快速酶法制備低聚異麥芽糖工藝建立與優(yōu)化

田康明,喬　艦,李普均,牛丹丹,3,*,路福平

(1.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院,天津 300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;3.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建省海洋酶工程重點實驗室,福建福州 350116)

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快速酶法制備低聚異麥芽糖工藝建立與優(yōu)化

田康明1,2,喬艦2,李普均2,牛丹丹2,3,*,路福平2

(1.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院,天津 300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;3.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建省海洋酶工程重點實驗室,福建福州 350116)

對多酶協(xié)同制備低聚異麥芽糖(IMOs)生產(chǎn)工藝進行研究,建立了以玉米淀粉為底物,使用耐高溫α-淀粉酶進行液化,以α-葡萄糖苷酶、普魯蘭酶和β-淀粉酶同時糖化轉(zhuǎn)苷制備IMOs的基本工藝。通過優(yōu)化液化程度、糖化轉(zhuǎn)苷過程作用溫度和pH、糖化階段α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶、普魯蘭酶和β-淀粉酶的添加量,形成了快速酶法制備低聚異麥芽糖的工藝。最優(yōu)工藝如下:以25%(w/v)玉米淀粉為底物,液化還原糖含量(DE值)為20～30,糖化轉(zhuǎn)苷溫度為55 ℃,pH6.0,α-葡萄糖苷酶添加量為500～1000 U/g、普魯蘭酶添加量為0.9 U/g、β-淀粉酶添加量為500 U/g。結(jié)果表明:反應(yīng)15 h可得到異麥芽二糖、異麥芽三糖和潘糖之和為49.09%的低聚異麥芽糖漿。本研究所建新工藝可以淀粉為原料快速高效制備IMOs,其有效組分明顯高于現(xiàn)有生產(chǎn)工藝,制備周期也較現(xiàn)有生產(chǎn)工藝縮短70%以上,研究結(jié)果對現(xiàn)有IMOs生產(chǎn)技術(shù)的提升具有指導(dǎo)意義。

低聚異麥芽糖,快速酶法,工藝優(yōu)化

低聚異麥芽糖(Isomaltooligosaccharides,IMOs)又稱異麥芽寡糖、異麥芽低聚糖、分支低聚糖,是指葡萄糖之間至少有一個以α-1,6-糖苷鍵結(jié)合而成的、單糖數(shù)在2～5不等的一類低聚糖[1-2]。低聚異麥芽糖的核心有效成分為異麥芽糖又稱異麥芽二糖(IG2)、異麥芽三糖(IG3)和潘糖(P),常被簡稱為“二三潘”,三組分含量之和是IMOs產(chǎn)品質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。成品中還含有一定量的四糖以上的低聚寡糖、葡萄糖和麥芽糖,可以通過物理方法或生物方法去除而得到高純度產(chǎn)品[3-4]。低聚異麥芽糖口味適宜,生產(chǎn)成本低,具有很多生理功能,其中最直接的生理功能有:不被生物體內(nèi)淀粉消化酶消化,熱量低,甜度低,基本上不增加血糖血脂水平,故被廣泛用于生產(chǎn)低糖產(chǎn)品[1-2];能促進人體腸道內(nèi)的雙歧桿菌等益生菌的增殖,進而抑制腸道內(nèi)各類有害菌及腐敗物質(zhì)的形成,增加各種維生素的含量,提高機體免疫力[5-6];作為飼料添加劑,不但可以提高飼料產(chǎn)品的品質(zhì),促進禽畜生長,還可以減少飼養(yǎng)過程中抗生素及其他藥物的使用[1]。利用低聚異麥芽糖所具有的多種優(yōu)良理化性質(zhì)和生理保健功能,其在諸如保健品、食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價值[1]。

目前,國內(nèi)外生產(chǎn)IMOs的典型方法,是以淀粉為原料采用淀粉酶系多酶協(xié)同與分步作用,轉(zhuǎn)化淀粉得到。工業(yè)上首先由淀粉在高溫α-淀粉酶的作用下液化,液化淀粉在β-淀粉酶作用下生成麥芽糖漿,再利用α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶進行糖基轉(zhuǎn)換生成IMOs,其糖類組分中約含有50%～60%的各種低聚異麥芽糖和40%～50%的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽寡糖,最后經(jīng)過過濾、脫色、脫鹽、濃縮等得到成品,并可以通過酵母發(fā)酵或物理分離純化獲得高純度產(chǎn)品,目前以酵母發(fā)酵法去除可發(fā)酵糖為主流生產(chǎn)技術(shù)[1,3-4,7]。現(xiàn)有低聚異麥芽糖工業(yè)生產(chǎn)工藝存在工序多、周期長、底物轉(zhuǎn)化率低、工藝參數(shù)控制困難等缺點,且酶法轉(zhuǎn)化產(chǎn)品中重要功能性糖分的含量不高(約為35%,w/w),這些都制約著我國IMOs產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。其核心技術(shù)問題之一是酶的合理組合與優(yōu)化利用。

本文通過研究IMOs制備過程影響酶的功能發(fā)揮相關(guān)因素及其酶的組合作用與優(yōu)化,試圖建立起全新的高效IMOs酶法制備工藝技術(shù),為現(xiàn)有IMOs工業(yè)制造技術(shù)的革新奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

玉米淀粉食品級,購自山東百盛生物科技有限公司;耐高溫α-淀粉酶(40000 U/mL)、普魯蘭酶(2,000 U/mL)購自福大百特生物科技有限公司;β-淀粉酶(700000 U/mL)、α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶(360000 U/g)由江蘇銳陽生物科技有限公司提供;葡萄糖分析純,國藥控股有限公司;麥芽糖分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司;異麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、潘糖均為色譜純,購自江蘇銳陽生物科技有限公司。

1260液相色譜儀安捷倫科技有限公司;ELSD 2000 ES蒸發(fā)光檢測器埃文森科技有限公司;TSK-GEL Amide-80親水相互作用色譜柱北京綠百草科技發(fā)展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1低聚異麥芽糖制備工藝流程參照現(xiàn)有工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)體系進行并參考文獻[7]方法。實驗室操作時的反應(yīng)體積為100 mL,一般步驟是:稱取淀粉溶于水中制成25%(w/v)淀粉乳,調(diào)節(jié)pH至6.0,加入一定量的耐高溫α-淀粉酶,加熱煮沸液化;將溫度降低到55 ℃左右,加入一定量的β-淀粉酶和普魯蘭酶,再加入α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶,55 ℃保溫一段時間。定時取樣,用HPLC分析糖分組成及其變化。

1.2.2淀粉液化程度的優(yōu)化在25%淀粉乳中按照100、200、400 U/g的加入量加入耐高溫α-淀粉酶,混勻后加熱到100 ℃,進行液化,在淀粉液化液的DE分別達到12、20和30后,將淀粉液化液降溫到55 ℃,依次加入β-淀粉酶、普魯蘭酶和α-葡萄糖苷酶,55 ℃保溫10 h。取樣,HPLC法分析其糖分組成。

1.2.3轉(zhuǎn)苷過程中最佳pH的確定在液化完成后,將其pH調(diào)整到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,再加入β-淀粉酶、普魯蘭酶和α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶,55 ℃保溫6 h糖化后,取樣HPLC分析糖分組成。

1.2.4轉(zhuǎn)苷過程中最適溫度的確定在轉(zhuǎn)苷過程中將樣本分別在37、45、50、55、65和75 ℃下反應(yīng)6 h,取樣HPLC分析糖分組成。

1.2.5α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的不同添加量對IMOs形成的影響在其它條件不變的情況下,在反應(yīng)體系中按照500、1000、2000 U/g的添加量加入α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶,在55 ℃下反應(yīng)不同時間,定時取樣分析。

1.2.6普魯蘭酶的不同添加量對IMOs形成的影響在其它條件不變的情況下,在反應(yīng)體系中按照0.3、0.6、0.9、1.8 U/g的添加量加入普魯蘭酶,一組不添加普魯蘭酶,在55 ℃下反應(yīng)15 h后,取樣分析。

1.2.7β-淀粉酶的不同添加量對IMOs形成的影響在固定其它反應(yīng)條件不變的情況下,分別按照300、400、500、600、700 U/g的添加量添加β-淀粉酶,一組不添加β-淀粉酶,在55 ℃下反應(yīng)15 h,取樣分析。

1.2.8最優(yōu)條件下IMOs的酶法制備在上述確認的最優(yōu)條件下,進行完整的液化和糖化轉(zhuǎn)苷實驗,并經(jīng)HPLC分析最終產(chǎn)物的組成情況。

1.3分析測定方法

1.3.1淀粉液化液DE值按GB/T 22428.1-2008進行,采用直接滴定法(以葡萄糖計算)[8]。

1.3.2低聚異麥芽糖含量與組成分析按GB/T 20881-2007測定,采用HPLC法進行[9]。色譜柱為TSK-GEL Amide-80親水相互作用色譜柱,流動相為67%的乙腈,流速為1 mL/min,色譜柱檢測溫度為30 ℃,檢測器使用ELSD 2000ES蒸發(fā)光檢測器,檢測器氣體流速為2.2 L/min,檢測器溫度為90 ℃。干物質(zhì)(固形物)總量按GB/T 20885-2007中6.2測定[10]。

結(jié)果計算:依據(jù)國標(biāo)GB/T 20881-2007要求,計算低聚異麥芽糖質(zhì)量中的核心指標(biāo),異麥芽糖(IG2)、異麥芽三糖(IG3)和潘糖(P)的含量[9]。本研究采用更貼合生產(chǎn)實踐的低聚異麥芽糖產(chǎn)率描述各實驗結(jié)果,即二三潘(%)為樣本中IG2、IG3和P之和除以樣本總干物質(zhì)量。

式中:二三潘(%)-異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖之和占總干物質(zhì)的質(zhì)量比例,%(w/w);IG2-異麥芽糖含量,mg/mL;P-潘糖含量,mg/mL;IG3-異麥芽三糖含量,mg/mL;DMC-樣品的干物質(zhì)含量,mg/mL;潘糖占比(%)為樣品中潘糖(P)的含量除以總干物質(zhì)量。

1.4數(shù)據(jù)處理

相關(guān)實驗均設(shè)置三個平行實驗,數(shù)據(jù)分析借助Origin 8.0軟件處理完成,統(tǒng)計分析采用F檢驗法進行。

2　結(jié)果與討論

2.1淀粉液化程度與IMOs形成間的關(guān)系

淀粉液化程度優(yōu)化結(jié)果如表1所示。淀粉液化達到DE值為20時,轉(zhuǎn)苷10 h,二三潘占比為45.91%,潘糖占比為16.41%;液化淀粉達到DE值為30時,轉(zhuǎn)苷8 h后,二三潘占比為46.83%,潘糖占比為17.36%。可見,在上述實驗條件下,控制淀粉液化度在20～30之間,對后續(xù)IMOs形成及其質(zhì)量有一定影響。考慮到用酶成本與操作方便性,后續(xù)實驗淀粉液化度可以控制在DE值20～30之間。

表1　不同淀粉液化程度與IMOs形成間的關(guān)系

注:*p<0.05表示具有顯著性,**p<0.01表示具有極顯著性。

在淀粉制糖實踐中,無論是淀粉制葡萄糖還是淀粉制麥芽糖,淀粉液化及其液化程度直接影響終產(chǎn)品的形成與質(zhì)量。就低聚異麥芽糖生產(chǎn)而言,IMOs的生成依賴具有轉(zhuǎn)苷活性的α-葡萄糖苷酶,其作用底物是淀粉液化與糖化后形成的麥芽糖或麥芽寡糖[7]。本研究結(jié)果顯示,淀粉液化程度對IMOs制備具有明顯影響,但相較淀粉制備葡萄糖或麥芽糖的制造過程而言,IMOs制備過程中淀粉液化程度較高，更有利于目標(biāo)產(chǎn)品的形成。

2.2轉(zhuǎn)苷過程中最佳pH的確定

不同pH下進行IMOs制備的結(jié)果如圖1所示。隨著pH從4.0增加至6.0時,反應(yīng)得到的二三潘占比也在逐漸增加,反應(yīng)pH繼續(xù)升高,則反應(yīng)得到的二三潘占比會明顯下降。可見,控制反應(yīng)pH在5.0～6.0之間皆能較好完成IMOs的制備,pH6.0為IMOs酶法合成的最佳pH,用于后續(xù)研究。

圖1　轉(zhuǎn)苷過程不同pH與二三潘含量的關(guān)系Fig.1　Relationship between various reaction pHand IMOs yield during transglycosylation process

2.3轉(zhuǎn)苷過程中最適溫度的確定

不同溫度下進行IMOs制備的結(jié)果如圖2所示。當(dāng)制糖反應(yīng)溫度從37 ℃升高到55 ℃時,二三潘占比也在升高;當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高,二三潘占比在逐步下降,從65 ℃升高到75 ℃時,二三潘占比下降的尤為明顯。故確定淀粉制備IMOs的最佳反應(yīng)溫度可以控制在50～65 ℃之間,考慮到工業(yè)過程與安全控制,可選定55 ℃最適反應(yīng)溫度。

圖2　轉(zhuǎn)苷過程不同溫度與IMOs形成間的關(guān)系Fig.2　Relationship between various reaction temperature and IMOs yield during transglycosylation process

2.4α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的不同添加量對IMOs形成的影響

研究了α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的添加量對IMOs形成的影響,見圖3。α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的添加量極大的影響IMOs生成速率并輕度影響其轉(zhuǎn)化率。酶量添加500 U/g,反應(yīng)15 h,二三潘占比達到最高的46.41%;酶量添加1000 U/g,反應(yīng)10 h,二三潘占比達到最高的45.53%;酶量添加2000 U/g,反應(yīng)6 h,二三潘占比達到最高的45.73%。α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶能催化雙糖、低聚糖和其他類似物的非還原端α-1,4糖苷鍵斷裂,釋放出D-葡萄糖;也能專一地進行糖苷鍵轉(zhuǎn)移反應(yīng),將葡萄糖苷轉(zhuǎn)移到糖類受體底物上形成α-1,6糖苷鍵[7,11]。本研究結(jié)果顯示,α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的添加量主要影響轉(zhuǎn)苷的速度,對IMOs核心組成的影響較小,在選擇其使用量時可主要依據(jù)制造成本與制造效率之間的最適平衡。推薦工業(yè)生成體系下選取500～1000 U/g作為此酶的添加量。

圖3　α-葡萄糖苷酶的不同添加量對IMOs形成的影響Fig.3　Effect of various amounts of α-glucosyltransferase added on IMOs formation

2.5普魯蘭酶的不同添加量對IMOs形成的影響

進一步實驗研究了普魯蘭酶在IMOs制備中的作用,結(jié)果見圖4。不添加普魯蘭酶時,二三潘僅為35%左右;添加一定量的普魯蘭酶后,IMOs的形成隨著普魯蘭酶添加量的增加逐步提高,普魯蘭酶添加量為0.9 U/g時二三潘占比提高到45.38%,繼續(xù)增加普魯蘭酶的添加量未明顯提高二三潘占比。后續(xù)研究使用0.9 U/g作為普魯蘭酶的最適添加量。普魯蘭酶能專一性水解支鏈淀粉分支點中的α-1,6糖苷鍵,形成直鏈淀粉,對小分子淀粉分支點或小分子異麥芽(寡)糖中α-1,6糖苷鍵沒有水解作用[12],本研究結(jié)果進一步驗證這一結(jié)果。研究結(jié)果還顯示,在淀粉形成麥芽糖或麥芽寡糖過程中,普魯蘭酶通過改善淀粉脫支,顯著提高IMOs制造過程中的總糖轉(zhuǎn)化率或轉(zhuǎn)化效率。

圖4　普魯蘭酶的不同添加量對IMOs形成的影響Fig.4　Relationship between various amounts of pullulanase added and IMOs formation

2.6β-淀粉酶的不同添加量對IMOs形成的影響

β-淀粉酶是一種外切型糖化酶,從淀粉的非還原性末端依次切下一個麥芽糖單位,將液化后的麥芽糊精進一步水解為麥芽糖和麥芽三糖,后者又是α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的主要底物,可見其作用在IMOs制造中是比較重要的酶種。為此,對β-淀粉酶在IMOs制備中的作用進行了分析,結(jié)果見圖5。不添加β-淀粉酶時,二三潘占比僅為33.18%,在一定量β-淀粉酶的協(xié)助下,隨著β-淀粉酶添加量的增加二三潘占比呈現(xiàn)升高趨勢,當(dāng)β-淀粉酶添加量多于500 U/g時,二三潘占比達到46.29%,繼續(xù)增加β-淀粉酶添加量二三潘占比不再升高甚至出現(xiàn)輕度下降。后續(xù)研究選擇500 U/g作為β-淀粉酶的最優(yōu)添加量。

圖5　β-淀粉酶的不同添加量對IMOs形成的影響Fig.5　Relationship between various amounts of β-amylase added and IMOs formation

2.7優(yōu)化條件下IMOs的酶法制備

依據(jù)以上實驗結(jié)果,使用25%(w/v)淀粉乳,按400 U/g添加耐高溫α-淀粉酶在pH6.0下進行淀粉液化,使液化淀粉的DE值為達到20～30,降溫至55 ℃,加入β-淀粉酶、普魯蘭酶及α-葡萄糖苷酶添加量分別為500、0.9、500 U/g,55 ℃保溫15 h,其IMOs各組成形成與圖6所示(圖中方框為局部HPLC圖譜的放大,目的是進一步觀察較大低聚糖的形成情形)。此外,按照本研究的檢測條件,麥芽五糖(DP5)的出峰時間應(yīng)為24.838 min,麥芽六糖的出峰應(yīng)為時間34.74 min,但在對應(yīng)出峰位置未形成可積分峰。因此,本研究制備的IMOs較少出現(xiàn)大約四糖的低聚物。

圖6　本研究制備的IMOs HPLC圖譜Fig.6　HPLC profile of IMOs components prepared in this study

與同類產(chǎn)品的核心組分含量相比如表2所示。本研究所制備的樣本中IMOs含量和各主要組分占總糖的比例均明顯高于同類產(chǎn)品中的相應(yīng)組分含量。

國內(nèi)低聚異麥芽糖產(chǎn)品劑型主要為IMO-50型和IMO-90型。其中,IMO-90型由低聚異麥芽糖漿經(jīng)酵母發(fā)酵或模擬流動床分離去除葡萄糖和麥芽糖獲得[3-4]。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn),IMOs產(chǎn)品中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖三者總和占干物質(zhì)的比例約35%(IMO-50型產(chǎn)品)或45%(IMO-90型產(chǎn)品)。本研究制備獲得的低聚異麥芽糖中異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖三者總和占干物質(zhì)的比例約49.09%,高于低聚異麥芽糖產(chǎn)品質(zhì)量要求,也明顯高于同類產(chǎn)品(表2)。更為重要的是,本研究將糖化與轉(zhuǎn)苷工序統(tǒng)一為一步,糖化轉(zhuǎn)苷周期僅需15 h,較傳統(tǒng)IMOs制

表2IMOs組成成分比較

Table 2Comparison of IMOs prepared in this study with commercial products

IMOs類別IMOs組成成分(%,w/v)異麥芽糖潘糖異麥芽三糖二三潘來源IMOs19.22±1.05**18.51±1.22**11.35±1.34**49.09±1.56**本研究Isomalto50016.912.58.437.8[13]Iso-G13.116.03.933.0[13]Biotose5017.110.78.436.2[13]

注:**p<0.01表示極顯著。

備工藝的48 h以上的轉(zhuǎn)苷周期縮短70%以上,工藝過程也實現(xiàn)了進一步簡化。

3　結(jié)論

糖化過程和轉(zhuǎn)苷過程同步實施與酶的優(yōu)化應(yīng)用,可以有效提高所制備的低聚異麥芽糖漿中二三潘占比并大幅縮短低聚異麥芽糖漿的制備周期,可顯著提高生產(chǎn)效率。研究結(jié)果對現(xiàn)有工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的提升或改良具有一定指導(dǎo)意義。

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Development and optimization of rapid enzymatic process for isomaltooligosaccharides preparation

TIAN Kang-ming1,2,QIAO Jian2,LI Pu-jun2,NIU Dan-dan2,3,*,LU Fu-ping2

(1.College of Chemical Engineering and Materials Science,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;3.Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering,College of Biological Science and Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350116,China)

Combined action with multiple enzymes was investigated for isomaltooligosaccharides(IMOs)production in this study. The corn starch was liquefied using thermostableα-amylase,followed by simultaneous saccharification and transglycosylation usingα-glucosyltransferase,pullulanase andβ-amylase. The reaction condition was optimized through single factor experiments,including liquefaction degree,reaction temperature and pH in saccharification and transglycosylation phase,α-glucosyltransferase dosage,pullulanase andβ-amylase dosage in saccharification phase. The optimum reaction condition was obtained when the dextrose equivalent value(DE)was control at 20～30 and 500～1000 U/g ofα-glucosyltransferase,0.9 U/g of pullulanase and 500 U/g ofβ-amylase were employed for simultaneous saccharification and transglycosylation at pH6.0 and 55 ℃ with the 25% starch slurry. Under this optimal condition,IMOs with 49.09% of isomaltose,isomaltotriose and panol was obtained within 15 h incubation. In conclusion,the new developed procedure processed rapid preparation of IMOs with high efficiency,in which the IMOs index was significantly improved and the manufacturing duration was 70% reduced. The results are able to improve or reform the current industrial scale process for IMOs manufacturing.

isomaltooligosacchrides;rapid enzymatic preparation;process optimization

2016-01-18

田康明(1985-)，男，博士，研究方向：酶制劑的開發(fā)與應(yīng)用，E-mail：kangmingtian@tust.edu.cn。

牛丹丹(1980-)，女，博士，研究方向：工業(yè)微生物育種與酶工程，E-mail：ddniu0529@fzu.edu.cn。

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(青年基金項目)(14JCQNJC09200)；福建省教育廳產(chǎn)學(xué)研(JA15049)；天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計劃項目(20130628)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0238-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.039