谷氨酰胺在體內和體外試驗中對鯉免疫力影響的研究

雷五長，李錦，孫穎，曲木，李靜輝，程鎮燕

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谷氨酰胺在體內和體外試驗中對鯉免疫力影響的研究

雷五長，李錦，孫穎，曲木，李靜輝，程鎮燕通信作者

（天津農學院水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津300384）

以鯉的中腎白細胞作為研究對象，研究了谷氨酰胺對鯉免疫細胞免疫力的影響。在培養基中分別添加濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的谷氨酰胺，在細胞培養2、6、12、24 h后，分別測定白細胞的呼吸爆發活力。結果發現，添加谷氨酰胺后，鯉腎臟白細胞的呼吸爆發活力得到了明顯提高（＜0.05），且隨著培養時間的延長，呼吸爆發活力呈現先上升后下降的趨勢，最高值出現在培養12 h后的2.0 mmol/L谷氨酰胺組。在鯉腎臟白細胞培養12、24 h后，測定鯉腎臟白細胞的吞噬活力，發現白細胞吞噬活力變化趨勢和呼吸爆發活力相似，其最高值出現在1.5 mmol/L谷氨酰胺細胞培養24 h后的添加組，鯉腎臟白細胞對遲鈍愛德華氏菌殺菌率變化趨勢與吞噬活力相符，添加谷氨酰胺后的各組殺菌率最高值發生在1.5 mmol/L谷氨酰胺組，與1.0、2.0 mmol/L谷氨酰胺組之間差異均不顯著（＞0.05），但均顯著高于對照組及0.5 mmol/L谷氨酰胺組（＜0.05）。將平均體重37 g的鯉魚分為5組，每組30條，體內注射0、50、100、150、200 mg/kg魚體重的谷氨酰胺溶液，商業飼料投喂2周后分離中腎獲取鯉腎臟白細胞，發現白細胞的呼吸爆發活力和增殖活力隨谷氨酰胺濃度的增加而呈現先顯著上升后趨于平穩的趨勢（＜0.05），而吞噬活力則一直顯著升高（＜0.05），最高值均出現在200 mg/kg谷氨酰胺注射組。綜合結果表明，谷氨酰胺是鯉有效的免疫增強劑。

鯉；谷氨酰胺；吞噬；呼吸爆發；增殖

谷氨酰胺是哺乳動物體內含量最豐富的氨基酸，是快速分裂的細胞包括活化淋巴細胞和腸上皮細胞重要的能量供體，可促進淋巴細胞、巨噬細胞的有絲分裂和分化增殖，增加細胞因子TNF、IL-1等的產生和磷脂的mRNA合成[1]。在病理狀態下，補充谷氨酰胺可以促進病變或損傷組織（如肝臟或者腸道）的修復和加速患者的恢復[2]。研究表明，谷氨酰胺能增強水產動物的免疫功能[3-4]和抗病力[5]，當培養基中添加谷氨酰胺時，被激活的斑點叉尾鮰巨噬細胞產生NO量的增加，進一步說明了谷氨酰胺作為魚類免疫系統的細胞代謝燃料的必要性[6]。此外，有研究表明，飼料中補充谷氨酰胺能提高幼年雜交鱘血漿補體蛋白C3和C4[7]，以及美國紅魚嗜中性粒細胞的氧化自由基（NBT）和巨噬細胞超氧陰離子的產生[8]。

近幾年，隨著鯉的集約化養殖規模的不斷擴大，致使病害頻繁發生，給漁業生產帶來了巨大的經濟損失。而大量使用抗生素、消毒劑等化學藥物防治疾病不僅增加了生產成本，破壞了水域環境生態，而且導致水產品中藥物殘留，危害人類健康，因此，尋求病害防治新方法迫在眉睫。研究谷氨酰胺對鯉體細胞免疫力的影響，探討谷氨酰胺調節鯉免疫力的機理具有重要的學術意義，同時也為生產上提高鯉的免疫力、抗病力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

體外試驗：將平均體重約37 g的鯉放養在水溫（23±0.2）℃的水族箱中暫養，投喂商業飼料，暫養2周后取出6尾鯉，小心切除頭腎和中腎并放置于經過預先消毒處理過的培養基中，收集切除下來的頭腎和中腎，使其形成一個復合樣品用于下一步試驗中的白細胞分離。向RPMI-1640培養基中分別加入濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的谷氨酰胺（Amresco公司），得到濃度不同的5種培養基，用于白細胞的培養。用兩個獨立的復合樣品（每個樣本3個重復）進行免疫學各項指標的測定。

體內試驗：將平均體重約37 g的鯉放養在水族箱中，保持水溫（23±0.2）℃，暫養1周后，將魚隨機分成5組，每組3個重復，每個水族箱放10尾魚，向腹腔中分別注射 0、50、100、150、200 mg/kg魚體重的谷氨酰胺溶液。之后繼續投喂商業飼料，養殖2周后取樣，取頭腎放于生理鹽水中清洗表面血污，然后放在配制好的培養液中，待測。

1.2 樣品制備與測定

在尼龍網（100 μm）上，用研磨棒仔細研磨過濾上述用剪刀剪碎處理好的鯉中腎樣品，然后不斷用新的RPMI-1640培養基沖洗正在研磨的鯉中腎樣品（由2%的小牛血清、10 u/mL的肝素和100 u/mL青霉素/鏈霉素配置成此RPMI-1640培養基）。放在不連續的34%/51%的珀可溶液中，并在4 ℃下400 g離心25 min。收集位于交界處的細胞帶，然后將細胞懸浮物重新懸浮于培養基中，調整細胞懸浮液濃度至2×107個細胞/ mL，并用臺盼藍染色測定活力，要求活力均大于95%。

白細胞的呼吸爆發活力、吞噬活力、增殖能力的測定均參考王慶奎[9]的方法進行，將分離的腎白細胞懸液用HBSS調整濃度為 5×106個細胞/ mL，用于測定呼吸爆發活力。呼吸爆發系數（Respiratory Burst Index，）＝刺激孔690-未刺激孔690。將分離的腎白細胞懸液用HBSS調整濃度為 5×107個細胞/mL，用于測定白細胞的吞噬活力，吞噬活力＝試驗孔608-對照孔608。將腎白細胞用RPMI-1640增殖液（含5% 胎牛血清、2% 熱滅活鯉魚血清、100 IU/mL 氨芐青霉素和0.1 mg/mL硫酸鏈霉素）重懸，調整細胞濃度為5×105個細胞/mL，測定白細胞的增殖能力。刺激指數（Stimulation Index，）＝（受刺激細胞的平均550/未受刺激細胞的平均550）-1。

1.3 數據處理

所得數據用平均值表示，使用SPSS 16.0統計軟件做單因素方差分析（One-way ANOVA），若差異達到顯著（＜0.05），則進行Ducan’s多重比較。

2 結果與分析

2.1 培養基中補充谷氨酰胺對鯉腎臟白細胞呼吸爆發活力的影響

由圖1看出，在培養基中添加谷氨酰胺，且分別培養2、6、12、24 h后，鯉腎臟白細胞的呼吸爆發活力與沒有添加谷氨酰胺的對照組相比顯著提高。培養2 h后，添加谷氨酰胺組顯著高于對照組（＜0.05），其余各組間差異不顯著（＞0.05）；培養6 h后，添加谷氨酰胺的各組呼吸爆發活力均高于對照組，但各組間均沒有顯著差異（＞0.05）；培養12 h后，0.5 mmol/L組與對照組間沒有顯著差異，均顯著低于1.0、1.5、 2.0 mmol/L添加組（＜0.05）；培養24 h后，呼吸爆發活力與12 h相比，有所下降，0.5 mmol/L組與對照組間沒有顯著差異，添加谷氨酰胺的各組間也沒有顯著差異。隨著培養時間的延長，呼吸爆發活力呈現先上升后下降的趨勢，在各個培養時間段，呼吸爆發活力的最高值均出現在 2.0 mmol/L谷氨酰胺添加組。

（注：圖中所給數據為平均值，同組不同字母表示差異顯著（＜0.05），下同）

2.2 培養基中補充谷氨酰胺對鯉腎臟白細胞吞噬活力的影響

由圖2看出，經過培養12 h和24 h后，鯉腎臟白細胞的吞噬活力與沒有添加谷氨酰胺的對照組的吞噬活力相比，其吞噬活力有了一定提高。經過培養12 h后，1.0、1.5、2.0 mmol/L組間無顯著差異（＞0.05），0.5 mmol/L與對照組間無顯著差異（＞0.05），1.0、1.5、2.0 mmol/L組吞噬活力均顯著高于0.5 mmol/L谷氨酰胺組與對照組。隨著培養時間的延長，培養24 h后，添加 0.5 mmol/L谷氨酰胺組顯著高于對照組（＜0.05），而1.0、1.5、2.0 mmol/L組間差異不顯著（＞0.05），但均顯著高于對照組和0.5 mmol/L谷氨酰胺組（＜0.05）。

2.3 培養基中補充谷氨酰胺對鯉腎臟白細胞增殖效果的影響

如圖3所示，添加谷氨酰胺培養12 h后， 0.5 mmol/L谷氨酰胺組白細胞的增殖效果與沒有添加谷氨酰胺的對照組相比，無顯著差異（＞0.05），添加1.0、1.5、2.0 mmol/L谷氨酰胺的各組間差異不顯著（＞0.05），與對照組間存在顯著差異（＜0.05），最高值發生在1.5 mmol/L谷氨酰胺組。培養48 h后，0.5 mmol/L谷氨酰胺組與對照組間沒有顯著差異（＞0.05），1.0、1.5、2.0 mmol/L谷氨酰胺組與對照組間均存在顯著差異（＜0.05），1.5、2.0 mmol/L谷氨酰胺組間沒有顯著差異（＞0.05），最高值發生在2.0 mmol/L谷氨酰胺組。

2.4 谷氨酰胺對鯉腎臟白細胞呼吸爆發、吞噬和增殖活力的影響

從表1可知，注射25、50 mg/kg谷氨酰胺的鯉魚，其呼吸爆發活力與對照組間沒有顯著差異（＞0.05），注射100、200 mg/kg 谷氨酰胺的鯉魚，其呼吸爆發活力顯著高于對照組（＜0.05）。

表1 谷氨酰胺對鯉魚腎臟白細胞呼吸爆發、吞噬和增殖活力的影響

注：表中小寫字母表示＝0.05水平上差異顯著

在吞噬活力中，各組間均存在顯著差異（＜0.05），最高值出現在200 mg/kg組。在增殖活力中，25 mg/kg谷氨酰胺組與對照組沒有顯著差異（＞0.05），50、100、200 mg/kg谷氨酰胺處理組增殖能力均顯著高于對照組（＜0.05），最高值出現在200 mg/kg處理組。由表1可以看出，鯉魚腎臟白細胞的呼吸爆發活力、吞噬和增殖能力均隨注射谷氨酰胺濃度的增高而增高。

3 討論

3.1 谷氨酰胺對鯉腎臟白細胞呼吸爆發活力的影響

呼吸爆發是組織在重新獲得氧供應的短時間內，激活的中性粒細胞耗氧量顯著增加，產生大量氧自由基，是在細胞發揮免疫作用中，病原微生物被吞噬后，免疫細胞的一種氧依賴的殺傷機制。體外試驗表明，添加了谷氨酰胺各個組鯉腎臟白細胞的呼吸爆發活力都比未添加谷氨酰胺的對照組有不同程度的提高，體內試驗結果也表明，隨著谷氨酰胺濃度的增加，白細胞呼吸爆發活力顯著提高。因此，無論是在培養基中添加還是體內注射谷氨酰胺都有助于鯉白細胞產生NO，進而刺激超氧陰離子的產生，提高呼吸爆發活力。有研究表明，在飼料中補充適當的谷氨酰胺能提高嗜中性粒細胞的氧化自由基（NBT）和巨噬細胞超氧陰離子的產生[8]，大量自由基能夠殺死吞入胞內的病原，細胞的吞噬和殺菌能力也增強，從而提高細胞的免疫力。這一試驗結果與本試驗結果相符，相似的結果也在斑點叉尾鮰[10]上得到驗證。

3.2 谷氨酰胺對鯉腎臟白細胞吞噬活力的影響

吞噬細胞的吞噬作用是魚類最重要的非特異性免疫反應，在免疫調節中起著重要作用。白細胞作為重要的免疫細胞起著吞噬細菌、預防疾病的作用。有研究表明，谷氨酰胺為哺乳動物吞噬細胞提供能量ATP，為細胞合成DNA和mRNA提供嘌呤、嘧啶、核苷酸生物合成的前體物質，谷氨酰胺還能合成精氨酸，精氨酸的代謝產物NO在免疫調節方面發揮重要作用[1]。在本研究中，補充谷氨酰胺后，白細胞的吞噬活力顯著提高，這一結論和在斑點叉尾鮰[10]和牙鲆[11]上的研究結果相同。體外試驗中，隨著谷氨酰胺濃度的升高，白細胞的吞噬活力趨于穩定，與在體內的研究結果略有不同，有研究表明，高劑量胞外谷氨酰胺會干擾內皮細胞和吞噬樣細胞系NO的產生[12]，所以，隨著谷氨酰胺濃度的進一步升高，白細胞的吞噬、呼吸爆發活力和增殖能力可能不會進一步提高，反而得到抑制，但仍需進一步研究來證實。

3.3 谷氨酰胺對鯉腎臟白細胞增殖的影響

研究表明，谷氨酰胺可促使哺乳動物淋巴細胞、巨噬細胞的有絲分裂和分化增殖[1]。也有研究表明，谷氨酰胺可作為魚類免疫系統細胞代謝的燃料[6]。本研究中發現，無論是體外試驗還是體內試驗，添加谷氨酰胺后，白細胞的增殖效果得到顯著提高，這一結果與在斑點叉尾鮰[10]、石斑魚[13]、鯉魚[14]上的研究結果相似，但在虹鱒[15]和鯛魚[16]上的研究中表明，在沒有谷氨酰胺的情況下，細胞依然增殖良好。不同的試驗結果與試驗動物的種類有關，尤其是谷氨酰胺在水產動物上的研究還處于初級階段，谷氨酰胺作為哺乳動物必需的細胞能量供體，在魚類上是否有類似效果還需進行深入探討。

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Effects of Glutamine on Immunity of CarpandExperiments

LEI Wu-chang，LI Jin，SUN Ying，QU Mu，LI Jing-hui，CHENG Zhen-yanCorresponding Author

（Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture，College of Fishery Science，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

This experiments were conducted to evaluate the effects of glutamine on the immune responses of kidney leukocytes in common carp. Five different groups were formulated by supplementing 0，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L glutamine into the basal culture medium. After the leukocytes were cultured 2，6，12，24 h，the respiratory burst activity of leukocytes were determined，respectively. The results showed that with glutamine supplemented into the culture medium，respiratory burst activity of leukocytes significantly improved and with prolongation of culture time and respiratory burst activity increased firstly（＜0.05），and then decreased. The peak occurred in 2.0 mmol/L glutamine group at 12 h. And then，leukocyte phagocytic activity was determined after cultured for 12 h and 24 h. The phagocytic activity change trend was similar with respiratory burst activity，the highest value occurred in 1.5 mmol/L glutamine group at 24 h. And no significant differences were found in 1.0，1.5， 2.0 mmol/L glutamine group，but the killing ability of leukocytesin these three groups were significantly higher than that in basal group and 0.5 mmol/L glutamine group（＜0.05）.experiment，the average weight 37 g carp were divided into 5 groups. 0，50，100，150，200 mg/kg glutamine were injected to five different group. Then，fish was fed commercial diet for 2 weeks. Results demonstrated that with the increasing concentration of glutamine the kidney leukocyte respiratory burst and phagocytosis activity significantly increased firstly（＜0.05），and then leveled off，while the proliferation activity kept increased significantly（＜0.05）. The results of this experiment indicate that glutamine is the effective immunomodulatory in carp leukocytes.

; glutamine; phagocytosis; respiratory burst; proliferation

S963.71

A

1008-5394（2016）03-0035-04

2015-12-14

天津農學院大學生創新計劃項目“研究離體條件下谷氨酰胺對石斑魚體細胞免疫力的影響”（11-D-3）

雷五長（1988-），男，福建三明人，學士，主要從事水產動物營養與飼料研究。E-mail：leiwuchangnumber@163.com。

程鎮燕（1981-），女，山東泰安人，副教授，博士，研究方向為魚類營養生理與免疫。E-mail：chengzhenyan2005@126.com。