副溶血弧菌噬菌體qdvp001重組內溶素誘導表達以及理化性質初步研究

王偉宇,林　洪,王靜雪

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

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副溶血弧菌噬菌體qdvp001重組內溶素誘導表達以及理化性質初步研究

王偉宇,林洪,王靜雪*

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

對重組內溶素Lysqdvp001誘導表達條件進行探討,發現適當降低誘導溫度,可以避免包涵體的形成。最終確定誘導表達條件為25 ℃、IPTG濃度為1 mmol/L、誘導4 h,此時不僅蛋白表達量大并且不形成包涵體。為研究Lyqdvp001抑菌以及理化性能,采用濁度法對pH、溫度、離子強度對裂解活性的影響進行探討。結果表明,Lysqdvp001具有寬pH適應性,pH3～10均能很好發揮作用;耐高溫,在75 ℃處理30 min仍能維持70%活性;低濃度(0.1 mmol/L)的Zn2+、Fe2+以及各濃度(10、1、0.1 mmol/L)的Ca2+可以明顯提高重組內溶素Lysqdvp001活性。結果顯示重組內溶素有作為抑菌劑的潛力。

副溶血弧菌,副溶血弧菌噬菌體,內溶素

副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性致病菌,廣泛存在于近海岸及各種水產品中[1]。若食用被副溶血弧菌污染的食品易引起食物中毒,出現頭疼、腹瀉、嘔吐等一系列癥狀。近年來,副溶血弧菌引起的食物中毒事件呈現上升趨勢,已經成為感染食源性疾病的主要原因之一[2],而且,對食物中毒分離得到的副溶血弧菌進行檢測發現細菌已對一些常用的抗生素產生了耐藥性。有文獻報道,從青島地區水產品分離得到的副溶血弧菌90%以上對氨芐西林和阿莫西林具有耐藥性[3]。因此,找到能夠替代抗生素并能有效防控副溶血弧菌的抑菌劑迫在眉睫。

內溶素是噬菌體編碼的一種裂解酶,它通過裂解細菌細胞壁的肽聚糖來幫助子代噬菌體從細菌細胞中釋放出去[4]。與噬菌體以及小分子抗生素相比,內溶素具有不易產生抗性的優點[5-6]。1957年報道了第一個關于內溶素裂解細菌的研究[7],但直到2001年才報道了鏈球菌噬菌體重組內溶素在體內和體外都能有效抑制A族鏈球菌的感染[8]。近年來隨著克隆表達技術的不斷成熟,越來越多的重組內溶素被研究,并且研究表明重組內溶素均具有良好的裂解活性[9-12]。因此,內溶素作為新型抑菌劑具有很大的潛力。

在前期工作中,本實驗室分離得到一株新型副溶血弧菌噬菌體qdvp001[13],對其進行全基因組測序,通過分析后發現ORF60為編碼內溶素的開放式閱讀框,對其進行克隆表達。本實驗對誘導表達的最佳條件做了探究,然后分析該內溶素的裂解性能,為將內溶素應用于防控副溶血弧菌方面提供基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

宿主菌副溶血弧菌ATCC 17802(以下簡稱VP17802)購買于美國典型微生物菌種保藏中心;烈性副溶血弧菌噬菌體qdvp001(保存號為CCTCC M 2011143)本實驗室分離純化得到[13];含有內溶素基因的重組大腸桿菌BL21-qdvp001本實驗構建并且其制備的重組內溶素命名為Lysqdvp001;LB肉湯購買于北京陸橋技術有限責任公司;2216E肉湯、2216E瓊脂購買于青島海博生物技術有限公司;液體、固體培養基按照所購培養基的說明配制;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡稱IPTG)購于索萊寶生物技術有限公司;溶菌酶購于索萊寶生物技術有限公司。

HZQ-F100型振蕩培養箱哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺蘇凈安泰空氣技術有限公司;Sigma 3K15型高速冷凍離心機曦瑪離心機(上海)有限公司;MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋日本Sanyo公司;Power Wave XS型酶標儀美國Biotek。

1.2實驗方法

1.2.1重組內溶素Lysqdvp001表達條件的確定

1.2.1.1誘導時間將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養。次日,按照1∶50的比例將過夜培養的菌液加入到新鮮的LB液體培養基中(含有100 μg/mL卡那霉素),37 ℃ 150 r/min培養至OD600 nm大約0.6,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,37 ℃ 150 r/min誘導8 h,每隔1 h取1 mL菌液,離心去上清,用100 μL SDS-PAGE電泳上樣緩沖液復融沉淀,煮沸5 min,利用SDS-PAGE電泳檢測誘導時間。

1.2.1.2IPTG誘導濃度將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養。次日,按照1∶50的比例將過夜培養的菌液加入到新鮮的LB液體培養基中(含有100 μg/mL卡那霉素),37 ℃ 150 r/min培養至OD600 nm大約0.6,加入IPTG使不同樣品終濃度分別為0、0.1、0.5、1、2、3、4、5 mmol/L,振蕩誘導4 h,取不同誘導濃度樣品各1 mL按照上述步驟處理進行SDS-PAGE檢測。

1.2.1.3誘導溫度的確定將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養。次日,按照1∶50的比例將過夜培養的菌液加入到新鮮的LB液體培養基中(含有100 μg/mL卡那霉素),37 ℃ 150 r/min培養至OD600 nm大約0.6,加入IPTG濃度使其終濃度為1 mmol/L,分別將樣品置于20、25、30、37 ℃下進行4 h振蕩誘導,不同溫度樣品按照上述步驟分別取樣1 mL進行SDS-PAGE檢測。

1.2.1.4重組內溶素Lysqdvp001表達形式的確定將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養。次日,按照1∶50的比例將過夜培養的菌液加入到新鮮的LB液體培養基中(含有100 μg/mL卡那霉素),37 ℃ 150 r/min培養至OD600 nm大約0.6,加入IPTG至終濃度1 mmol/L,分別在25和37 ℃條件下誘導4 h,4000 r/min,離心20 min,去上清,用PBS緩沖液復融細菌沉淀,在300 W、工作5 s、休息15 s、工作99次條件下進行超聲破碎,然后8000 r/min離心30 min,對上清和復融沉淀分別進行SDS-PAGE檢測。

1.2.2重組內溶素Lysqdvp001的純化將重組菌BL21-qdvp001單菌落加入到10 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中,37 ℃ 150 r/min振蕩過夜培養。次日,按照1∶50的比例將過夜培養的菌液加入到300 mL新鮮的LB液體培養基中(含有100 μg/mL卡那霉素),在最適條件下進行誘導,然后參考林洪[14]的方法將樣品進行離心、復融、超聲破碎、過濾膜。將4 mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料加入柱子中,以1 mL/min的流速用超純水和結合緩沖液沖(20 mmol/L Tris-HCl,300 mmol/L NaCl,pH8.0)洗柱子直至基線平穩,加入25 mL酶液,用含有30 mmol/L咪唑濃度的結合緩沖液沖洗柱子以洗脫雜蛋白,用含有150 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白,收集OD280 nm峰值的幾管洗脫液,利用10 ku超濾離心管進行后續脫鹽處理。將純化后的重組內溶素Lysqdvp001置于-80 ℃保存。

1.2.3濁度法測定重組內溶素Lysqdvp001抑菌活性參考Nelson[8]方法,做適當修改。挑取副溶血弧菌VP17802至300 mL 2216E液體培養基中,過夜培養,菌體離心,用100 mmol/L EDTA復融5 min,4 ℃、8000 r/min條件下離心10 min,然后用純水復融、離心兩次獲得細菌沉淀,-80 ℃保存。

OD450 nm吸光值下降幅度間接表示裂解活性[15]。測定活性之前,將副溶血弧菌細菌沉淀用50 mmol/L Tris,pH8.2,含0.1% Triton X-100復融。在96孔板中加入100 μL細菌復融液,然后加入100 μL重組內溶素Lysqdvp001,室溫下(20 ℃)測定15 min內OD450 nm值。以Tris緩沖液作為陰性對照,溶菌酶作為陽性對照,每組3組平行。

1.2.4重組內溶素Lysqdvp001的pH穩定性將細菌沉淀用pH3.0～10.0復融緩沖液復融。將100 μL重組內溶素Lysqdvp001加入到100 μL不同pH的細菌復融液中,利用上述濁度法測定酶活并按照公式(1)計算各個組的相對酶活力。

各個實驗組的相對酶活力(%)=各個組的OD450 nm下降值/實驗組中OD450 nm下降最多值×100

式(1)

1.2.5重組內溶素Lysqdvp001溫度穩定性將保存的Lysqdvp001分裝后分別放于30、37、45、50、55、65、75 ℃水浴,采用濁度法分別測定0、15、30 min時酶活并按照公式(2)計算各組相對酶活。

各個實驗組的相對酶活力(%)=各個組的OD450 nm下降值/未處理組中OD450 nm下降值×100

式(2)

1.2.6重組內溶素Lysqdvp001離子強度穩定性將100 mmol/L ZnCl2、CaCl2、MgCl2和FeSO4溶液分別加入到已分裝好的細菌復融液中,使其終濃度分別為0.1、1、10 mmol/L。100 μL重組內溶素Lysqdvp001溶液加入到100 μL 含有不同離子濃度的細菌復融液中,濁度法測定酶活,并按照公式(3)計算相對酶活。

各個實驗組的相對酶活力(%)=各個組的OD450 nm下降值/離子濃度為0 mmol/L組OD450 nm下降值×100

式(3)

2　結果與分析

2.1重組內溶素Lysqdvp001表達條件的確定

2.1.1誘導時間的確定通過測定不同誘導時間下蛋白表達情況,確定誘導時間為4 h(圖1),既能保證蛋白表達量,又避免過長時間的誘導表達導致蛋白失活等情況。

圖1　誘導時間對重組內溶素Lysqdvp001表達影響的SDS-PAGE電泳圖Fig.1　The effects of different time on recombinantendolysin Lysqdvp001 by SDS-PAGE注:M表示蛋白標準分子量,1為未經IPTG誘導的細菌總蛋白,2～9分別為誘導1～8 h的細菌總蛋白。

2.1.2IPTG濃度的確定IPTG的濃度對誘導表達的影響較大,IPTG濃度過高可能會抑制大腸桿菌的生長從而造成蛋白表達量降低。在0.1～5 mmol/L范圍內改變IPTG濃度,最終確定IPTG濃度為1 mmol/L(圖2)。

圖2　IPTG濃度對重組內溶素Lysqdvp001表達影響的SDS-PAGE電泳圖Fig.2　The effects of different IPTG concentration on recombinant endolysin Lysqdvp001 by SDS-PAGE注:M表示蛋白標準分子量,1為未經IPTG誘導的細菌總蛋白,2～8分別為IPTG濃度為0.1、0.5、1、2、3、4、5 mmol/L時誘導的細菌總蛋白。

2.1.3誘導溫度及表達方式的確定通過SDS-PAGE電泳對重組內溶素Lysqdvp001的誘導溫度進行研究,最終確定最佳表達條件為37 ℃(圖3)。因此在誘導溫度37 ℃、IPTG濃度1 mmol/L的條件誘導4 h,但是此時重組內溶素Lysqdvp001的表達形式為包涵體(結果未展示),原因可能是細菌生長速率過快,導致細菌體內蛋白合成系統負擔過重,形成包涵體。因此,降低誘導溫度至25 ℃,其余條件不變,結果發現重組內溶素主要存在于超聲后的上清液中(圖4),重組內溶素Lysqdvp001表達方式為可溶性表達。綜上,在25 ℃、IPTG濃度為1 mmol/L、誘導時間為4 h時,重組內溶素Lysqdvp001既能保證表達量又能避免形成包涵體。

圖3　不同溫度對重組內溶素Lysqdvp001表達影響的SDS-PAGE電泳圖Fig.3　The effects of different temperature on recombinant endolysin Lysqdvp001 by SDS-PAGE注:M表示蛋白標準分子量,1為未經IPTG誘導的細菌總蛋白,2～5分別為溫度20、25、30、37 ℃誘導時的細菌總蛋白。

圖4　25 ℃誘導條件下重組內溶素Lysqdvp001表達形式Fig.4　The expression form of recombinant endolysin Lysqdvp001 at 25 ℃注:M為蛋白標準分子量,1為未經IPTG誘導的細菌總蛋白,2為超聲破碎后上清液中的細菌總蛋白,3為超聲破碎后沉淀中的細菌總蛋白。

2.2濁度法測定重組內溶素Lysqdvp001

當細菌菌體被裂解后,光密度隨著下降,OD450 nm吸光值也下降,因此OD450 nm吸光值可以間接表示細菌數量的變化。由圖5可以看出,在5 min時間內,重組內溶素Lysqdvp001使得OD450 nm吸光值下降0.6,和同濃度的400 μg/mL溶菌酶OD450 nm吸光值下降一樣,而Tris緩沖液僅使得OD450 nm吸光值下降0.01,說明重組內溶素Lysqdvp001具有很好的抑菌活性。

圖5　濁度法測定重組內溶素Lysqdvp001抑菌活性Fig.5　Lytic activity of Lysqdvp001 by turbidity reduction assay

由于革蘭氏陰性細菌細胞壁外存在一層外膜,阻礙內溶素直接作用于細胞壁,因此當內溶素從外部裂解革蘭氏陰性細菌時作用效果不明顯[16]。目前,大多數研究都是使用外膜通透劑來對外膜進行處理。外膜通透劑主要有兩大類,一類是多肽類抗生素,一類是螯合劑[17]。本實驗采用的是常用的EDTA螯合劑,它能螯合吸附二價離子,破壞外膜穩定性,從而使內溶素高效的發揮作用[18]。林洪[14]的研究表明,在EDTA的協同作用下,內溶素LysSTP4能有效的殺滅沙門氏菌。內溶素EL188和SPN1S在EDTA的共同作用下也有效的殺滅了Pseudomonasaeruginosa和SalmonellaTyphimurium[19-20]。在今后的研究中,可以考慮改變外膜通透劑的種類、用量或者與內溶素共同加入來改善內溶素的抑菌效果。

2.3重組內溶素Lysqdvp001的pH穩定性

當pH為4時,重組內溶素Lysqdvp001酶活力最大,并且酸性條件下,重組內溶素Lysqdvp001裂解活性都很好。雖然pH為10時,重組內溶素Lysqdvp001裂解活性僅為最高酶活力的40%,但是其仍能將OD450 nm降低0.6左右(結果未展示),活性仍舊很高。說明重組內溶素Lysqdvp001在任何pH條件下均能很好的發揮裂解作用,與一些嗜堿性裂解酶沙門氏噬菌體STP4-a重組內溶素LysSTP4[14]、蠟樣芽孢桿菌噬菌體B4的重組內溶素LysB4[21]等相比具有一定的優勢。

圖6　pH對重組內溶素Lysqdvp001裂解活性影響Fig.6　The effects of pH on the lytic activity of Lysqdvp001

2.4重組內溶素Lysqdvp001的溫度穩定性

由圖7可以看出,重組內溶素在室溫下復融時酶活力最大。65 ℃以下水浴15 min,酶活力基本不變,維持在最大酶活力的90%左右;當溫度升高到75 ℃時,水浴處理15 min,酶活力下降到70%左右,并且水浴30 min后酶活力仍維持在70%左右,說明重組內溶素Lysqdvp001具有很好的溫度耐受性。而林洪[14]報道的重組內溶素LysSTP4在65 ℃處理30 min后幾乎無裂解活性。

圖7　溫度對重組內溶素Lysqdvp001裂解活性的影響Fig.7　The effects of temperature on the lytic activity of Lysqdvp001

2.5重組內溶素Lysqdvp001離子穩定性

由圖8可以看出,離子濃度對重組內溶素Lysqdvp001影響比較大。高濃度的Zn2+和Fe2+(10、1 mmol/L)都顯著地抑制了酶活,低濃度的Zn2+和Fe2+(0.1 mmol/L)能顯著激活酶活。Ca2+能顯著提高酶活,特別是1 mmol/L Ca2+可以提高酶活1.7倍。高濃度(10 mmol/L)和低濃度(0.1 mmol/L)Mg2+均顯著地抑制了酶活,1 mmol/L Mg2+提高了酶活,但并不顯著。

圖8　離子強度對重組內溶素Lysqdvp001裂解活性影響Fig.8　The effects of iron concentration on the lytic activity of Lysqdvp001

3　結論

重組內溶素最佳表達條件為：IPTG濃度為1 mmol/L、25 ℃、誘導4 h,此時蛋白表達量大且不形成包涵體。通過濁度法測定Lysqdvp001對副溶血弧菌VP170802的裂解效果,得知該重組內溶素Lysqdvp001具有生物活性,并且具有寬pH適應性,能耐高溫,在75 ℃作用30 min仍能維持70%的酶活力,低濃度(0.1 mmol/L)的Zn2+、Fe2+以及各濃度(10、1、0.1 mmol/L)的Ca2+可以明顯提高重組內溶素Lysqdvp001活性。這些性質表明重組內溶素Lysqdvp001具有成為新型抑菌劑的潛力,為利用內溶素防控副溶血弧菌以及其他革蘭氏陰性細菌提供了理論基礎。

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Characterization of recombinant endolysin fromVibrioparahaemolytics-infecting bacteriophage qdvp001

WANG Wei-yu,LIN Hong,WANG Jing-xue*

(Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The inducible expression conditions of the recombinant endolysin Lysqdvp001 were discussed,founding that lowering temperature properly could avoid forming inclusion bodies. It was concluded that the recombinant endolysin Lysqdvp001 was induced by the addition of 1 mmol/L IPTG at 25 ℃ for 4 h. Under this condition,the Lysqdvp001 was soluble and was expressed in a high level. Then the Lysqdvp001 was characterized its lytic activity and biochemical properties such as pH,temperature and iron concentration by turbidity assay. The results showed that the Lysqdvp001 was stable over broad pH,maintaining good activities in pH3～10,and temperature ranges,maintaining 70% activity after 30 min at 75 ℃. Low iron concentration(0.1 mmol/L)of Zn2+and Fe2+and different iron concentration(10,1,0.1 mmol/L)of Ca2+could increase lytic activity of Lysqdvp001. In conclusion,the Lysqdvp001 had the potential to be antibacterial agents.

Vibrioparahaemolyticus;Vibrioparahaemolyticus-infecting bacteriophage;endolysin

2016-01-18

王偉宇(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品安全,E-mail:weiyu0828@163.com。

王靜雪(1976-),女,博士,教授,研究方向:食品安全,E-mail:snow@ouc.edu.cn。

山東省科技重大專項(2014ZZCX02703);“十二五”農村領域國家科技支撐計劃(2015BAD16B0902)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0205-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.032