免疫毒素CCL25-PE38抗急性T淋巴細胞白血病實驗研究

劉曉蕾，高磊，崔娜

（河北省保定市第一中心醫院1.血液內科，2.彩超室，3.婦科，河北 保定 071000）

免疫毒素CCL25-PE38抗急性T淋巴細胞白血病實驗研究

劉曉蕾1，高磊2，崔娜3

（河北省保定市第一中心醫院1.血液內科，2.彩超室，3.婦科，河北 保定 071000）

目的探討免疫毒素CCL25-PE38對急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）細胞系MOLT4（天然高水平表達CCR 9）的殺傷作用，以期為T-ALL的靶向治療提供基礎。方法通過流式細胞術、共聚焦顯微術檢測CCL25-PE38與MOLT4細胞的結合及內化，Transwell趨化小室檢測其趨化能力，細胞增殖試劑WST-1檢測其細胞殺傷能力，Annexin V-FITC/PI染色檢測其凋亡誘導效應，建立SCID小鼠白血病細胞異種移植腫瘤（CCR 9+腫瘤）模型檢測CCL25-PE38的抑瘤效果。結果WST-1檢測結果顯示CCL25-PE38能特異性殺傷MOLT4細胞；Annexin V-FITC/PI染色顯示CCL25-PE38主要通過凋亡誘導效應引起MOLT4細胞死亡；在SCID小鼠白血病細胞異種移植瘤模型中，注入CCL25-PE38能緩解CCR 9+腫瘤的生長。結論CCL25-PE38通過凋亡誘導作用引起MOLT4細胞死亡，緩解異種移植CCR 9+腫瘤的生長。

CCL25-PE38；急性T淋巴細胞白血病；免疫毒素

白血病在全球發病率呈上升趨勢，我國白血病發病率為十萬分之三，每年約新增40 000例患者。白血病表現為骨髓造血組織惡性增生，形成大量異常的白細胞，廣泛浸潤組織器官，引起多種組織器官不可逆損害，直接威脅患者生命。白血病的轉移、復發與白血病細胞及其生長微環境相互作用密切相關。免疫毒素是一種由抗體或細胞因子與化學毒素耦合組成的融合蛋白。通過受體介導的內吞作用和隨后的毒素成分被轉運到細胞質，并與二磷酸腺苷結合，核糖基化延伸因子2（EF-2），從而導致蛋白質合成被抑制和靶細胞死亡[1]。PE38，38 kD的截短型綠膿桿菌外毒素A的衍生物，已被廣泛作為免疫毒素毒素組分。例如，抗CD22的重組免疫毒素BL22，基于PE38的作用治療毛細胞白血病證明是成功的[2]。重組免疫毒素8H9-PE38用于乳腺癌，骨肉瘤，神經母細胞瘤的治療[3]。因此，重組免疫毒素可能是一種用于治療癌癥患者，尤其是血液腫瘤患者有前途的方法。以趨化因子受體介導的免疫治療是一個極具吸引力的策略。本研究推測，毒素與趨化因子融合構成的新型免疫毒素，可能對高水平表達CCR9的急性T淋巴細胞白血病（T lineageacutelymphoblastic leukemia，T-ALL）細胞的存活產生影響。為了檢驗該假設，本研究設計一個免疫毒素分子CCL25-PE38，構建其真核表達載體，并表達在真核細胞293T中，然后檢測其對T-ALL細胞系MOLT4的殺傷作用以及抗MOLT4細胞異種移植腫瘤效應。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑MOLT4細胞（自然高水平表達CCR9），小鼠成纖維細胞L929，HEK 293T細胞購自美國模式菌科收集中心，RPMI 1640、DMEM、胰酶來源于美國Hyclone公司，青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司，Fetal bovine serum（FBS）購自美國Gibco公司，限制性內切酶來源于美國NewEngland Biolabs公司，pcDNA3.1（+）載體來源于美國Invitrogen公司，Wizard Plus Maxipreps DNA Purification System來源于Promega，EntransterTM-D來源于中國Engreen，重組人-CCL25來源于美國Peprotech公司，鼠抗人CCR9單克隆抗體購自美國R&D公司，BCA蛋白分析試劑盒購自碧云天生物有限公司，過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG，FITC/R-PE標記羊抗兔IgG，R-PE標記驢抗鼠IgG（H+L）來源于美國Protein Tech公司，Annexin V-FITC試劑盒來源于美國BD公司，細胞增殖試劑WST-1來源于美國Roche公司，甘油來源于美國Sigma公司。

1.1.2主要儀器電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司），Eppendorf PCR儀（德國Eppendorf AG公司），Air Tech超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），KHB CT-360自動多功能酶標儀（上海科華實驗系統有限公司），GENE GENIUS凝膠成像分析系統（英國Syngene公司），Eppendorf移液器（德國Eppendorf AG公司），Eppendorf臺式冷凍離心機（德國Eppendorf AG公司），蛋白電泳儀、轉印儀（北京六一），Transwell趨化小室（美國Corning公司），細胞培養箱（美國Forma公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司），流式細胞儀（美國Beckman公司），共聚焦顯微鏡（德國Leica）。

1.2實驗方法

1.2.1重組免疫毒素CCL25-PE38靶向殺傷MOLT4細胞實驗收集1×105MOLT4細胞，PBS洗滌。分別取CCL25-PE38、PE38（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0及2.0 nmol/ml，PBS稀釋），加至細胞懸液中，混合后加至96孔板的各小孔中。以PBS處理作為陰性對照組。37℃、二氧化碳CO2濃度為5%的細胞培養箱中培養48 h后，加入10μl WST-1（美國Roche公司）繼續培養4h。酶標儀測定450nm下的光密度（optical density，OD）值。同時為檢測CCL25-PE38對MOLT4細胞的特異性殺傷作用依賴于CCR9，設立CCL25-PE38加抗CCR9抗體（美國R&D公司）處理組。收集MOLT4細胞，PBS洗滌1次。先用抗CCR9抗體處理1 h，然后加入CCL25-PE38。其他處理同上。為檢測CCL25-PE38對CCR9-細胞增殖能力的影響，收集1×105L929細胞，PBS洗滌1次。取CCL25-PE38（0.5 nmol/ml，PBS稀釋），加至細胞懸液中，混合后加至96孔板的各小孔中。以PBS處理作為陰性對照組。37℃、二氧化碳CO2濃度為5%的細胞培養箱中培養48 h后，加入10μl WST-1繼續培養4h。酶標儀測定450nm下的OD值。重組免疫毒素CCL25-PE38凋亡誘導效應，收集1×105MOLT4細胞，PBS洗滌1次。取CCL25-PE38（0.5nmol/ml，PBS稀釋），加至細胞懸液中，混合物加至24孔板的各小孔中。37℃、二氧化碳CO2濃度為5%的細胞培養箱中培養0、24及48 h。離心收集處理后的細胞，結合緩沖液洗滌1次，加入AnnexinV-FITC/PI（美國BD公司）于暗處孵育15 min。立即上流式細胞儀（美國Beckman公司）進行檢測。

1.2.2重組免疫毒素CCL25-PE38抗腫瘤實驗

MOLT4細胞異種移植腫瘤（CCR9+）模型建立：SCID小鼠由武漢大學動物實驗中心提供，6～8周齡，雌性，許可證編號：SCXK（鄂）2008-2004。小鼠飼養在無菌隔離器中。一周后無菌條件下將MOLT4細胞接種至SCID小鼠背部皮下（1×107/只），接種后約7～9 d可觸及到約300mm3大小的腫瘤塊，將未長出腫瘤的小鼠棄掉不用，余下動物分成3組，每組5只。重組免疫毒素CCL25-PE38處理及抗瘤效果觀察：于第9天開始分別經尾靜脈注射（靜脈注射不成功的采用腹腔注射）CCL25-PE38、PE38（0.5 nmol/只/d）、PBS；連續注射14 d。每隔一天測量瘤體的長和寬，并計算瘤體大小。至實驗第29天，采取頸椎脫臼方式將SCID荷瘤小鼠處死，剝離腫瘤體并稱重。HE染色：用4%中性甲醛固定剝離得到的腫瘤，送本校組織胚胎學教研室進行石蠟包埋、切片、HE染色。在顯微鏡下觀察腫瘤塊組織學特點。流式細胞術檢測CCR9+腫瘤中CCR9的表達情況：無菌條件下碾磨腫瘤塊，使用200目的細胞濾網收集腫瘤細胞，PBS洗滌2次。傳代培養3次后，收集細胞檢測其表面CCR9的表達水平。分離收集各處理組1×105細胞，加10μg/mL的抗CCR9單克隆抗體（美國R&D公司）至細胞懸液中，于4℃孵育1 h，以MOLT4細胞作為對照，加入PBS處理。PBS洗滌2遍后，加入RPE標記的羊抗鼠IgG（美國ProteinTech公司），4℃孵育30min。PBS洗滌2次后上流式細胞儀（美國Beckman公司）進行檢測。

1.3統計學方法

采用Graph Prism 5統計軟件進行數據分析，計量資料用均數比較的t檢驗處理和單因素方差分析，定性資料用獨立樣本R×C列聯表資料的χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1免疫毒素CCL25-PE38靶向殺傷MOLT4細胞能力檢測

為檢測免疫毒素CCL25-PE38對細胞存活的影響，本研究檢測免疫毒素CCL25-PE38對MOLT4細胞的殺傷作用以及對L929細胞增殖的影響。如圖1所示，CCL25-PE38能特異性殺傷MOLT4細胞，隨著免疫毒素CCL25-PE38濃度的增加其殺傷效應也隨著增強，同時其殺傷作用能被抗CCR9的抗體特異性阻斷。CCL25-PE38對CCR9表達陰性細胞的增殖無影響。

圖1　免疫毒素CCL25-PE38細胞毒作用檢測

2.2免疫毒素CCL25-PE38凋亡誘導效應

為探討免疫毒素殺傷MOLT4細胞的機制，本研究檢測免疫毒素誘導MOLT4細胞凋亡的作用。隨著CCL25-PE38作用于MOLT4細胞時間的增加，發生凋亡的MOLT4細胞數（Annexin-V FITC陽性和Annexin-FITC、PI雙陽性細胞）逐漸增加，見圖2。24 h凋亡率為30.7%，48h凋亡率達到41.3%。與對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）。見附表。

圖2　免疫毒素CCL25-PE38誘導MOLT4細胞凋亡效應

附表　兩組免疫毒素CCL25-PE38誘導MOLT4細胞凋亡效應的比較%

2.3免疫毒素CCL25-PE38抗CCR9+腫瘤效應

為進一步驗證免疫毒素特異性殺傷白血病細胞的能力，本研究檢測免疫毒素在體內抗CCR9+腫瘤作用。首先建立MOLT4細胞異種移植CCR9+腫瘤，接種MOLT4細胞9 d后，可檢測到大小為300 mm3瘤體。然后注入CCL25-PE38并觀察其對移植腫瘤生長的影響。如圖3所示，注入CCL25-PE38 12d以后能觀察到瘤體的的生長受到抑制。而PBS及PE38處理組瘤體的體積持續增長。因此，采用靜脈注射重組免疫毒素CCL25-PE38能有效緩解SCID小鼠異種移植腫CCR9+瘤的生長。

圖3　免疫毒素CCL25-PE38抑制異種移植CCR9+腫瘤的生長

2.4HE染色結果

為驗證CCL25-PE38體內抑瘤作用，本研究制作腫瘤組織切片并作HE染色。通過組織學分析，發現CCL25-PE38處理組與對照組比較血管分布密度減少，腫瘤細胞數目明顯減少。見圖4。

圖4　腫瘤組織HE染色結果

2.5CCR9+腫瘤中CCR9的表達水平

圖5　不同處理組來源的腫瘤細胞表面CCR9表達水平

在本實驗中，盡管免疫毒素CCL25-PE38能有效緩解異種移植CCR9+腫瘤生長，但是不能完全消除腫瘤。為探究產生此現象的原因，采用FCM檢測了來源于各組瘤體中細胞表面CCR9的表達水平，結果發現在CCL25-PE38處理組，CCR9的表達水平明顯降低（66.9%），而PBS和PE38處理組腫瘤細胞表面CCR9水平未有明顯改變，見圖5。因而可推測CCR9表達水平的下降可能與MOLT4細胞移植到小鼠體內后部分細胞不再表達CCR9有關。

3 討論

趨化因子和趨化因子受體在疾病發生、發展的過程中發揮重要作用[4]。最近有研究報道，CCX282-B，一個潛在的人CCR9拮抗劑，對腸道炎癥具有較好的治療效果[5]。此外，文獻[6]報道，下調CXCR4的表達抑制癌細胞侵襲和轉移。針對趨化因子和/或趨化因子受體可能對控制相關疾病的發展進程具有治療效果。CCR4單克隆抗體已被證明可以誘導T-ALL患者白血病細胞的死亡，抑制表達CCR4腫瘤的進展[7-9]。該作用導致細胞的死亡有賴于抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用，但是該治療方式與患者的免疫功能狀態有關。而針對趨化因子或趨化因子受體與細胞毒性藥物的免疫毒素，直接殺傷靶細胞可能提供更好的治療效果。

PE38具有很強的誘導細胞死亡作用已被廣泛用作免疫毒素的毒素成份[10-12]。在本研究中，WST-1檢測結果顯示，CCL25-PE38特異性殺死MOLT4細胞，但不殺傷L929細胞。重要的是靶向殺傷作用可被CCR9中和性抗體有效地阻斷，再次確認CCL25-PE38對MOLT4細胞的殺傷作用是由CCR9介導的。隨后Annexin V-FITC/PI染色的結果表明，CCL25-PE38呈時間依賴性誘導MOLT4細胞的凋亡。另一項研究報道與本研究一致的結果，VGEFPE38融合毒素進入胞漿后可誘導靶細胞凋亡[13-15]。此外，本研究通過向SCID小鼠注射MOLT4細胞建立白血病細胞荷瘤（CCR9+腫瘤）模型，探討CCL25-PE38對異種移植CCR9+腫瘤生長的影響。在SCID小鼠白血病細胞移植瘤模型中，注入CCL25-PE38能有效緩解CCR9+腫瘤的生長。經FCM檢測發現瘤體（CCL25-PE38處理組）中分離的腫瘤細胞CCR9的表達水平下降，提示有可能一部分細胞在體內喪失表面CCR9分子，對CCL25-PE38產生耐受。因此，提高免疫毒素CCL25-PE38的抗腫瘤效果是本研究下一步的工作目標，可能通過以下途徑：①生物信息學方法，優化CCL25-PE38結構，以增加CCL25-PE38活性；②提高CCL25-PE38的穩定性，以促進其吸收；③使用與其他治療方法如化療相結合的策略。另外，為進一步研究免疫毒素CCL25-PE38體內抗白血病作用，進行以下實驗：建立小鼠白血病模型，觀察CCL25-PE38治療白血病效果；觀察CCL25 -PE38的免疫原性、毒性、體內代謝等情況。

綜上所述，本研究結果表明，免疫毒素CCL25-PE38能特異性殺傷高水平表達CCR9的MOLT4細胞，而不影響CCR9受體陰性細胞。此外，體內研究表明，CCL25-PE38能緩解CCR9+腫瘤的生長。所以，CCL25-PE38在此呈現的生物活性使其有可能成為潛在治療高水平表達CCR9癌癥潛在的生物制劑，特別是T-ALL。

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（張蕾編輯）

Study of CCL25-PE38 immunotoxin in treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）

Xiao-lei Liu1，Lei Gao2，Na Cui3
（1.Department of Hematology，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China；2.Ultrasound Department，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China；3.Gynecology，Baoding First Central Hospital，Baoding，Hebei 071000，China）

Objective To investigate the killing effect ofCCL25-PE38immunotoxin on MOLT4 cell line in T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）（CCR9natural high-level expression），and to provide the foundation of targeting treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）.Methods Flow cytometryn and confocal microscopy were used to detect the binding and internalization of CCL25-PE38 and MOLT4 cells.Transwell chemotaxis chamber method was used to detect the chemotaxis.Cell Proliferation Reagent WST and Annexin VFITC/PI stain were used to detect killing ability of cells and the apoptosis induced effect respectively.And antitumous effect ofCCI25-PE38was detected by building the SCID leukemia cells in mice xenograft tumor（CCR9+tumors）model.Results WST-1 test showed thatCCL25-PE38produce specific lethal effect on MOLT4 cell. Annexin V-FITC/PI stain showed that the cause of death of MOLT4 cells was induced by apoptosis ofCCL25-PE38. Injection ofCCL25-PE38in SCID leukemia cells in mice xenograft tumor（CCR9+tumors）model can retard growth speed of CCR9+cancer.Conclusions The cause of death of MOLT4 is induced by apoptosis-inducing effect of CCL25-PE38，which can retard the growth of CCR9+xenotransplanted tumors.

CCL25-PE38；T-cell acute lymphoblastic leukemia（T-ALL）；immunotoxin

R 733.71

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.002

1005-8982（2016）20-0006-06

2016-02-18