植物乳桿菌Zhang-LL耐胃腸道逆環境及降膽固醇特性研究

隋　夢,于立娟,謝遠紅,張紅星

(農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,食品質量與安全北京實驗室,北京農學院食品科學與工程學院,北京 102206)

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植物乳桿菌Zhang-LL耐胃腸道逆環境及降膽固醇特性研究

隋夢,于立娟,謝遠紅,張紅星*

(農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,食品質量與安全北京實驗室,北京農學院食品科學與工程學院,北京 102206)

利用從發酵米粉中篩選出的一株植物乳桿菌Zhang-LL探討其胃腸道耐受性及體外降膽固醇功效。本實驗分別在pH1.5～3.0、膽鹽濃度0.1%～0.5%的條件下模擬人體胃腸道環境,采用活菌計數法檢測菌株Zhang-LL耐胃腸道逆環境特性及鄰苯二甲醛法檢測降膽固醇效果。結果表明:初始菌數為1×107CFU/mL的植物乳桿菌Zhang-LL在pH1.5～3.0的環境中3 h后,活菌數仍可達106CFU/mL;在膽鹽濃度為0.10%～0.50%環境中8 h,活菌數可達105～107CFU/mL;體外膽固醇降低率在20.69%～35.68%范圍。研究表明植物乳桿菌Zhang-LL具有較強的耐胃腸道逆環境特性及良好的降膽固醇能力,為開發研制降膽固醇功能食品及微生態制劑提供了實驗基礎。

植物乳桿菌,降膽固醇,胃腸道,耐受性

隨著生活水平的提升,人們對高營養食品的追求也越來越多,然而意味著食品中的膽固醇含量偏高。大量流行病學調查、科學實驗及臨床干預已經證明,攝入過多膽固醇而導致的動脈粥樣硬化,血脂水平升高等是各種心腦血管疾病的主要原因[1]。因此,降低血清中膽固醇的水平直接關系到人類的健康情況。很多研究者致力于降低人體血清中膽固醇含量,防止高血脂相關疾病發生的研究[2-3]。Mann[4]很早研究發現,非洲Maasai人大量食用發酵的乳制品,其體內膽固醇含量普遍較低。這引起了營養學、醫學、微生物學等各界人士的注意,從而掀起了乳酸菌降膽固醇作用的研究熱潮。學者們開始系統地研究能直接降解膽固醇的微生物,將其應用于低膽固醇食品的開發。

學者們在動物模型和人體實驗對益生菌降低血漿膽固醇的研究取得了相應成效[5-6]。Anderson[7]等人讓48名高膽固醇血癥患者在每日晚餐后服用含有嗜酸乳桿菌L1的發酵酸奶。經過10周的實驗,得到結果,與對照組相比,L1組的血漿膽固醇平均水平下降了約2.4%(p<0.05)。Nguyen[8]等釆用提取自嬰兒糞便中的植物乳桿菌PH04對小鼠上進行降膽固醇的實驗,他們對12只雄性小鼠分別給予每天4×108CFU/mL劑量的植物乳桿菌PH04,14 d后檢測血脂指標。結果顯示,PH04組小鼠的血漿總膽固醇下降了7%左右,而血漿甘油三酯下降了約10%,差異均有統計學意義(p<0.05)。國內有關降膽固醇乳酸菌的研究起步較晚,近幾年才開始篩選功能性菌株并研究相關功能與機制。謝寧[9]、李婷婷[10]等都在高脂血癥大鼠上驗證了益生菌的降膽固醇功效。

本研究采用從天然發酵米粉中篩選得到的一株植物乳桿菌Zhang-LL,利用活菌計數法檢測其在不同酸性環境及膽鹽濃度下的耐受情況,同時模擬胃腸道逆環境,以鄰苯二甲醛法測定其體外降膽固醇能力,為該類產品開發提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)Zhang-LL北京農學院食品與工程學院F123室保藏菌種;葡萄糖、乙醇、冰乙酸北京化工廠;蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、膽鹽、膽固醇北京奧博星生物技術有限公司;無水乙酸鈉、檸檬酸三銨、磷酸氫二鉀、吐溫-80、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、鄰苯二甲醛、氫氧化鈉國藥集團化學試劑有限公司;硫酸鎂北京精求化工有限責任公司;硫酸錳廣東汕頭西隴化學廠;瓊脂、蔗糖酯北京暢華志誠科技有限公司。

BS224S型精密電子天平德國Sartorius集團;MLS-3750型全自動高壓蒸汽滅菌鍋日本SANYO公司;BCN-1360B型無菌超凈工作臺哈爾濱東聯公司;WS-01恒溫恒濕培養箱湖北黃石恒豐醫療器械有限公司;PHS-3B型雷磁便攜式酸度計上海精科;QL-901型旋渦振蕩器海門市其林貝爾公司;JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司;WFJ-2100型可見光分光光度計龍尼柯(上海)儀器有限公司;BIOFUGE STRATOS大容量臺式冷凍離心機美國Thermo ScientificDW-40L262;低溫保存箱海爾集團Haier。

1.2實驗方法

1.2.1菌種活化將保藏在實驗室-80 ℃冰箱中的菌株用移液槍取100 μL接種到MRS液體培養基中,37 ℃培養12 h,將活化一代的菌種以2%的接種量接種于100 mL滅菌的MRS培養基中,37 ℃培養12 h,得到擴大培養液,4 ℃冷藏。

1.2.2菌落計數方法在無菌超凈工作臺中將待測樣品利用旋渦振蕩器搖勻,振蕩時間不少于30 s,對樣品進行十倍梯度稀釋。根據預計活菌數選擇3個適當稀釋梯度,吸取1 mL待測稀釋菌液以傾注平板法倒入MRS培養基平板中,快速搖勻,靜置10 min,于37 ℃倒置培養36～48 h,進行菌落計數[11],調整活菌數約為1×107CFU/mL。

1.2.3耐酸實驗將活化2代的菌液以2%的接種量分別接種于已用HCl調節pH為1.5、2.0、2.5、3.0的MRS液體培養基中,以MRS液體培養基(pH6.5)作為空白對照,在37 ℃環境中靜置培養3 h,設定在0、1、2、3 h時間點分別取樣分析,用滅菌PBS緩沖液進行10倍梯度稀釋,在適宜稀釋度取100 μL接種于MRS平板,每個稀釋度3個平行樣,37 ℃培養36～48 h后計數。繪制植物乳桿菌Zhang-LL的生長曲線,從而檢測菌株對酸的耐受能力。

1.2.4耐膽鹽實驗將活化2代的菌液以2%的接種量分別接種到含0.10%、0.30%、0.50%牛膽鹽的MRS液體培養基中,以不含膽鹽的MRS培養基作為空白對照,在37 ℃環境中靜置培養8 h,每2 h取樣,用滅菌PBS緩沖液10倍稀釋,在適宜稀釋度取100 μL接種于MRS平板,每組3個平行,37 ℃培養36～48 h后測定發酵液中的活菌數,繪制植物乳桿菌Zhang-LL的生長曲線,比較菌株生長與膽鹽含量的關系,以判斷其對膽鹽的耐受性。

1.2.5模擬胃腸道逆環境降膽固醇能力實驗

1.2.5.1標準曲線的繪制將1 mg/mL的膽固醇標準母液[12]配制成濃度分別為20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μg/mL的工作液。然后取0.5 mL工作液,置于60 ℃水浴中蒸干溶劑,加入0.5 mL含0.3%牛膽鹽MRS液體培養基,采用鄰苯二甲醛法進行測定,空白為4 mL鄰苯二甲醛顯色劑和2 mL濃硫酸混合體,實驗三次平行。以膽固醇的質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,進行函數擬合得到曲線回歸方程,用于計算膽固醇的質量濃度。

膽固醇移除率(%)=(1-ρ1∕ρ0)×100

式中:ρ1為培養后上清液膽固醇的質量濃度;ρ0為初始培養基膽固醇的質量濃度。

1.2.5.2實驗方法首先制備膽固醇MRS-CHOL培養基[13-14],準確稱取0.1 g膽固醇,放入小燒杯中,繼續添加0.1 g蔗糖酯、1 mL吐溫-80,并攪拌均勻,再加入5 mL冰乙酸,60 ℃水浴加熱溶解后再用超聲波破碎機進行破碎處理,趁熱用0.22 μm的濾膜將溶解液過濾,直接加入到配制好的已高壓滅菌的MRS培養基中,一邊加入一邊攪拌,使其形成均勻穩定的膠體溶液,得到約含0.1 mg/mL膽固醇的MRS液體培養基。用無菌的6 mmol/L NaOH調培養基pH在6.0～7.0之間。將植物乳桿菌Zhang-LL在MRS培養基中活化2代后,按10%接種至pH為3.0的PBS緩沖液中(模擬胃環境),37 ℃靜置培養,分別于0、30、60、90、120 min時間段取樣,離心收集菌體,用生理鹽水離心洗滌1次,將全部菌泥轉至含有0.3%牛膽鹽、0.1 mg/mL膽固醇的MRS液體培養基中。經過37 ℃培養8 h后,在550 nm處分別測定膽固醇質量濃度的吸光值(A550 nm)。每組實驗做三個平行,在培養前和培養后分別取樣,并以未接菌的含有0.3%牛膽鹽、0.1 mg/mL膽固醇的液體MRS培養基中為空白對照。膽固醇質量濃度采用鄰苯二甲醛法[15]進行測定。

2　結果與分析

2.1耐酸實驗

益生菌要在腸道存活并發揮益生作用的前提是耐受胃中的酸性環境。食物在胃里消化時間,一般為1～3 h。人體空腹胃液pH為0.9～1.8,在進食過程中pH會有所上升,維持在3.0左右,但在消化過程中由于胃酸的分泌,胃液pH又下降[16]。因此本實驗將植物乳桿菌接種于pH1.5、2.0、2.5、3.0的酸性培養基中培養3 h以檢測對胃酸的耐受性,以正常MRS培養基(pH6.5)作對照,結果見圖1。

由圖1所示,植物乳桿菌Zhang-LL在pH為3.0的條件下,經過1 h的培養,活菌數基本保持不變,之后隨培養時間延長活菌數逐漸上升,這表明此植物乳桿菌菌株能在偏酸性環境中生長良好;在pH2.5條件下,經過3 h的培養活菌數基本保持不變;在pH2.0和pH1.5環境下,隨著培養時間的延長活菌數逐漸下降,但經過3 h后活菌數仍可達到106CFU/mL。結果表明,此菌株在pH1.5～3.0作用3 h活菌數可達106CFU/mL,具有較高耐酸能力,能夠在胃中存活并進入腸道。這與靳志強[17]的研究結果:植物乳桿菌H13可耐受pH2.5及pH3的酸性環境,作用3 h后活菌數能達到106CFU/mL的結果相近。

圖1　植物乳桿菌Zhang-LL的耐酸性實驗Fig.1　Acid tolerance test result of Lactobacillus plantarum Zhang-LL

2.2耐膽鹽實驗

小腸是膽固醇的吸收場所,亦是乳酸菌發揮降膽固醇功能的主要部位。在人體腸液中正常膽汁酸鹽質量濃度為0.30%～0.50%,食物在腸道中通過時間一般為6～8 h[14]。所以本實驗測定植物乳桿菌Zhang-LL在0.10%、0.30%、0.50%(m/v)的膽鹽培養基中生長檢測其對膽鹽的耐受性,以未添加膽鹽的MRS培養基作為對照,結果見圖2。

由圖2可知,在膽鹽濃度為0.10%的MRS培養基中,受到膽鹽的影響初始階段植物乳桿菌Zhang-LL活菌數有所降低,經過4～6 h后開始逐漸上升,當培養時間達到8 h時,活菌數明顯上升,可達到107CFU/mL。菌株在膽鹽濃度為0.30%條件下,開始活菌數明顯下降,之后基本保持不變,培養至6 h后又逐漸上升,這可能是由于菌株適應了膽鹽環境的結果;菌株在膽鹽濃度為0.50%條件下,活菌數明顯下降,但能保持在106CFU/mL附近,具有較強的膽鹽耐受能力。結果表明,菌株在膽鹽濃度為0.10%～0.50%環境中生存8 h活菌數可達105～107CFU/mL,可見植物乳桿菌Zhang-LL對膽鹽具有良好的耐受性,能夠在腸道中存活并發揮益生作用。

圖2　植物乳桿菌Zhang-LL的耐膽鹽實驗結果Fig.2　Bile salt tolerance test result of Lactobacillus plantarum Zhang-LL

2.3降膽固醇能力實驗

2.3.1膽固醇測定標準曲線以膽固醇濃度(μg/mL)為橫坐標,550 nm下的吸光度值為縱坐標,所得的擬合直線方程為:y=0.0022x+0.0009,R2=0.9970。

2.3.2模擬胃腸道逆環境降膽固醇能力實驗模擬胃腸環境實驗結果表明,植物乳桿菌Zhang-LL對模擬胃酸環境(pH1.5～3.0)和膽汁鹽環境(0.1%～0.5%)均表現出較強的耐受性。因此,本實驗模擬胃腸道逆環境進行降膽固醇能力實驗。

由表1實驗結果可知,在胃酸環境(pH3.0)中菌體的培養時間對于乳酸菌體外降膽固醇能力有顯著性影響(p<0.05)。菌株Zhang-LL對膽固醇的降低率范圍在20.69%～35.68%之間,當菌液不經過胃酸時,在1.57 μg/mL膽固醇含量0.3%膽鹽的培養基中經過8 h培養,膽固醇的降低率最高為35.68%。在pH3.0 PBS緩沖液中培養時間越長,其在膽固醇培養液中膽固醇的降低率越小,隨著菌體在胃酸培養時間的增長,菌株Zhang-LL在培養基中的降膽固醇能力逐漸下降。當培養時間達到120 min時,膽固醇的降低率為20.69%。出現這種情況的原因可能是菌株活菌數隨著培養時間的增長逐漸下降,但仍有大部分菌株存活,故還存在降膽固醇能力。由以上結果可知,植物乳桿菌Zhang-LL具有體外降膽固醇能力,為進一步研究植物乳桿菌Zhang-LL的降膽固醇作用機理以及開發具有降膽固醇特性的產品提供理論依據。

表1　植物乳桿菌Zhang-LL膽固醇含量的移除率

注:表中為Bonferroni t-test測驗結果,在同一列數據中,相同字母則表示差異不顯著,不同字母則表示差異顯著(p<0.05)。

乳酸菌降膽固醇的作用機理主要包括同化吸收作用[15],共沉淀作用[18]、細胞膜吸附膽固醇作用[19]等。本實驗中發現植物乳桿菌Zhang-LL作用機理目前還不明確,還需要進一步實驗說明是以何種途徑降低膽固醇。并且對其體內的降膽固醇作用機理還需要進一步探索與研究。而且降解膽固醇的程度還和菌株培養時間有關系,Zhao等[20]人的研究結果表明了在培養時間為12 h時對乳酸菌有最大的移除量,李常營[21]等人又研究了酸菜來源的植物乳桿菌S4-5在指數期結束(培養時間為14 h)之際,膽固醇的移除率最大,為66.7%。所以,實驗菌株Zhang-LL可以在高膽固醇培養液中進一步長時間培養,以計算出其最高降膽固醇移除率。

3　結論

菌株的初始接種量為1×107CFU/mL,經耐酸、耐膽鹽實驗,活菌數仍在105CFU/mL以上,表明有足夠數量的植物乳桿菌Zhang-LL通過胃腸道而保持活性,證明了此菌株對酸及膽鹽具有較高的耐受性,能夠在胃中存活并進入腸道。同時模擬胃腸道逆環境,以鄰苯二甲醛法測定其體外降膽固醇能力,其體外膽固醇降低率在20.69%～35.68%范圍之間;當菌液不經過胃酸時,8 h培養后膽固醇的移除率最高為35.68%。當菌液經過胃酸120 min時,膽固醇的降低率最低為20.69%。本實驗室保藏的菌株Zhang-LL在體外表現為一株具有良好降膽固醇能力的菌株,為進一步研究其體內降膽固醇作用及移除膽固醇的作用機理提供參考。

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Study on tolerance characteristics of the gastrointestinal tract and cholesterol-lowering effects ofLactobacillusplantarumZhang-LL

SUI Meng,YU Li-juan,XIE Yuan-hong,ZHANG Hong-xing*

(Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Faculty of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

The tolerance characteristics of the gastrointestinal tract and cholesterol-lowering effects ofLactobacillusplantarumZhang-LL isolated from fermented rice noodles in Bama,Guangxi Province were investigated. Viable count was firstly used in this study to detect the tolerance characteristics under simulated gastrointestinal tract environment pH1.5～3.0. Additionally,bacterial growth was evaluated in the presence of 0.10%～0.50% bile salt. O-phthalaldehyde was used to detect its cholesterol-lowering capability. The results showed thatLactobacillusplantarumZhang-LL’s number of viable bacteria was still up to 106CFU/mL after 3 h under pH1.5～3.0,whose initial bacterial count was 1×107CFU/mL. And being cultured for 8 h in the MRS-broth(0.10%～0.50% bile salt),the viable count reached nearly to 105～107CFU/mL. A cholesterol removal rate ranging from 20.69% to 35.68% was observed under varying conditions. It showed thatLactobacillusplantarumZhang-LL had a strong capability of anti gastric intestinal reverse environment and good cholesterol lowering ability,which provided the experimental basis for the development of cholesterol-lowering functional food and micro ecological preparation.

Lactobacillusplantarum;cholesterol-lowering;gastrointestinal tract;tolerance

2016-02-17

隋夢(1992-),女,碩士研究生,研究方向:食品加工與安全,E-mail:15117957701@163.com。

張紅星(1970-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物,食品安全檢測與控制,E-mail:hxzhang@163.com。

北京市長城學者培養計劃(CIT&TCD20140315)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0226-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.036