一株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa002的分離鑒定及其生理學性質研究

鞠　磊,王靜雪,林　洪,李夢哲,毛相朝

(中國海洋大學食品科學與工程學院,食品安全實驗室,山東青島 266003)

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一株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa002的分離鑒定及其生理學性質研究

鞠磊,王靜雪*,林洪,李夢哲,毛相朝

(中國海洋大學食品科學與工程學院,食品安全實驗室,山東青島 266003)

為探究耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的生物防治方法,從青島市團島污水處理廠采集到的污水中分離得到了一株噬菌體qdsa002。借助噬菌斑形態、酶切、電鏡等技術對其進行了分類鑒定。研究了其最佳感染復數、一步生長曲線、pH穩定性和熱穩定性等生理學特征。結果表明,qdsa002核酸屬于線型雙鏈DNA,具有正多面體的頭部及較長的尾部,qdsa002頭部直徑約47 nm,尾長約120 nm,屬肌尾噬菌體科。生理學特征研究結果表明,qdsa002在雙層平板上能形成清晰透亮的噬菌斑。最佳感染復數為0.001,潛伏期40 min,爆發期180 min。在pH為5～9范圍內能夠保持良好的生理活性。在溫度不高于50 ℃條件下裂解性能良好。該噬菌體可用于防治MRSA感染的生物制劑。

耐加氧西林金黃色葡萄球菌噬菌體,酶切,鑒定,生理學性質

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)自1961年在英國被首次發現之后[1],便成為臨床感染最為重要的病原菌之一。MRSA引起的感染死亡率很高,造成了很嚴重的臨床醫學及公共衛生問題。目前對MRSA的治療主要采用萬古霉素,但是近幾年的研究發現已有對萬古霉素耐藥、中介耐藥及異質性耐藥的MRSA菌株產生[2],這無疑對于治療MRSA感染提出了一個新的難題與挑戰。

噬菌體是一種感染細菌、真菌和放線菌的病毒,具有以下特點:專一性高、安全性好、增殖能力強和來源范圍廣等優點[3],是生物防治致病菌很好的一種方法。近年來噬菌體應用于腐敗菌或食源性致病菌的相關研究已有很多,且取得了較好的控制作用。例如Suanne Guenther等[4]利用噬菌體對被沙門氏菌感染的巧克力牛奶、土耳其熟食肉品、水產食品及熱狗進行抑菌處理后發現,溫度為8 ℃時沙門氏菌不生長,溫度為15 ℃時沙門氏菌數有3～5個數量級的下降。另外,Pilar Garcia等人用制備的混合噬菌體對奶酪中的金黃色葡萄球菌進行抑制,裂解性噬菌體可以在25 ℃的溫度條件下作用4 h后,奶酪中的金黃色葡萄球菌可基本被消除,表明噬菌體在奶酪加工過程中能起到較好的生物防控作用[5];本實驗通過分離MRSA噬菌體并對其生理學性質進行研究,為噬菌體治療MRSA感染提供了實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

耐加氧西林金黃色葡萄球菌43300(簡稱S.aureus43300)從美國典型微生物菌種保藏中心購買;UNIP-10柱式細菌基因組提取試劑盒上海生工;營養肉湯液體培養基、營養瓊脂固體培養基北京陸橋技術有限責任公司;氯化鈉、水合硫酸鎂等試劑均為分析純;半固體由體積比為1∶1的營養肉湯液體培養基和營養瓊脂固體培養基配制而成;實驗用水為新鮮純水。

DYY-TC型電泳儀北京市六一儀器廠;JEM-1200EX透射式電子顯微鏡JEOL公司;XMT-152A電熱恒溫培養箱寧波機電工業研究設計院;HZQ-F100振蕩培養箱哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司;SiGMa離心機北京思達興業儀器有限公司;TDL-5M臺式大容量冷凍離心機湘儀離心機儀器有限公司;BS2248電子天平北京賽多科斯儀器系統有限公司;Forma Scientific超低溫冰箱東莞市昊昕儀器設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1噬菌體的分離將采集的污水經5000 r/min 離心10 min后,取上清液5 mL加入到雙倍濃縮的營養肉湯液體培養基中,同時加入100 μL對數期的S.aureus43300(S.aureus43300接種到營養肉湯培養基中,37 ℃條件下培養12 h可達到對數期),37 ℃下150 r/min振蕩培養12 h。然后經5000 r/min離心10 min后,取上清液過0.22 μm的濾膜,得到噬菌體原液,于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2噬菌體的純化采用雙層平板法[6],具體操作如下:用滅菌的SM緩沖液將噬菌體原液稀釋1～6倍,取100 μL稀釋的噬菌體液和100 μL對數期的S.aureus43300加入到5 mL半固體中,混合均勻后倒入固體培養基中,半固體凝固后放于37 ℃培養箱中倒置恒溫培養12 h。

在上述出現噬菌斑的平板中,用接種絲挑取單個噬菌斑到1 mL SM緩沖液中混均,4 ℃保存12h。然后用無菌SM緩沖液對上述噬菌體液稀釋1～6倍后,取100 μL稀釋的噬菌體液和100 μL對數期的S.aureus43300加入到5 mL半固體培養基中,混合均勻后倒入固體培養基中,半固體凝固后放于37 ℃培養箱中倒置恒溫培養12 h。重復上述操作5次以上,待得到的噬菌斑形態大小一致后即得到了純噬菌體。

1.2.3噬菌體的增殖采用液體增殖法、固體增殖法[7]。液體增殖法:取100 μL對數期的S.aureus43300和100 μL噬菌體加入到營養肉湯培養基中,37 ℃條件下150 r/min培養8 h后,將上述液體在5000 r/min條件下離心10 min,取上清液用雙層平板法測定效價,如果效價高(≥108pfu/mL),則將液體過0.22 μm濾膜得到高效價噬菌體,在4 ℃冰箱中保藏,如果效價低(<108pfu/mL),則繼續將噬菌體進行增殖。

固體增殖法:取稀釋1～6倍后的噬菌體液制成雙層平板,于37 ℃恒溫倒置培養12 h后,選取噬菌斑最多但未通透的平板,加入10 mL SM緩沖液,在4 ℃中過夜。然后將SM緩沖液及雙層平板中的上層取到無菌離心管中,8000 r/min離心15 min,取上清液測定噬菌體的效價,如果效價高則將上清液過0.22 μm濾膜得到高效價噬菌體,在4 ℃冰箱中保藏。

1.2.4噬菌體核酸的提取和酶切鑒定取固體增殖后效價達109pfu/mL的噬菌體液1 mL在20000 r/min條件下離心1 h,將上清液去掉,采用UNIP-10柱式細菌基因組提取試劑盒提取噬菌體的核酸。

將噬菌體核酸與限制性內切酶HindⅢ 37 ℃酶切1 h,用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果,其中1%瓊脂糖凝膠制備方法為稱取0.3 g瓊脂糖加入3 mL 5×TBE緩沖液和27 mL超純水。電泳時電壓設置為90 V,時間30min[8]。

1.2.5噬菌體的電鏡觀察采用磷鎢酸負染法[9],取100 μL噬菌體液滴在石蠟上,將銅網置于噬菌體液上,5 min后將銅網取下放在濾紙片上自然曬干5 min,然后用2%的磷鎢酸染色10 min后,取下銅網曬干,在透射電鏡(JEM-1200EX)下進行觀察。

1.2.6噬菌體最佳感染復數(MOI)的測定按照感染復數為10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、100、101,將100 μL噬菌體和100 μLS.aureus43300加入到5 mL液體培養基中,37 ℃條件下150 r/min振蕩培養8 h,將上述液體在8000 r/min離心15 min,取上清液用雙層平板法測定噬菌體效價。效價最高的感染復數為噬菌體的最佳感染復數。

1.2.7噬菌體的一步生長曲線采用Lu等[10]方法進行改進,以感染復數為10,將1 mL噬菌體和1 mL對數期的S.aureus43300加入到100 mL液體培養基中,37 ℃培養5 min后,將上述液體12000 r/min離心30 s,棄上清。然后用營養肉湯液體培養基洗劑兩次,除去未吸附的噬菌體,然后加入等量預熱的營養肉湯液體培養基混勻,立即置于37 ℃條件下150 r/min振蕩培養。同時開始計時,以0時刻和每隔10 min取樣一次測定噬菌體效價。以時間為橫坐標,噬菌體效價為縱坐標繪制一步生長曲線。

1.2.8噬菌體pH穩定性配制pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的營養肉湯液體培養基,分別取900 μL加入到無菌EP管中,放于37 ℃水浴鍋中,當溫度平衡后加入100 μL噬菌體,恒溫水浴2 h后用雙層平板法噬菌體效價。

1.2.9噬菌體的熱穩定性將400 μL噬菌體加入到無菌EP管中,在40、50、60、70、80 ℃水浴作用20、40、60 min后,置于4 ℃冷卻,然后用雙層平板法測定噬菌體效價。

1.2.10數據處理使用作圖軟件Origin進行數據相關的處理。

2　結果與分析

2.1噬菌體的分離、純化

從團島污水處理廠采集到的污水中分離得到了一株噬菌體,編號為qdsa002,在雙層平板上經過12 h培養后形成噬菌斑如圖1所示。

圖1　噬菌體qdsa002噬菌斑形態Fig.1　The bacteriophage plaque of phage qdsa002

可以看出,噬菌斑中間透亮且邊緣清晰,呈現出烈性噬菌體的噬菌斑特征[11]。

噬菌體在自然界中廣泛存在,且數量巨大,超過1031。噬菌體分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體,烈性是菌體進入宿主菌后能夠裂解宿主菌,而溫和性噬菌體卻不能引起宿主菌的裂解[12]。噬菌體的分離與季節有較大關系,主要是溫度能夠影響到宿主菌的數量進而影響到噬菌體的數量。本研究中的噬菌體分離于2014年8月,屬于秋季分離到的噬菌體,雙層平板法培養24 h才能出現噬菌斑,與李雪玲等[13]分析的結果一致。

2.2噬菌體核酸的提取和酶切鑒定

噬菌體核酸提取和酶切鑒定結果如圖2所示,可以看出提取的噬菌體濃度與純度都較好,且噬菌體核酸能被HindⅢ酶切成三條片段,說明與HindⅢ酶有兩個酶切位點,同時表明噬菌體核酸類型為雙鏈DNA。

圖2　噬菌體核酸噬類型的判斷Fig.2　Determination of the nucleic acid type of bacteriophage注:M. λ-Hind Ⅲ digest DNA分子量標準;A. 噬菌體核酸;B. 噬菌體核酸Hind Ⅲ酶切。

本研究中使用了許多種限制性內切酶對qdsa002核酸進行酶切,只有HindⅢ酶切條帶較為清晰可辨,而電泳條帶的清晰度與很多因素有關如電壓大小、瓊脂糖凝膠濃度、電泳時間等[14]。具體實驗條件需要具體分析和探索。

2.3噬菌體的電鏡觀察

噬菌體負染后經過透射電鏡觀察結果如圖3所示。

圖3　噬菌體qdsa002透射電鏡照片(×128k)Fig.3　Electron micrograph of phage qdsa002(×128k)

可以看出,噬菌體為典型的T形噬菌體。頭部呈正多面體結構,有細長的尾部。噬菌體全長168 nm,頭部直徑47 nm左右,尾部長度120 nm。

根據2005年國際病毒分類委員會(ICTV)第八次報告[15],細菌病毒被劃為了五個級階:群、目、科、屬、種,細菌病毒有了系統的分類。本研究的噬菌體頭部呈正多面體結構,全長168 nm,頭部直徑47 nm左右,尾部長度120 nm,為典型的肌尾噬菌體科與已報道的金黃色葡萄球菌噬菌體基本一致[16]。

2.4噬菌體最佳感染復數(MOI)的測定

qdsa 002的最佳感染復數測定結果見表1。從表1可以看出,感染復數從10到0.000001,噬菌體效價表現為先升高后降低的趨勢,當感染復數為0.001時噬菌體效價最高為2.23×108,表明噬菌體qdsa 002最佳感染復數為0.001。

表1　噬菌體qdsa002最佳感染復數測定

感染復數是研究病毒感染與產出之間量效關系而提出的一個重要生物學指標。感染復數不同,子代噬菌體的產率也會有較大的差異,噬菌體產率最高的感染復數為最佳感染復數。這一生理學指標為后續噬菌體與細菌用量比提供了一個依據。在本研究中,噬菌體qdsa 002最佳感染復數為0.001,曾志良等[17]分離得到的金黃色葡萄球菌噬菌體最佳感染復數為0.01,李隴平等[18]分離得到的金黃色葡萄球菌噬菌體最佳感染復數也是0.01,與之相比較qdsa 002具有較強的裂解能力。

2.5噬菌體的一步生長曲線

噬菌體qdsa002的一步生長曲線見圖4。從圖4可以看出,前40 min內,噬菌體的數量并沒有增加,表明噬菌體的潛伏期為40 min,在隨后的180 min內,噬菌體的數量急劇增加,說明噬菌體的爆發期約180 min,之后噬菌體趨于穩定,進入穩定期。

圖4　噬菌體qdsa002一步生長曲線Fig.4　One-step growth curve of phage qdsa002

噬菌體一步生長曲線表現為潛伏期、裂解期和穩定期,不同噬菌體的潛伏期和裂解期也會存在一定的差異。噬菌體與宿主菌吸附開始潛伏期;噬菌體從宿主菌內釋放,表明潛伏期結束,裂解期開始;宿主菌裂解死亡噬菌體數量保持平穩,說明裂解期結束進入穩定期。本研究的噬菌體qdsa002潛伏期為40 min,爆發期為180 min,與顧敬敏[19]分離得到的金黃色葡萄球菌噬菌體GH15相比(潛伏期為25 min),潛伏期明顯加長。

2.6噬菌體pH穩定性

噬菌體pH穩定性測定結果見圖5。可以看出,噬菌體qdsa002在5～9范圍內噬菌體效價與初始效價相比沒有明顯差異,能夠保持良好的裂解活性;當pH為4和10時,噬菌體效價能夠保持在107pfu/mL以上,此時仍能保持噬菌體較好的活性;當pH=11時,噬菌體效價依然保持在106pfu/mL以上;當pH≤3和pH≥12時,噬菌體基本完全失活。

圖5　噬菌體qdsa002 pH穩定性Fig.5　The pH stability of phage qdsa002

噬菌體對宿主菌的吸附要受到pH的影響,表現為噬菌體空間構象會受到pH的影響。本研究中,qdsa002在pH為5～9范圍內均能保持良好的生理活性,即最適pH為5～9。與賈靜靜[20]研究的噬菌體最適pH6～8相比,qdsa002的最適pH范圍更廣。

2.7噬菌體的熱穩定性

噬菌體qdsa002熱穩定性測定結果見圖6。可以看出,噬菌體qdsa002在40 ℃和50 ℃條件下作用1 h效價基本保持不變;噬菌體在60 ℃下作用20 min效價降到105pfu/mL,作用1 h后效價只有102pfu/mL;在70 ℃下作用20 min效價就降到不足10 pfu/mL,40 min后檢測不到噬菌體效價;在80 ℃下作用20 min噬菌體就基本全部失活。說明噬菌體qdsa 002在50 ℃及其以下溫度能夠保持良好的活性。

圖6　噬菌體qdsa002的熱穩定性Fig.6　The thermal stability of phage qdsa002

溫度也能影響到噬菌體對細菌的吸附,過高的溫度會影響到噬菌體的空間構象使其失去裂解活性。在本研究中,噬菌體qdsa002在50 ℃及其以下的溫度能夠保持良好的活性,與蔡天舒研究的金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa001相比，耐熱性基本一致。

3　結論

以S.aureus43300為宿主菌,從青島市團島污水處理廠的污水中分離純化出一株噬菌體qdsa002,并對其它生理生化特性進行了研究,得到的結論如下:

3.1電鏡觀察表明該噬菌體qdsa002頭部為正多面體結構,有細長的尾部,呈蝌蚪形。頭部直徑大約為47 nm左右,尾部長約120 nm左右,屬于典型的肌尾噬菌體。通過對噬菌體基因組提取和鑒定表明,其核酸類型為DNA。

3.2噬菌體對50 ℃以下的溫度具有較高的耐受力,60 ℃溫度作用20 min后,其效價仍在105pfu/mL以上,在70 ℃下作用20 min效價就降到不足10 pfu/mL,而在高于80 ℃以上的高溫時,將會失去裂解細菌的活性。噬菌體qdsa002最適pH為5～9,當pH在3以下及12以上時,會完全失去感染宿主菌的能力。對噬菌體的感染復數的研究表明,噬菌體和宿主菌的濃度比為0.001時,所得到的子代噬菌體的效價最高。另外,其一步生長曲線顯示噬菌體感染宿主菌的潛伏期為40 min,裂解期約為180 min。綜上所述,噬菌體qdsa002具有較為良好的生物學特性,為應用提供了良好材料。

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Identification and biological properties of a methicillin-resistantStaphylococcusaureusphage qdsa002

JU Lei,WANG Jing-xue*,LIN Hong,LI Meng-zhe,MAO Xiang-zhao

(Food Safety Laboratory,College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

In order to develop an effective bio-controlling method against methicillin-resistantStaphylococcusaureus,one phage qdsa002 was isolated from sewage water gathered from Tuandao sewage treatment plant of Qingdao. Bacteriophage was identified by plaque shapes,restriction endonucleases analysis,electronic microscope technique. The physiological characteristics of the optimum MOI value,the growth curve,the pH value and the thermal stability were assayed. Results showed that the phage qdsa002 had linear double stand DNA and regular polyhedron symmetric head. The qdsa002 had a head of about 47 nm in diameter and tails of 120 nm,belonging to family Siphoviridae. The physiological characteristics showed plaques with transparent center in double agar plate. The optimum MOI value of qdsa002 was 0.001,one-step growth experiment showed that the latent time and burst time were 40 min and 180 min,respectively. The qdsa002 was stable over a wide range of pH(5～9)and temperature(≤50 ℃). The phage can be used in the prevention and treatment of MRSA infection.

methicillin-resistantStaphylococcusaureusphage;restriction endonucleases analysis;identification;physiological characteristics

2015-12-25

鞠磊(1989-),男,碩士研究生,主要從事食品質量與安全方面的研究,E-mail:juleiouc@163.com。

王靜雪(1976-),教授,主要從事食品質量與安全、應用微生物方面的研究,E-mail:snow@ouc.edu.cn。

“十二五”農村領域國家科技支撐計劃(2015BAD16B0902)；山東省科技重大專項(2014ZZCX02703)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0230-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.037