。

圖5　葡萄糖濃度對乙醇產量的影響Fig.5　Effect of glucose concentration on ethanol yield

2.3.5接種量對乙醇產量的影響不同接種量對乙醇產量影響如圖6所示,開始隨著接種量的增加,乙醇產量增加明顯,在10%接種量時產量達到最高為141.3 g/L。隨著接種量的增加,乙醇產量反而下降,所以10%接種量最合適。

圖6　接種量對乙醇產量的影響Fig.6　Effect of inoculation amount on ethanol yield

2.3.6尿素濃度對乙醇產量的影響不同尿素對乙醇產量影響如圖7所示,可以看到尿素對乙醇產量的影響較小,而尿素濃度在3 g/L時乙醇產量最高為合適濃度,此時產量最高為142.8 g/L。

圖7　尿素濃度對乙醇產量影響Fig.7　Effect of urea concentration on ethanol yield

2.4Plackett-Burman實驗結果分析

PB實驗設計及結果見表5,各因素顯著性水平分析見表6。根據表6數據可知,模型p值<0.0001,說明該模型非常顯著可信度高。A、C、D的p值均<0.01表明A、C、D因素極顯著。因此,溫度、初始pH及葡萄糖濃度對乙醇產量R影響極顯著,而且由表6可知這三個因素對乙醇產量的總貢獻值達到98%以上,因此在后續實驗中主要考慮這三個因素。

表5　Plackett-Burman實驗設計及結果

注:G、H、I、J、K、L表示虛擬因素。

2.5最陡爬坡實驗結果與分析

根據表6結果可知溫度、初始pH均為負效應,葡萄糖濃度為正效應,設計爬坡實驗方案及結果如表7。由表7可知第四組實驗最接近最佳值區域,即葡萄糖濃度為300 g/L,溫度為31 ℃,pH為6.5時乙醇產量達到最高為147.8 g/L。

表7　最陡爬坡實驗設計與結果

2.6響應面實驗設計及結果

由最陡爬坡實驗確定了最重要影響因素的取值區域。利用Design Expert軟件設計進行CCD實驗設計及結果見表8,以X1、X2、X3、Y分別表示葡萄糖濃度、溫度、pH、乙醇產量。

表6　Plackett-Burman實驗結果方差分析

表9　CCD實驗結果方差分析

表8　CCD實驗設計及結果

2.7響應面圖、最適發酵條件的確定及驗證實驗

根據上述的回歸方程用Design Expert繪出響應面分析圖8。等高線可以反映各因素的交互作用,響應面越陡說明交互作用越明顯,由圖8可知,這三個因素交互作用不顯著,響應面圖都是接近圓形而非陡峭的橢圓形。由響應圖可知該拋物線圖形均開口向下,說明方程確實存在最大值,對上述二次多項回歸模型方程逐步回歸,以及通過表8、表9得到發酵乙醇的最佳條件為溫度34 ℃,葡萄糖濃度為305 g/L,pH6.5,在此條件下進行驗證實驗,重復實驗6次,平均值為153.1 g/L。

圖8　葡萄糖濃度、溫度、pH交互作用對乙醇產量影響的響應面圖Fig.8　Response surface plots of effect of interaction between glucose concentration,temperature and pH on ethanol yield

3　結論

成功的構建了不需要添加氨基酸和維生素,能同時高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖生成乙醇的基因重組菌Z.mobilisHYMX。解決了運動發酵單胞菌利用碳源單一的缺點,為細菌低成本生產乙醇打好基礎。

運用響應面分析法對基因重組菌Z.mobilisHYMX極高密度乙醇發酵工藝條件進行優化。確定了最佳發酵條件為葡萄糖濃度305 g/L,溫度34 ℃,pH6.5,尿素濃度3 g/L,接種量10%,發酵時間60 h。在此條件下經過6次重復實驗得到平均153.1 g/L的乙醇產量,比優化前提高了8.5%,比原型菌產量提高了105.14%。與工業酵母菌株PE-2相比重組菌節省了約12%的葡萄糖,節省了37.5%的時間。

[1]郝士杰,任鵬輝. 中國能源緊張的現狀分析及策略[J]. 中國電力教育,2007(z1):109-110.

[2]Pereira FB,Guimaraes PMR,Teixeira JA,et al. Robust industrial Saccharomyces cerevisiae strains for very high gravity bio-ethanol fermentations(MICROBIAL pHYSIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY)[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering,2011,112(2):130-136.

[3]Zaldivar J,Nielsen J,Olsson L. Fuel ethanol production from lingo cellulose:A challenge for metabolic engineering and process integration[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2001,56(1-2):17-34.

[4]Osman Yehia AIngram Lonnie O. Mechanism of ethanol inhibition of fermentation in Zymomonas mobilis CP4[J]. Journal of Bacteriology,1985,164(1):173-180.

[5]劉寅,張永光,張汝兵,等. 響應面法優化產酸丙酸桿菌丙酸發酵條件的研究[J]. 食品工業科技,2010(5):167-170.

[6]王茜,李海燕. 代謝工程改造運動發酵單胞菌用于提高乙醇產量[J]. 生物技術,2009,19(4):31-33.

[7]王華,于寒松. 響應面法優化重組大腸桿菌PUCRF發酵培養基[J]. 食品科學,2011,32(9):225-230.

[8]Xi Z,Wang T,Wen Z,et al. Use of a Tn5-based transposon system to create a cost-effective Zymomonas mobilis for ethanol production from lignocelluloses[J]. Microbial Cell Factories,2013,12(1):69-75.

[9]張紅雨,宋曙輝. 紫山藥低醇發酵飲料中乙醇含量的測定[J]. 食品工業科技,2014,35(1):307-309.

[10]于孔捷,黃杰. 氣相色譜內標法測定食品加工助劑三乙醇胺中單乙醇胺、二乙醇胺[J]. 食品工業科技,2008,29(8):281-282.

[11]Zhang M,Eddy C,Deanda K,et al. Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis[J]. Science,1995,267(5195):240-243.

[12]Deanda K,Min Z,Eddy C,et al. Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering[J]. Applied & Environmental Microbiology,1996,62(12):4465-4470.

[13]Zhang M,Chou Y C,Howe W,et al. Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof:US,US 7223575 B2[P]. 2007.

[14]Jia X,Wei N,Wang T,et al. Use of an EZ-Tn5-based random mutagenesis system to create a Zymomonas mobilis with significant tolerance to heat stress and malnutrition[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2013,40(8):811-822.

[15]Steen E J,Kang Y S,Bokinsky G,et al. Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass.[J]. Nature,2010,463(463):559-562.

[16]J.薩姆布魯克,D.W.拉塞爾. 分子克隆實驗指南(第三版)[M]. 北京：北京科學出版社,2003:99-102.

Optimization of very high ethanol fermentation conditions of the recombinantZymomonasmobilisby response surface method

CAO Shang-zhi,HUANG Le-tao,LUO Juan,SHANG-GUAN Min-min,DENG Ying,WANG Hao-yong*

(Key Laboratory of Fermentation Engineering Ministry of Education,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

The recombinant bacteriaZ.mobilisHYMX which can utilize glucose,xylose,arabinose and mannose to produce ethanol in the culture medium without amino acids and vitamins,was constructed by genetic engineering technology. The fermentation conditions of the HYMX strain under very high gravity ethanol fermentation conditions were optimized by the response surface methodology. The results showed that the optimum conditions were:glucose concentration 305 g/L,temperature 34 ℃,pH6.5,urea concentration 3 g/L,inoculation amount 10%,fermentation time 60 h. Under the optimized conditions,the ethanol yield of the recombinant strain was 153.1 g/L,8.5% higher than the non-optimized one,105.14% higher than the prototype strain. Compared with the industrial yeast strain PE-2,the glucose saving was more than 12%,and the fermentation time saving was more than 37.5%.

recombinantZymomonasmobilis;response surface method;fermentation conditions;the ethanol yield

2016-01-18

曹尚志(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：生化與分子生物學，E-mail:cao.shang.zhi@qq.com。

汪浩勇(1969-)，男，博士，教授，研究方向：生化與分子生物學，E-mail:haoyongw@qq.com。

湖北省優秀中青年團隊計劃項目(T200705)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)16-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.028