丁苯酞對缺血大鼠大腦皮質中鈣通道Cav1.3表達的影響

郭 森， 朱 江， 王永為， 楊松鶴， 孔祥玉

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丁苯酞對缺血大鼠大腦皮質中鈣通道Cav1.3表達的影響

郭 森1， 朱 江2， 王永為1， 楊松鶴1， 孔祥玉1

目的 探討丁苯酞對腦缺血大鼠大腦皮質中鈣通道Cav1.3表達的影響及其腦保護作用的機制。方法 雄性Wistar大鼠36只，隨機分為假手術組、缺血對照組和丁苯酞治療組，每組12只。采用免疫組織化學方法和蛋白質印跡法分別檢測各組大鼠大腦皮質中鈣通道Cav1.3表達的情況。采用TUNEL 法觀察大鼠大腦皮質內細胞凋亡的情況。結果 與缺血對照組比較，丁苯酞治療組大鼠大腦皮質中鈣通道Cav1.3表達有所增加(P<0.05)，但仍低于假手術組(P<0.05)，大腦皮質中凋亡神經元數量丁苯酞治療組明顯少于缺血對照組但多于假手術組(P<0.05)。結論 丁苯酞可以抑制缺血造成的腦皮質中鈣通道Cav1.3表達的減少，減少缺血后大腦皮質中的神經元凋亡。

丁苯酞； 腦缺血； 大腦皮質； L型鈣通道； 大鼠

L型鈣通道是電壓依賴型鈣通道，可進一步分為Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4 4個亞型。Cav1.3鈣通道主要分布于中樞神經系統，參與鈣穩態、激素分泌、基因表達和突觸可塑性等多種功能的調控，并在神經元的存活和死亡中有重要作用[1]。

丁苯酞(n-butylphthalide，NBP)，是我國具有獨立自主知識產權的國產I 類化學新藥，可以通過提高腦血流量、抗神經細胞凋亡、抑制氧化應激、減輕腦水腫等諸多途徑對抗缺血后所造成的神經元損傷[2～5]。多年以來對其作用機制的研究一直廣受關注，本項目應用免疫組織化學和蛋白印跡的方法，對丁苯酞在腦組織缺血過程中神經元鈣通道Cav1.3表達方面的影響進行研究，以探討丁苯酞在腦缺血過程中通過鈣通道Cav1.3途徑發揮保護作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組及用藥 SPF級Wistar成年健康雄性大鼠，200～220 g，36只大鼠隨機分為3組，假手術組、缺血對照組和丁苯酞治療組，每組12只，其中6只用于制作免疫組化標本，6只用于制作蛋白印跡標本。缺血組大鼠阻斷左側椎動脈和雙側頸總動脈。假手術組只暴露左側椎動脈和雙側頸總動脈，不予阻斷。丁苯酞治療組大鼠術后，使用玻璃注射器進行腹腔注射丁苯酞注射液(2ml/kg)，其余各組大鼠給予等量的生理鹽水腹腔注射。

1.2 主要藥品及試劑 丁苯酞氯化鈉注射液(中國石家莊制藥集團有限公司)，兔源性抗Cav1.3抗體(購自abcam公司)，生物標記的山羊抗兔IgG抗體(購自北京中杉金橋公司)，小鼠源性抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體、總蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒、ECL化學發光底物(均購自武漢博士德公司)，TUNEL試劑盒(購自羅氏公司)。

1.3 大鼠腦缺血模型的制備 結扎雙側頸總動脈：Wistar大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)，仰位固定于手術操作臺上，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌及氣管旁血管和神經，暴露雙側頸總動脈并結扎切斷，檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。

電凝左側椎動脈：Wistar大鼠俯位固定于手術操作臺上，于第1頸椎水平沿后正中線切開皮膚，逐層分離肌肉，暴露第1頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入左側橫突孔內電凝椎動脈2 s，重復一次。檢查無活動性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。蘇醒后，保溫飼養24 h。

1.4 標本的采集

1.4.1 免疫組化標本的采集 各組大鼠于相應時段后，腹腔內注射10%的水合氯醛麻醉(350 mg/kg)，開胸行主動脈插管，以200 ml生理鹽水經主動脈快速沖洗，隨后灌入4%多聚甲醛400 ml，固定，取出腦組織。組織后固定一夜，30%蔗糖中浸至組織下沉后行冠狀切面冷凍切片(厚40 μm)。

1.4.2 Western blot標本的采集 各組大鼠于相應時段后，腹腔內注射10%的水合氯醛麻醉(350 mg/kg)，迅速斷頭取腦，PBS清洗血液，濾紙吸干表面液體，分提出大腦皮質，稱重，組織勻漿，提取蛋白，BCA法對蛋白進行定量。蛋白樣品-80 ℃保存。

1.5 免疫組織化學染色 切片在0.01 mol/L PBS中漂洗10 min×2，含0.3%H2O2的PBS中30 min滅活內源性過氧化物酶，PBS中漂洗10 min ×3，含5%山羊血清2%BSA(Bovine Serum Albumin)的PBST(含0.1%TritonX-100 的0.01 mol/L PBS)封閉2 h，兔源性抗Cav1.3抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜，切片在PBST中漂洗15 min × 4，生物標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶400)室溫孵育1 h，PBST中漂洗10 min×3，親和素-生物素-過氧化物酶復合物(1∶100)室溫孵育1 h，PBS中漂洗10 min×3，在0.05% DAB 顯色液(0.05% DAB，0.03% H2O2，0.01 mol/L PBS緩沖液) 顯色7 min，貼片后，常規脫水、透明、封片。

1.6 Western blot步驟 6%SDS-PAGE凝膠電泳(120 V，2.5 h)，轉膜(300 mA，2 h)，蛋白上樣量100 μg，5%BSA中封閉2 h，兔源性抗Cav1.3抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗10 min×3，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體(1∶2000)室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3，ECL超敏發光液顯影。

1.7 細胞凋亡檢測 按原位細胞凋亡檢測試劑盒提供的實驗步驟進行，DAB顯色。細胞核中有黃褐色顆粒者為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞。

1.8 圖像分析 免疫組織化學染色和細胞凋亡檢測的圖像采集時，嚴格保持照相條件的一致。照片輸入Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件，進行圖像處理。免疫組織化學染色照片，各組均取相同皮質部位，分析皮質染色的平均光密度。細胞凋亡檢測的照片，各組均取相同皮質部位，計數陽性細胞個數。

蛋白印跡的膠片掃描后，采用Image-Pro Plus 6.0軟件對顯影條帶進行分析，以目的條帶和β-actin條帶的IOD比值作為目的蛋白的相對表達水平。

2 結 果

2.1 鈣通道Cav1.3 免疫組織化學染色 切片中鈣通道Cav1.3被染成棕黃色顆粒，位于細胞質內。假手術組大鼠大腦皮質各層中均有大量鈣通道Cav1.3表達(見圖1A)；缺血對照組大鼠大腦皮質中各層中鈣通道Cav1.3表達明顯減少(見圖1B)；丁苯酞治療組大鼠大腦皮質中鈣通道Cav1.3表達與缺血對照組相比有明顯增加，但仍少于假手術組(見圖1C)(見表1)。

2.2 TUNEL法檢測凋亡細胞 切片中細胞核中有黃褐色顆粒者為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞。各組皮質中均可見TUNEL陽性細胞，假手術組陽性細胞數量較少，且染色較淺邊界不清(見圖1D)；缺血對照組大鼠大腦皮質中TUNEL陽性細胞數量多，染色深邊界清晰(圖1E)；丁苯酞治療組皮質中TUNEL陽性細胞數量較缺血對照組有所減少，但仍明顯多于假手術組(見圖1F)。各組間TUNEL陽性細胞數量差異有顯著性(P<0.05)(見表1)。

組別鈣通道Cav1.3染色OD值凋亡細胞假手術組缺血對照組丁苯酞治療組336.82±53.14123.03±19.58*204.68±16.27*△16.37±3.2839.14±4.03*26.83±3.92*△

與假手術組比較*P<0.05，與缺血對照組比較△P<0.05

A：假手術組鈣通道Cav1.3表達；B：缺血對照組鈣通道Cav1.3表達；C：丁苯酞治療組鈣通道Cav1.3表達；D：假手術組凋亡細胞；E：缺血對照組凋亡細胞；F：丁苯酞治療組凋亡細胞

圖1 大鼠大腦皮質鈣通道Cav1.3免疫組織化學染色和TUNEL凋亡細胞檢測

2.3 蛋白印跡檢測鈣通道Cav1.3表達 大鼠大腦皮質中鈣通道Cav1.3表達情況(見圖2、圖3)，丁苯酞治療組大鼠大腦皮質中Cav1.3與β-actin IOD比值明顯大于缺血對照組大鼠(P<0.05)，但仍小于假手術組大鼠(P<0.05)，提示丁苯酞對于缺血后大鼠腦組織中的鈣通道Cav1.3有保護作用。

1：假手術組；2：缺血對照組；3：丁苯酞治療組

與假手術組比較*P<0.05；與缺血對照組比較△P<0.05

3 討 論

在缺血性神經元損傷的過程中，細胞內Ca2+超載是公認的啟動細胞損傷的關鍵因素。而細胞外的Ca2+內流是形成胞內Ca2+超載的主要原因。L-型鈣通道是電壓依賴性鈣通道，有α1、α2、β、δ和γ5個亞單位組成。根據編碼α1亞單位的基因，L-型鈣通道又可分為Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4 4種類型。其中Cav1.3在中樞神經系統有著較為廣泛的分布，其在Ca2+超載過程中的作用一直廣受關注[2～5]。以往有研究顯示，缺血狀態下大鼠大腦皮質中的L-型鈣通道開放明顯增加，提示L-型鈣通道可能是Ca2+內流的主要通道[6]。同時L-型鈣通道拮抗劑在缺血早期對神經元保護作用的相關研究也支持上述觀點[7]。

但在本研究中L-型鈣通道Cav1.3在大鼠大腦皮質中的表達并未隨缺血損傷的加重而增加，反而呈現出表達減少的趨勢。出現這一現象可能基于下述兩個原因。(1)L-型鈣通道Cav1.3在正常神經元中參與多種重要的生理功能，如神經元的基因調節，神經元的發育過程等。Hirtz等在他們的研究中就曾指出，鈣通道Cav1.3在小鼠與聽覺相關的腦干發育過程中起重要作用[8]。Nunez-Santana等的研究也顯示，在年老大鼠的海馬中鈣通道Cav1.3總的表達是減少的[9]。缺血會對神經元的正常功能造成嚴重的影響。這種影響的機制是多方面的，而鈣通道Cav1.3功能和表達的改變是很難被我們排除在這些機制以外的。特別是在持續的慢性缺血過程中，鈣通道Cav1.3的變化很可能不同于急性缺血性損傷，它對神經元的影響也不會只局限于Ca2+超載這一個方面，其在正常神經元中所參與的生理功能的紊亂可能是造成神經元損傷更重要的機制。(2)對于Ca2+在缺血性神經元損傷中的作用，近期也有了一些不同的觀點，認為降低胞內Ca2+，反而會促進凋亡。已有報道指出，大腦皮質神經元長期接觸L-型鈣通道拮抗劑，使胞內Ca2+降低可誘導神經元凋亡[10]，而L-型鈣通道激動劑Bay K8644可以阻斷缺糖缺氧誘導的細胞凋亡[11]。由此可以推斷，在慢性缺血過程中鈣通道Cav1.3表達的減少也可能正是其導致遲發性神經元死亡的原因。這也正可以解釋L-型鈣通道拮抗劑在神經保護作用方面所引起的爭議[12]。

L-鈣通道Cav1.3雖近幾年已被許多研究人員所關注，但對其在中樞神經系統所執行的具體功能還有待進一步的研究和探索。

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Effects of n-butylphthalide on expression of calcium channel Cav1.3 in ischemic cerebral cortex in rats

GUOSen，ZHUJiang，WANGYongwei，etal.

(DepartmentofHumanAnatomy，AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China)

Objective To investigate the effects of n-butylphthalide on expression of calcium channel Cav1.3 in ischemic cerebral cortex in rats. Methods 36 Male Wistar rats were divided randomly into three groups：a sham group，an ischemia group and a butylphthalide treating group. There were 12 rats in each group. Immunohistochemical staining and Western blotting were used to detect expression of calcium channel Cav1.3.Tunel was used to show the apoptosis in cerebral cortex. Results Compared with the rats in sham group，the expression of calcium channel Cav1.3 decreased obviously in the ischemia group and butylphthalide treating group. Compared with the rats in the ischemia group，the expression of calcium channel Cav1.3 increased obviously in the butylphthalide treating group. In butylphthalide treating group neural apoptosis were was less than in ischemia group，but more than in sham group. Conclusion The n-butylphthalide can restrain the decline of expression of calcium channel Cav1.3 in ischemia cerebral cortex，and reduce apoptosis of neurons.

N-butylphthalide； Ischemia； Cerebral cortex； L-type calcium channel； Rat

1003-2754(2016)01-0038-04

2015-11-10；

2015-12-29

河北省教育廳資助項目(No.QN20131075)

(1.承德醫學院人體解剖學教研室，河北 承德 067000；2.承德醫學院附屬醫院神經內科，河北 承德 067000)

郭 森，E-mail：guosen2004@126.com

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