可溶性環氧化物水解酶抑制劑對CHD患者內皮祖細胞功能產生的影響

林偉東

可溶性環氧化物水解酶抑制劑對CHD患者內皮祖細胞功能產生的影響

林偉東①

目的：探討可溶性環氧化物水解酶抑制劑（sEHi）tAUCB對冠心?。–HD）患者內皮祖細胞（EPCs）功能產生的影響。方法：隨機選取2013年7月-2014年12月于本院心內科住院治療的38例CHD患者作為觀察組，另擇同期健康體檢的38例健康者作為對照組。分析新型sEHi tAUCB對兩組EPCs功能和血管內皮生長因子（VEGF）表達等產生的影響。結果：觀察組EPCs遷移和血管生成能力均明顯低于對照組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。此外，tAUCB呈濃度依賴性增加，CHD患者EPCs遷移和血管生成能力對其EPCs表達VEGF具有促進作用。結論：sEHi對CHD患者的EPCs功能具有良好的調節作用。

可溶性環氧化物水解酶抑制劑； CHD； 內皮祖細胞

First-author's address：Longhua New District Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518000，China

內皮祖細胞（EPCs）在干細胞治療心肌梗死過程中發揮著重要作用［1］，可溶性環氧化物水解酶抑制劑（Soluble epoxide hydrolase inhibitor sEHi）為目前臨床中普遍應用于心血管疾病治療的一類藥物，其通過作用于可溶性環氧化物水解酶（sEH），進而阻止sEH環氧二十碳三烯酸（EETs）降解為二羥基化合物（DHEH）［2-3］。本次研究旨在探討sEHi對CHD患者EPCs功能產生的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選取2013年7月-2014年12月于本院心內科住院治療的38例CHD患者作為觀察組，其中男20例，女18例；年齡50～69歲，平均（57.9±2.6）歲。所有入選患者臨床上均明確存在心肌缺血表現，同時經冠脈造影均已經確診為CHD患者。排除嚴重創傷或接受重大手術者、半年內發生腦血管意外者、甲狀腺機能減退者、腎病綜合征者、孕婦及哺乳期婦女、存在自身免疫性疾病者、存在急慢性肝膽疾病者、惡性腫瘤者、瓣膜性心臟病者、結締組織病者、心功能Ⅳ級者、過敏體質及精神病患者。另擇同期健康體檢的38例健康者作為對照組，其中21例，女17例；年齡50～68歲，平均（58.1±1.8）歲。兩組性別和年齡方面比較差異均無統計學意義（P＜0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1試驗試劑 胎牛血清為Gibco公司生產，VEGF為美國Peprotech公司生產，EGM-2培養液為美國Clonetics公司研發，淋巴細胞分離液為中國科學院血液研究所研發。人纖維粘連蛋白、FITC標記的荊豆凝集素均為美國Sigma公司生產。Di標記的乙?；兔芏戎鞍诪槊绹鳰oiecular Probe公司生產，Matrigel-Matrix為美國BD biosciences公司生產，VEGF抗體、GAPDH抗體均為英國Abcam研發。

1.2.2EPCs分離及培養 清晨于無菌條件下抽取兩組研究對象空腹肘靜脈血，抽取量均為30 mL作為樣本。將血液樣本放入含有200 μL肝素的50 mL無菌離心管中，然后將等體積的PBS液加入離心管，并進行混勻搖動。沿著管壁緩慢地將已經過稀釋的抗凝血加入盛有淋巴細胞分離液的無菌離心管（15 mL）中，淋巴細胞分離液與抗凝血的比例控制為1∶2。完成離心操作后，將乳白色單個核細胞層吸出，將其放入新的無菌離心管（15 mL）中，然后將等量的PBS液加入離心管中，并進行充分混勻［4-5］。進行離心操作之后將洗滌液去凈，然后將4 mL的EGM-2完全培養基加入離心管中，同時進行充分混勻。EGM-2完全培養基中含有濃度為20%的胎牛血清，100 U/mL的青霉素，100 U/mL的鏈霉素［6-7］。將等量的細胞移入已包被人纖維粘連蛋白的6孔板中，然后放置于37 ℃、CO2含量為5%的培養箱中進行培養，在培養的第4、6天分別進行半量換液。

1.2.3EPCs雙染色鑒定 使用PBS液將非貼壁細胞清洗掉，將2.4 mg/L Dil-acLDL貼壁細胞放置于37 ℃環境中進行1 h的孵育之后，對EPCs對Dil-acLDL的攝取情況進行檢測［7］。使用濃度為2%的多聚甲醛迪歐細胞進行10 min的固定，然后使用PBS液進行洗滌。完成洗滌之后在標本中加入10 mg/L的FITC-UEA-I，并將標本放置在37 ℃環境中進行1 h的孵育。使用激光共聚焦顯微鏡對FITC-UEA-I、Dil-acLDL雙染色陽性細胞為處于正在分化狀態的EPCs進行鑒定。

1.2.4EPCs的流式細胞儀鑒定 PBS液將非貼壁細胞洗掉之后，使用濃度為0.125%的胰酶進行5 min的消化之后將細胞進行收集。實施1000 r/min的離心操作之后使用PBS液對待測細胞濃度進行調整，調整為2×108萬個/mL。分別將10 mL的FITC標記CD31、抗CD34抗體加入，然后進行30 min的避光反應。使用冷的PBS液對細胞進行洗滌，將未結合的相關抗體全部去除，然后使用流式細胞儀進行鑒定。

1.2.5EPCs藥物處理 實施時間為7 d的EPCs培養之后，更換培養液濃度為1%的胎牛血清EGM-2進行24 h的培養，然后分別與0、10-6、10-5、10-4mol/L的sEHi tAUCB作用，作用時間為24 h。同時取對照組研究對象的EPCs進行上述處理作為對照，該組標本不加入任何藥物進行干預。

1.2.6EPCs遷移檢測 使用含有0.02% EDTA的胰蛋白酶（0.25%）對各組經過處理之后的細胞進行消化，再用沒有添加生長因子的EGM-2對細胞濃度進行調整，調整為1×105/400 μL［8-9］。將細胞添加到趨化性實驗裝置中的上層，裝置中的Transwell小室濾膜是孔徑為8 μm的聚碳酸脂微孔濾膜。將含有0、10-6、10-5、10-4mol/L的tAUCB培養液添加到下層，進行時間為24 h的孵育之后，使用細胞刷將存在于濾膜上層的未遷移細胞全部刮除，分別使用戊二醛（2.5%）和甲醇（100%）進行固定，實施HE復染，使用200倍顯微鏡隨機對10個視野進行觀測，對EPCs遷移細胞數進行測定［10-11］。

1.2.7EPCs體外血管形成能力檢測及Westem印跡 對Matrigel進行1∶2的稀釋后，將其平鋪于24孔板上，放置于37 ℃的培養箱進行1 h的培養，使得Matrigel充分聚合。取EPCs（1×104個）接種到Matrigel板，分別將含0、10-6、10-5、10-4mol/L的tAUCB培養液加入，進行24 h的孵育之后，倒置于顯微鏡對新生血管的生成情況進行觀察。

1.3統計學處理 使用SPSS 18.0軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用 χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1EPCs鑒定結果 EPCs形態：通過分離操作所得的外周血單個核細胞處于培養的第3～4天時，可以觀察到部分貼壁細胞呈不規則三角形或者梭形，梭形細胞的數量不斷增加。在培養的第7～8天時，出現諸多個集落，貼壁的梭形細胞從細胞團邊緣出芽并不斷生長，表現為放射狀分布。該種細胞中央呈圓形，周邊為放射狀梭形細胞結構為典型集落。培養至14 d時，細胞緊密融合生長，表現為“鋪路石”樣形態特征。使用激光共聚焦顯微鏡對EPCs結果進行初步鑒定，細胞可攝取Dil-acLDL，同時可與FITC-UEA-1相互結合。其中，雙染陽性細胞被認為是處于正在分化狀態的EPCs。使用流式細胞儀對接受7 d培養的細胞進行檢測時，表達血管內皮祖細胞表面標記CD34+、CD31+的陽性細胞率分別為（53.58±5.64）%和（40.45±6.58）%。

2.2tAUCB對EPCs遷移活性和體外血管形成能力產生的影響 觀察組EPCs遷移活性明顯低于對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.05），與接受處理前（0 mol/L）相比較，10-6、10-5、10-4mol/L濃度的tAUCB EPCs遷移活性隨tAUCB濃度增加而不斷增加，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。觀察組EPCs體外血管形成長度明顯低于對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.05），與接受處理前（0 mol/L）相比較，10-6、10-5、10-4mol/L濃度的tAUCB作用新生血管形成長度隨tAUCB濃度增加而不斷增加，新生血管形成長度均表現為濃度依賴性，見表1。

表1　 tAUCB對EPCs遷移活性和體外血管形成能力產生的影響（±s）

表1　 tAUCB對EPCs遷移活性和體外血管形成能力產生的影響（±s）

新生血管形成長度（mm/高倍視野）組別tAUCB濃度遷移功能（個/200視野）觀察組（n=38）0 50.21±3.64 8.68±0.11 10-6mol/L 81.25±6.5415.46±1.25 10-5mol/L 138.57±16.5446.58±3.67 10-4mol/L218.24±6.3553.64±4.61對照組（n=38） 90.32±1.3621.59±1.63

2.3CHD患者tAUCB對其EPCs表達VEGF產生的作用 處理前觀察組EPCs VEGF表達為0，處理后tAUCB 濃度為10-6mol/L時，患者EPCs VEGF表達為1.43 mol/L；tAUCB 濃度為10-5mol/L時，EPCs VEGF表達為1.49 mol/L；tAUCB濃度為10-4mol/L時，EPCs VEGF表達為1.52 mol/L，與處理前比較差異有統計學意義（P＜0.05），tAUCB對其EPCs表達VEGF呈濃度依賴性增強，提示CHD患者tAUCB對其EPCs表達VEGF表現為促進作用。

3 討論

EPCs為一類血管內皮前體細胞，其直接參與到胚胎時期的血管發生和出生之后的血管新生［13］。因為EPCs存在轉化成為血管內皮細胞，進而促進血管生成的能力，其目前已經成為對缺血性疾病進行研究的一種不可或缺的靶細胞。冠心病（CHD）實質上為一種缺血性疾病，因此，在臨床上治療CHD的關鍵及根本在于促進新生血管形成，實現血運重建［14］。

EPCs作為一類可循環、可增殖、存在多重分化功能的前體細胞，其成為治療CHD的重要研究內容。李振等［15］研究結果顯示，EPCs可通過分化和遷移等方式直接參與到缺血組織損傷修復及新生血管重建中。血管內皮生長因子（VEGF）為目前已知的一種具有最強促血管生長功能的因子，其高度特異性地對血管內皮細胞發生作用，對其遷移、分化及增殖產生良好的誘導作用，進而促進新生血管形成［13］。所以通過增加VEGF水平促進血循環中的EPCs活性得到有效增強，實現血管新生，進而促進缺血心肌血液灌注得到有效改善［16］。本次研究結果顯示，與健康者比較，CHD患者EPCs的VEGF表達明顯下降，而應用tAUCB之后，CHD患者EPCs的VEGF表達又表現出顯著增加的趨勢，且該作用表現為濃度依賴性。同時本次研究還發現，CHD患者EPCs遷移活性和血管生成能力亦有明顯增加，其增加速度與tAUCB也表現為量效關系。由此可見，sEHi制劑tAUCB對CHD患者的EPCs功能存在正向調節作用，該種作用對血管新生產生良好的促進作用，故其在促進心肌缺血缺氧狀態改善上發揮著重要作用［17］。sEH環氧二十碳三烯酸（EETs）為一類具有較強生物活性的內生性脂質環氧化合物，但是EETs在細胞內的半衰期較短，經過可溶性環氧化物水解酶（sEH）迅速催化后其失活便被降解?？扇苄原h氧化物水解酶抑制劑（sEHi）通過對sEH產生抑制作用而促進EETs效用得到明顯增強。白潔等［18］的臨床研究結果顯示，EETs對VEGF介導的血管生成作用具有良好的促進作用，所以可以推斷，sEHi-EETs-VEGF為sEHi對EPCs功能進行正向調節的一個重要通路。EPCs為血管病變細胞進行修復的一種種子細胞，使用EPCs對相關心血管疾病進行治療的方式為一種新型治療策略。在對新型藥物進行開發的過程中，應使藥物具備對EPCs特性進行調節的功能，只有這樣才能更好地實現治療效果的提高［19］。在本次研究中，對38例CHD患者應用新型sEHi制劑tAUCB之后，患者EPCs的VEGF表達得到有效促進。這個研究結果為CHD防治藥物的研制提供了一條新思路，對CHD防治效果的提高具有重要價值。

綜上所述，對CHD患者應用sEHi可對患者的內皮祖細胞功能產生正向調節作用，進而促進患者臨床癥狀及體征得到更好改善。sEHi制劑tAUCB可能成為治療CHD的一種新型藥物。

［1］王振河，姜德謙，李衛華，等.可溶性環氧化物水解酶抑制劑通過過氧化體增殖物激活型受體γ調節內皮祖細胞功能［J］.中國動脈硬化雜志，2015，23（2）：137-138.

［2］彭曉琴，張曉東，王云甫，等.sEHi對頸動脈狹窄患者外周血早期內皮祖細胞血管內皮生長因子表達的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2014，22（11）：1109-1110.

［3］黃一偉，張懷勤，毛義建，等.可溶性環氧化物水解酶基因多態性與冠心病的相關性［J］.溫州醫科大學學報，2014，9（8）：578-579.

［4］李廷波，馬琦琳，彭軍.NADPH氧化酶介導的氧化應激與心血管疾病內皮祖細胞功能障礙［J］.中南醫學科學雜志，2015，43（2）：121-122.

［5］歐陽莉娜.血清膽紅素與尿酸在冠心病患者臨床檢驗中的價值分析［J］.中國醫學創新，2013，10（27）：89-90.

［6］李曉燕，陳英劍，張國明，等.培哚普利對冠心病患者循環血內皮祖細胞及血管內皮功能的影響［J］.中國循環雜志，2015，30（1）：22-23.

［7］莫善曉.冠心病患者血清同型半胱氨酸、尿酸水平變化及臨床意義［J］.中外醫學研究，2014，12（3）：59-60.

［8］黃忠波，陸剛.血清NO水平與冠心病中醫證型的相關性研究進展［J］.中外醫學研究，2013，11（26）：152-153.

［9］趙婷婷，許丹焰，趙水平，等.可溶性環氧化物水解酶抑制劑t-AUCB對巨噬細胞脂質代謝的影響［J］.中國動脈硬化雜志，2012，20（4）：295-296.

［10］楊輝，譚曉虹.可溶性環氧化物水解酶抑制劑對心腦血管系統疾病的影響［J］.神經藥理學報，2012，2（5）：40-41.

［11］陳小林，楊興彪，胡基埂，等.環氧化物水解酶與人類疾病的關系［J］.生命的化學，2014，34（5）：660-661.

［12］杜廣勝，文淵，馬業新.RNA干擾下調小鼠心肌細胞可溶性環氧化物水解酶的表達［J］.中國動脈硬化雜志，2011，19（3）：206-207.

［13］ Liu Y，Jiang Y R，Zhang J C.Integrative Chinese and western medicine on atherosclerosis of coronary heart disease：what are the new control strategies［J］.Chinese Science Bulletin，2014，59（11）：1092-1093.

［14］黃樹斌.冠心病患者Hcy與內皮祖細胞功能及表達水平相關變化分析［J］.現代預防醫學，2012，39（5）：1271-1272.

［15］李振，蕭洪文.可溶性環氧化物酶與缺血性腦卒中的防治［J］.瀘州醫學院學報，2012，35（02）：224-225.

［16］李曉燕，陳英劍，張國明，等.冠心病患者外周血內皮祖細胞數量差異及其對內皮功能的影響［J］.山東大學學報（醫學版），2012，50（8）：73-75.

［17］孫云鵬.肝細胞生長因子對體外培養冠心病患者外周血內皮祖細胞生物學功能的影響［J］.臨床和實驗醫學雜志，2015，7（11）：891-892.

［18］白潔，孟軍，蔡澤民，等.高脂蛋白（a）的冠心病患者內皮祖細胞功能受損［J］.中國動脈硬化雜志，2015，23（4）：384-385.

［19］華先平，吳瑞霞，陳平英，等.法舒地爾對老年冠心病患者內皮祖細胞和內皮微顆粒數量及內皮功能的影響［J］.中華老年心腦血管病雜志，2013，15（12）：1285-1286.

The Influence of Soluble Epoxide Hydrolase Inhibitor for Endothelial Progenitor Cells Function in Patients with Coronary Heart Disease

L
IN Wei-dong.//Medical Innovation of China，2016，13（28）：059-062

Objective：To study the influence of soluble epoxide hydrolase inhibitor（sEHi）tAUCB for endothelial progenitor cells（EPCs） function in patients with coronary heart disease （CHD）.Method：From July 2013 to December 2014，38 cases of CHD in our hospital department of cardiology were randomly selected as the observation group and another 38 healthy persons were selected as the control group.Effects of new sEHi tAUCB on the expression of EPCs and vascular endothelial growth factor （VEGF） in two groups were analyzed. Result：The EPCs migration and angiogenesis ability in the observation group were significantly lower than control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.In addition，tAUCB showed a concentrationdependent increase，CHD patients with EPCs migration and angiogenesis in its EPCs expression of VEGF has a role in promoting.Conclusion：sEHi has an excellent regulating effect on EPCs function in patients with CHD.

Soluble epoxide hydrolase inhibitor； Coronary heart disease； Endothelial progenitor cells

①廣東省深圳市龍華新區中心醫院 廣東 深圳 518000

林偉東

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.28.016

（2015-12-25） （本文編輯：李穎）