基于配子的抗生素檢測研究進展

蔡義林,袁愛夢,蔡珺珂,李　彤,李　穎,齊　斌,朱穎越,*

(1.常熟理工學院,生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500;2.中國礦業大學化工學院,江蘇徐州 221000)

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基于配子的抗生素檢測研究進展

蔡義林1,2,袁愛夢1,蔡珺珂1,李彤1,李穎1,齊斌1,朱穎越1,*

(1.常熟理工學院,生物與食品工程學院,江蘇常熟 215500;2.中國礦業大學化工學院,江蘇徐州 221000)

抗生素因其療效顯著被廣泛的使用,然而其濫用對人類所帶來的危害也逐漸被重視。核酸配子作為一種“化學抗體”,隨著配子篩選技術的改進對靶目標具有更高的特異性和親和力。本文對以核酸配子為基礎所建立的生物傳感方法檢測抗生素的研究進展做了概括,分別從電化學、光學、酶聯免疫等方面對近些年來學者構建的新型傳感方法進行介紹,以展現配子技術在抗生素檢測上的研究方法和應用潛力。

核酸配子,抗生素,傳感器,檢測

抗生素是生物在其生命活動中產生的能選擇性抑制和影響他種生物功能的有機物質,其在促進生長、治療和預防感染性疾病方面得到廣泛且大量的應用,不可避免的造成環境中抗生素的殘留,最終可經過食物鏈在人體內累積,導致人身體內微生物環境平衡的紊亂和失調,對人體健康造成威脅[1-3]。

配子是指能與靶分子特異性結合的核苷酸序列[4-5]。相對于傳統的蛋白抗體,配子能與靶目標結合形成更穩定的化合物且特異性較高。一種物質的配子篩選時間并不長,可以通過PCR技術放大,進而能大量制備。配子制備簡單,易于修飾,并能長期保存,且與目標物作用條件可控。因此配子基傳感技術具有很好的應用前景。本文在總結國內外相關研究的基礎上,結合配體技術在抗生素檢測方向的研究方法與類型,以及環境中幾種典型抗生素(四環素、土霉素和磺胺類等)的殘留檢測方法,對現階段配子基生物傳感技術進行了分類和對比分析。

1　抗生素配子的篩選和構建

經典的配子指數富集的配基系統進化技術[6]將靶目標與文庫進行混合反應,結合分離技術和PCR擴增分離出靶目標的配子文庫,并對文庫進行克隆、測序,篩選出單一配子。隨著磁珠、毛細管電泳以及PCR等技術的發展,篩選技術得到不斷的提高。研究者們通過SELEX技術在寡核苷酸庫中篩選出對目標物具有高特異性、高親和力的抗生素配子。

Song等[7]通過親和色譜法在試管內篩選出對卡那霉素具有特異性綁定的卡那霉素配子DNA(ssDNA),熒光強度分析表明其與卡那霉素的解離常數為78.8nmol/L。Mehta等[8]通過篩選技術設計了氯霉素的DNA配子,得到兩段富含鳥嘌呤G(>35%)的氯霉素配子,通過對配子綁定分析,其分離常數為0.8和1 μmol/L。Zhou等[9]利用修飾的磁珠結合指數富集配體系統進化技術(SELEX技術)得到鏈霉素的配子DNA,非線性回歸分析表明,此配子的分離常數為199.1 nmol/L,且具有很好的特異性。Kim等[10]通過間接性酶聯免疫競爭實驗和SELEX技術篩選得到土霉素的配子DNA,分離常數為4.7 nmol/L,遠遠低于先前Niazi[11]篩選出的土霉素配子分離常數56.84 nmol/L。

表1　熒光傳感檢測抗生素

2　配子識別技術在抗生素檢測中的應用

2.1抗生素常用的檢測方法分析

食品中抗生素殘留檢測受到人們的廣泛關注。高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、表面等離子體共振以及毛細管電泳法等[12-14]已經被應用于檢測抗生素。然而,這些方法操作繁瑣,耗時長,通常需要復雜的樣品預處理和昂貴的儀器。配子傳感器具有較好的選擇性,靈敏度,構造簡單，操作方便。此外,核酸配子作為生物探針,可以通過堿基配對作用以及分子內作用,形成不同的三維空間結構或閉合結構,具有較高的靈活性,通過特殊設計的配子已經被學者應用于抗生素的檢測[15-16]。

2.2配子基熒光傳感檢測抗生素

熒光傳感技術是基于具有熒光效應的化學物質或量子點構建的配子基生物傳感器,通過核酸配子與目標物的變構作用,提供增強或減弱激發單重態的環境或以能量共振轉移為基礎,改變熒光量子效率,實現對目標物質的檢測(表一)。

Li等[17]通過酰胺反應EDC-NHS方法將氨基化的卡那霉素配體標記到十八烯酸修飾的稀土上轉換發光材料(NaYF4:Yb,Er)上,由于ssDNA與石墨烯之間的π-π相互堆積作用,使能量供體稀土上轉換發光材料和能量受體石墨烯靠近,兩者發生能量共振轉移,引起熒光淬滅,但當加入卡那霉素后,配子與卡那霉素作用形成發夾結構,從而不能吸附在石墨烯上,基于此構建的熒光傳感器的檢測限可達9 pmol/L,線性范圍為0.01～3 nmol/L。Leung等[18]利用四面體熒光物質鉑復合物[Pt(CN＾N)Cl]單獨存在時較弱的熒光效應,而與雙鏈DNA共存時熒光得到加強的特性,設計了一種配子基熒光傳感器,當卡那霉素不存在時,DNA呈自由狀態,體系熒光強度無變化,卡那霉素的加入使ssDNA轉變為一個包含發夾結構形態,此時鉑復合物存在于ssDNA構象中熒光得到增強。

Chen等[19]利用銀納米簇(AgNCs)與DNA胞嘧啶的組合發光效應,將磁珠與DNA進行結合,磁珠上DNA的互補DNA為赭曲霉毒素A配子,當體系中含有赭曲霉毒素A時,與其配子特異性結合,磁珠分離過程中,上清液體系中仍存在含有胞嘧啶的配子,當加入Ag+/NaBH4時,生成的銀納米簇與胞嘧啶作用發出熒光,熒光強度與赭曲霉毒素A濃度呈正相關性,此熒光傳感器的檢測限達到2 pg/mL。Wu等[20]將生物素修飾的氯霉素配子與親和素修飾的磁納米顆粒(Fe3O4MNPs)相結合,將氨基化的與配子互補的DNA與納米上轉換熒光納米材料(NaYF4:Yb,Er)相結合,當溶液中有含有氯霉素時,磁納米顆粒上的配子與氯霉素連接,不能與互補DNA修飾的熒光納米材料形成二聚體,在磁力分離作用下,分離體系中的熒光信號強度發生改變,以此可以檢測氯霉素,檢測限可達0.01 ng/mL,線性范圍為(0.01～1) ng/mL,研究者將這種檢測方法應用于牛奶樣品中的氯霉素檢測,得到較好結果。

2.3配子基比色傳感檢測抗生素

比色生物傳感技術廣泛應用于配子基生物傳感器,此類傳感技術大部分以金納米體系為基礎,結合目標物與配子之間的高親和力特性,以及ssDNA的堿基互補配對和具有的負電性磷酸骨架,改變溶液中鹽或陽離子聚合物等能引起金納米體系聚集物質的濃度,在體系的吸光值與目標物質的濃度建立對應關系,實現對目標物的識別檢測(表2)。

Song等[7]將卡那霉素配子應用于金納米比色傳感器的構建,由于DNA能附著在納米金表面,對一定鹽濃度的金納米溶液具有分散作用,當在溶液中加入卡那霉素后,配子與卡那霉素結合從納米金表面剝落,不能維持特定鹽濃度下金納米的分散性,溶液的吸光度發生改變,基于此特性構建的生物傳感器檢測限為25 nmol/L。Zhou等[9]同樣利用納米金比色方法檢測鏈霉素,通過紫外掃描得到的檢測范圍為0.2～1.2 μmol/L,通過蜂蜜中的加標回收實驗表明所構建比色傳感器具有很好的實際應用前景。Kim等[21]采用類似比色方法以土霉素配子檢測土霉素,得到的檢測限為25 nmol/L,完全滿足美國環保局對此類抗生素的檢測要求。Niu等[22]利用卡那霉素配子、腺苷酸配子以及磺胺地索幸配子構建的金納米比色傳感器,根據不同的納米金溶液的顏色變化(紅色-紫色/藍色)實現了三種物質的同時檢測分析。

表2　比色傳感檢測抗生素

2.4配子基電化學傳感檢測抗生素

電化學配子傳感器是由固定了適體的電極和電化學活性識別元素構成。將配子作為分子識別元素固定在電極上,以電化學電極作為換能器,當待測目的物加入電極體系,目的物與適體作用從而導致電極表面結構的變化,然后通過檢測電極表面電活性識別元素的電信號來達到識別和鑒定靶物質的目的(表3)[23-24]。

Zheng等[27]建立一種老鼠血樣中土霉素的測定方法,土霉素配子互補DNA兩端分別修飾上氯化二茂鐵和巰基,將此DNA連接在電極表面,利用DNA的堿基互補性使氯化二茂鐵遠離電極表面,加入土霉素后,配子被競爭性剝離,氯化二茂鐵靠近電極表面進而改變電子傳遞效應,所構建傳感器對鼠血樣中土霉素的具有很好的檢測結果。Sanaz[28]同樣以氯霉素配子構建的金電極傳感器檢測氯霉素,得到的檢測限為1.9 nmol/L。Sun等[29]將殼聚糖-金納米顆粒(CS-AuNPs),石墨烯-金納米顆粒(GR-AuNPs),多壁碳納米管-酞菁鈷材料(MWCNTs-CoPc)組合應用于卡那霉素的檢測,首先將CS-AuNPs、GR-AuNPs、MWCNTs-CoPc納米混合物依次滴定在金電極上,通過各納米復合物的協同效應加強電子傳遞效率和電極的靈敏度,然后將氨基化的卡那霉素配子1修飾在混合物表面,用牛血清蛋白阻塞未連接配子的活性位點,加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶-配子2混合物構成整個檢測系統,當加入卡那霉素后,辣根過氧化物酶的電子傳遞效應循環增加,檢測過氧化物酶催化雙氧水氧化反應多產生的電流效應以確定卡那霉素的濃度。所構建方法具有很高的靈敏度和特異性且檢測限達5.8 nmol/L。

表4　免疫學傳感檢測抗生素

水凝膠是由親水性聚合物構成的具有三維網狀結構的類似于軟組織的物理膠體,能與大量水融合,具有生物相容性,其電化學性能已經被廣泛研究[29-30]。Ezat等[31]通過堿性處理從動物蛋白中得到一種膠質,將巰基化氯霉素配子修飾在金電極上,然后用膠質包裹制成一種電化學芯片,當滴加氯霉素在電極表面時,由于配子目標物的特異性結合導致金電極表面電流發生變化,以此來檢測氯霉素的含量,檢測限為0.183 nmol/L,具有較好的選擇性和穩定性。

2.5配子基酶聯免疫吸附傳感檢測抗生素

酶聯免疫吸附是將抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化結合起來用于檢測的一種技術。核酸配子作為“化學抗體”對目標物質具有很高的親和力和特異性,且制備簡單,便于修飾,故作為單鏈小分子的適體分子具有優越性,而以適體為基礎的新型生物傳感器更勝一籌。以酶聯核酸適體分析為基礎的檢測方法,因其檢測的簡單性可廣泛應用于食品抗生素檢測。

Lise等[32]在通過直接或間接酶聯競爭反應實現了目標物的檢測,在直接酶聯競爭檢測中,將牛血清蛋白修飾的赭曲霉素連接在管壁上,牛血清固定的赭曲霉素和自由赭曲霉素競爭性綁定生物素修飾的配子,然后利用鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶對四甲基聯苯胺的催化顏色反應確定赭曲霉素的濃度,所建立方法的檢測限為10 ng/mL。間接性競爭檢測就是用親和素將生物素標記的赭曲霉素配子固定在管壁上,利用辣根過氧化物酶標記的赭曲霉素和自由赭曲霉素之間競爭性綁定配子,然后通過辣根過氧化物酶的催化變色作用確定赭曲霉素的濃度,檢測限為1.4 ng/mL。Kim等[10]設計了一種類似的間接性酶聯競爭實驗檢測土霉素,通過加入生物素標記的土霉素配子和非標記的土霉素進行競爭性綁定,對土霉素的檢測限為12.3 μg/L,并成功應用于牛奶樣品中土霉素的檢測。Wang等[33]利用間接性酶聯競爭反應實現了對四環素的檢測,線性檢測范圍為0.1～1000 ng/mL,檢測限為0.0978 ng/mL,將其應用于蜂蜜中四環素的檢測,回收率在92.09%～109.7%之間。

2.6其它配子基生物傳感檢測抗生素

表面等離子體共振波譜是一種免標記高靈敏技術,能夠詳細提供表面親和力和生物分子相互作用的親和力和動力學信息。相較于其它方法,由表面等離子體共振得到的動力學和綁定常數信息更加方便,快速,便于操作。加入分析物質后,通過檢測金陣列的表面共振角改變確定綁定過程的信息,結合配子科技,這種技術已經被應用于抗生素的檢測[34]。N de los等[16]采用表面等離子體技術建立的方法實現了對新霉素B的檢測,檢測范圍達10～100 μmol/L,并且具有很好的特異性。

懸臂陣列傳感器作為一種能實時、高靈敏度的檢測技術近些年來受到很多學者的關注,懸臂陣列傳感技術具有較小的尺寸,靈敏的動力學響應和較高的準確度,能夠將分子識別作用直接轉換為納米力學響應信號。通過將功能化的受體分子固定在傳感器上,目標分子被捕捉時會在傳感器的表面產生不同的壓力信號,基于此實現對目標分子的檢測[35-36]。Hou等[37]采用懸臂陣列傳感技術,將巰基化的土霉素配子綁定在單層分子膜懸臂上,將6-巰基1-乙醇化的單層分子膜作為參比懸臂,當土霉素被配子綁定后,懸臂表面的壓力信號發生變化,以此檢測土霉素得到的線性范圍是1.0～100 nmol/L,檢測限為0.2 nmol/L。

抗體-抗原的特異結合性質容易引起抗體修飾的微球體聚集,這種改變能夠通過統計學或光散射的方法進行監測[38-39]。采用此原則,將表面固定有抗體的膠體微球與抗原進行反應,可以通過光散射強度檢測抗原的濃度。Kim等[40]將氨基化的土霉素配子視為化學抗體,固定在羧基化的微球表面,當加入土霉素時,由于土霉素配子具有多綁定區域,會引起微球的聚集,改變光散射強度,所構建方法的檢測限可達100 μg/L,線性范圍為100～104 μg/L，并且具有很好的特異性。

3　結論與展望

抗生素對人類健康的威脅已成為重大環境問題,發展簡單高效,快速靈敏的抗生素檢測方法至關重要。SELEX技術結合新型篩選體系的構建,使得目標配子的篩選更加容易,而且配子作為“化學抗體”合成簡單,具有類似于抗體-抗原的特異性結合性質。隨著新型材料的應用和納米技術的發展,氧化石墨烯、磁納米顆粒、金納米顆粒、熒光量子點等,使各類生物傳感器的構建變的容易,實時檢測能力也得到提高。

綜上所述,相較于傳統的檢測系統,配子基生物傳感器極具發展潛力。由于此類生物傳感器的靈敏度受到體系溫度、pH以及降解酶等的干擾,作為一種應用型的分析檢測技術還需要進行改進。篩選技術的發展和后處理方法的完善,可以使篩選配子的專一性、親和力以及抗降解能力得到提高,配子基傳感技術的多樣化、簡便性以及可靠性必將為抗生素的實際檢測提供可行的應用研究基礎,為抗生素的快速檢測提供新型的方法。

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Research advance in antibiotics detection based on aptamer

CAI Yi-lin1,2,YUAN Ai-meng1,CAI Jun-ke1,LI Tong1,LI Ying1,QI Bin1,ZHU Ying-yue1,*

(1.School of Biotechnology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China;2.School of Chemical Engineering & Technology,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221000,China)

Antibiotics has been widely used for its distinctive curative effect in the treatment of diseases,however,the overuse of antibiotics and harmful social problems has become a public problem affecting public health. Aptamers,a kind of chemical antibodies,reveal higher specificity and affinity to target with the improvement of aptamer screening technology. In this paper,the latest research recently for some sensing methods based on aptasensing technologies were summarized,from the electrochemistry,optics and enzyme-linked immunology respectively,which showed the application ability of aptamers in antibiotics detection and its potential applications in the exploration of research methods.

aptamer;antibiotics;sensor;detection

2016-01-20

蔡義林(1989-)，男，碩士，研究方向：生物檢測分析，E-mail：yilin10sky@163.com。

朱穎越(1983-)，男，博士，講師，研究方向：食品安全與檢測，E-mail：yyzhujnu@163.com。

江蘇省基礎研究計劃(自然科學基金)項目(BK20130379，BK20140416)；江蘇省“六大人才高峰”第十二批高層次人才選拔培養(NY-021)；蘇州市科技計劃項目(SYN201515)；2016年度大學生創新創業訓練計劃項目(省級立項)資助。

TS207.3

A

1002-0306(2016)16-0368-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.065