麻風患者血清Th1/Th2/Th17相關細胞因子檢測

李建可　王　川　李富榮　初同勝　劉殿昌　于修路　劉　紅　張福仁

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·論著·

麻風患者血清Th1/Th2/Th17相關細胞因子檢測

李建可1,2王川2李富榮2初同勝2劉殿昌2于修路2劉紅2張福仁2

目的：檢測麻風患者血清中Th1/Th2/Th17相關細胞因子水平，探討其在麻風發病中的作用。方法：利用微量樣本多重蛋白定量技術檢測12例新發麻風患者，29例治愈麻風患者及37例正常人血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ和IL-17A水平。利用Kruskal-Wallis和Nemenyi方法進行組間比較。結果：新發組患者血清IL-1和IL-2水平顯著高于治愈組(P<0.005)；新發組及治愈組患者血清IL-6水平均顯著高于對照組(P<0.005)；新發組患者血清IFN-γ 和IL-17A水平顯著高于對照組(P<0.005)。新發組、治愈組和對照組IL-4、IL-10和TNF濃度差異無統計學意義。結論：Th1/Th2/Th17某些相關細胞因子可能與麻風的發病有關。

麻風；細胞因子；微量樣本多重蛋白定量技術

麻風是由麻風分枝桿菌感染易感個體，特異性破壞皮膚與外周神經系統，晚期可致殘的一種慢性肉芽腫性傳染病[1,2]。全球每年報道的新發麻風患者超過20萬例。2014年，中國新增麻風患者823例，其中包括復發患者53例[3]。

麻風的臨床表現多種多樣，呈“光譜”狀分布。據此，Ridley-Jopling分型將麻風劃分出兩個迥然不同的極型，即“結核樣型麻風”和“瘤型麻風”，兩極型間

還存在廣闊的中間類型[4]。自分型理論提出后，Th1、Th2細胞應答機制被研究者們用來解釋麻風多樣的臨床表現，它們通過分泌不同的細胞因子，決定了麻風發展為多種臨床類型的方向[5]。

結核樣型麻風患者組織中以Th1型細胞因子為主，如IL-2、IFN-γ和TNF-α等[5]。IL-2能誘導單核細胞遷移到真皮中，增強機體對抗麻風分枝桿菌的細胞免疫應答；IFN-γ作為Th1細胞主要效應因子，能夠激活抗原提呈細胞，通過上調轉錄因子T-bet而促進Th1細胞分化；同時，IFN-γ和TNF-α協同控制病原菌感染，在結核分枝桿菌感染中，抑制TNF-α發揮作用會導致潛伏性肺結核復發[6,7]。瘤型麻風患者體內缺乏麻風分枝桿菌特異性的細胞免疫，組織中以Th2型細胞因子為主[5]。Th2細胞分泌IL-4、5、6、10等細胞因子，能夠刺激B細胞增殖并產生IgG、IgE等抗體，通過抗原抗體結合發揮免疫效應達到抗感染目的，IL-10還能與誘生型一氧化氮合酶相互作用參與麻風中T細胞免疫反應引起的神經損傷[8]。Th17細胞是近年來發現的除Th1、Th2外第三種T輔助細胞群，IL-17是其分泌的最主要的細胞因子，有研究發現，它們在自身免疫性疾病及感染性疾病中發揮重要作用。特別是在感染性疾病中，IL-17通過誘導中性粒細胞活化，有效介導了炎癥反應，Th17細胞則在分枝桿菌感染中參與肉芽腫的形成[9]。

MDT聯合化療方案的推廣，使得麻風發病率明顯下降[3]。但判愈后患者體內免疫相關細胞因子是否恢復至正常水平，麻風復發及后續發生的I型和II型麻風反應是否與之相關，這些問題曾一度成為科學家們的研究熱點。Joshi等[10]發現多菌型麻風患者治療后體內會產生部分IFN-γ和IL-2以對抗麻風分枝桿菌抗原，而未經治療的患者體內細胞免疫處于無特異性應答的狀態。Esquenazi等[11]也發現IFN-γ和IL-2水平只在治愈1～2年的患者體內升高，治愈的多菌型麻風患者體內IFN-γ水平會隨著治愈年限的延長而逐漸降低，體內IL-6仍處于較高水平。治愈后復發的患者體內IL-1、6和TNF的水平較新發患者顯著升高。

為客觀分析各細胞因子在麻風患者血清中治療前后的變化規律，本研究在新發麻風，治愈麻風及正常對照三組樣本中檢測Th1/Th2/Th17相關細胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A在血清樣本中的水平變化，分析各組間差異。

1　研究對象與方法

1.1研究對象12例麻風患者均為2015年3～9月就診于山東省皮膚病性病防治研究所門診的新發現麻風患者，其中男6例，女6例，年齡(52.5±17.4)歲，病程(56.5±38.0)個月。29例已判愈患者均為2015年6～9月我所隨訪的經規范治療的麻風患者，其中男21例，女8例，年齡(67.1±13.9)歲，病程(84.3±73.3)個月。均經涂片查菌和病理確診。37例正常人均為我所體檢合格健康人員，無其他感染性疾病和自身免疫性疾病，其中男17名，女20名，年齡和性別與患者組無統計學差異，具可比性。

1.2標本采集與檢測新發患者組、已判愈患者組和正常對照組均取清晨空腹靜脈血5 mL，存于無菌促凝采血管中，采集后2 h內進行離心，分離出血清后置于血清凍存管中-80℃冰箱保存備用。

主要試劑及儀器：試劑為BD Cytometric Bead Array Human Soluble Protein Master Buffer Kit(IL-1)、Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit，儀器為FACS Verse流式細胞儀，檢測使用CellQuest自動軟件，數據分析采用FCAP Array分析軟件，均為美國BD公司產品。

檢測內容：患者組與對照組血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ、IL-17A等細胞因子。

1.3方法實驗條件準備：打開流式細胞儀，進行儀器調整，從CBA kit中拿出cytometer setup beads，設定本實驗所需的各種特定參數(設門，調節電壓、補償)。

標準曲線制備：依照試劑盒說明書梯度稀釋細胞因子標準品：1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256等9種濃度及空白對照。

待測樣本制備：待測血清于-80℃冰箱取出后，室溫靜置30 min，12000 g離心5 min，取上清50 μL于待測管中。Human Soluble Protein Master Buffer Kit(IL-1)試劑盒操作步驟：①在12×75 mm流式上樣管中各加入50 μL待測血清；②每管加入50 μL混合微球；③輕柔混勻，室溫孵育1 h；④每管加入50 μL PE標記的檢測抗體；⑤輕柔混勻，室溫孵育2 h。⑥每管加入1 mL洗液清洗樣本，200 g離心5 min；⑦小心吸去或輕柔倒掉上清液，每管加入300 μL洗液重懸微球。Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit試劑盒操作步驟：①在12×75 mm流式上樣管中各加入50 μL混合好的捕獲微球；②每管加入50 μL待測血清；③每管加入50 μL人Th1/Th2/Th17 PE檢測試劑；④室溫避光孵育3 h；⑤每管加入1 mL洗液，200 g離心5 min；⑥小心吸去上清，每管加入300 μL洗液重懸微球。上機檢測與分析：渦旋充分混勻(約3～5 s)立即上機，自動得出標準曲線及計算結果。

1.4統計學方法應用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行統計描述和分析，正態分布的計量資料使用中位數(P50)和百分位數(P25，P75)描述；多組非正態分布資料間的比較采用Kruskal-Wallis檢驗，P<0.05為差異有統計學意義；組間的多重比較采用Nemenyi檢驗[12]，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A在新發組、治愈組和對照組的檢測結果(表1)，Kruskal-Wallis檢驗結果顯示IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-17A在新發組、治愈組和對照組的濃度差異有統計學意義，IL-4、TNF在新發組、治愈組和對照組的濃度差異無統計學意義。

2.2IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A在新發組與治愈組、新發組與對照組、治愈組與對照組之間的檢驗結果見表2。Nemenyi檢驗結果示IL-1、IL-2在新發組與治愈組之間的濃度差異有統計學意義，IL-6在新發組與對照組、治愈組與對照組之間的濃度差異有統計學意義，IFN-γ、IL-17A在新發組與對照組之間的濃度差異有統計學意義，IL-10在新發組與治愈組、新發組與對照組、治愈組與對照組之間的濃度差異均無統計學意義。

表1　IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A等8種細胞因子在新發組、治愈組和對照組的檢測結果

表2　Nemenyi檢驗新發組、治愈組和對照組的檢驗結果

3　討論

結核樣型麻風患者組織中以Th1型細胞因子分布為主，瘤型麻風患者體內缺乏麻風分枝桿菌特異性的細胞免疫，組織中以Th2型細胞因子分布為主[5]。Madan等[13]發現，新發麻風患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-10水平顯著高于正常對照組；結核樣型麻風患者血清中TNF-α、IFN-γ水平較正常對照組顯著升高；瘤型麻風患者血清中IL-1β、IL-10水平較正常對照組顯著升高。Moubasher等[14]的研究結果也支持這一現象，瘤型麻風患者血清中IL-1β(88.5±44.83)pg/mL、IL-2R(3150±2194.82)pg/mL和IL-10(102.16±25.69)pg/mL水平顯著高于對照組IL-1β(10.93±3.07)pg/mL、IL-2R(775.55±233.69)pg/mL和IL-10 (32.05±7.65)pg/mL。

IFN-γ可以激活機體的抗菌機制，通過誘導誘生型一氧化氮合酶的生成，導致一氧化氮的產生，后者通過對靶細胞的毒性作用發揮殺傷作用[15]。IFN-γ還可以誘導巨噬細胞分泌TNF-α，兩者在結核樣型麻風患者體內高表達證明了IFN-γ和TNF-α在機體殺滅病原菌和肉芽腫形成中起到了免疫保護作用[13]。此外，TNF-α可能會直接損傷髓鞘和少突膠質細胞，也有刺激骨質吸收、抑制骨膠原蛋白合成的作用。TNF-α的這些功能可為麻風患者出現的神經損傷及畸殘等臨床表現提供合理解釋[16]。麻風桿菌侵染機體后，活化的巨噬細胞可分泌IL-1，它能夠增強NK細胞的活性，對中性粒細胞、巨噬細胞以及淋巴細胞，特別是Th2細胞有趨化和增強的作用，同時促進IL-2的分泌，在麻風免疫反應中起重要作用[14,17]。IL-2也稱為T細胞生長因子，Kaplan等[6]為14例瘤型麻風患者注射重組IL-2后，監測到患者體內麻風桿菌BI指數與PGL-1水平顯著下降，單核細胞、中性粒細胞和嗜酸粒細胞等顯著升高。

Th17細胞亞群的發現，彌補了Th1/Th2介導效應機制的不足[18]。IL-17A作為其最主要的效應因子，具有強大的致炎性，能刺激IL-6和前列腺素E2的生成，增強局部炎癥，同時通過上調IL-1β、IFN-γ等炎癥細胞因子的基因表達，促進局部炎癥的進展和擴大[19]。Th17細胞不但能促進炎性反應，而且加強了機體的防御功能。Saini等[20]認為在機體無力啟動Th1型細胞免疫應答或Th0細胞未完成向Th1、Th2細胞分化時，Th17細胞可能作為一種替代途徑達到殺滅病原菌的目的。

本研究發現，新發麻風患者血清IL-1、IL-2細胞因子表達水平顯著高于治愈患者，此結果與Moubasher等[14]發現的新發麻風患者血清中IL-1β(56.14±30.92)pg/mL、IL-2R(1 855.55±1 222.95)pg/mL和IL-10(81.44±32.69)pg/mL水平顯著高于治療后患者血清中IL-1β(20.25±12.31)pg/mL、IL-2R(1049.44±748.03)pg/mL和IL-10(49.17±20.98)pg/mL水平一致。原因可能為在麻風患者體內，免疫系統經麻風分枝桿菌抗原刺激后產生了過多的細胞因子，但經過MDT多藥聯合化療后，麻風分枝桿菌被消滅，抗原的去除使得細胞因子的分泌減少甚至恢復到正常對照的水平。此外，聯合化療的藥物中，氯法齊明和氨苯砜均具有強大的抑菌抗炎作用，聯用可以大幅度減少相關細胞因子的分泌。

本研究還發現新發麻風患者血清IFN-γ、IL-17A細胞因子表達水平顯著高于正常對照組，這與de Almeida-Neto等[9]的研究結果一致，發現IFN-γ和IL-17A在麻風患者體內呈正相關，同時在與其他細胞因子協同控制感染的過程中也呈正相關，由此說明Th1、Th17細胞在麻風分枝桿菌侵染后機體的免疫應答過程中起重要作用。

本研究證實了IL-1、IL-2、IFN-γ和IL-17A在新發麻風患者血清中的高水平表達，預示著以上細胞因子在麻風發病免疫反應過程中的重要作用。同時，沒有發現IL-4、IL-10和TNF-α等細胞因子在新發患者組、治愈患者組與正常對照組之間有顯著差異，這可能與實驗樣本量不足、治愈患者年代久遠等因素有關。由此可知，Th1、Th2、Th17細胞及相關細胞因子確實參與了麻風發生、發展的免疫應答，且多藥聯合化療在殺滅麻風分枝桿菌同時對機體免疫狀態也會產生影響，此外，多種細胞因子在外周血中濃度的變化對臨床麻風患者的病情評估，治療及疾病預后有一定的參考及指示價值。

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(收稿：2016-03-31)

Detection of serum Th1, Th2 and Th17 related cytokines in the patients with leprosy

LIJianke1,2,WANGChuan2,LIFurong2,CHUTongsheng2,LIUDianchang2,YUXiulu2,LIUHong2,ZHANGFuren2.

1.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062 ,China; 2.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenereology,Jinian250022,China

Correspondingauthor:ZHANGFuren,E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Objective: To detect the levels of Th1, Th2 and Th17 related cytokines in the patients with leprosy and to explore the role of those cytokines in leprosy. Methods: The serum levels of IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-γ and IL-17A were detected by flow cytometric bead array in 12 newly reported leprosy patients, 29 cured leprosy patients and 37 healthy controls. The differences between groups were compared by Kruskal-Wallis test and Nemenyi test. Results: The levels of IL-1 and IL-2 in newly reported leprosy patients were higher than that in cured leprosy patients, with significant difference (P<0.005). The levels of IL-6 in newly reported leprosy patients and cured leprosy people were higher than those in healthy controls (P<0.005). The levels of IFN-γ and IL-17A in newly reported leprosy patients were higher than those in healthy controls (P<0.005). There was no difference in the levels of IL-4，IL-10 and TNF among newly reported leprosy patients, cured leprosy patients and healthy controls. Conclusion: Th1, Th2 and Th17 related cytokines may be associated with the development of leprosy.

leprosy; cytokines; flow cytometric bead array

1濟南大學 山東省醫學科學院 醫學與生命科學學院,濟南,250062

2山東省皮膚病性病防治研究所,濟南,250022

張福仁，E-mail: zhangfuren@hotmail.com