大鼠脊髓缺血再灌注后早期脊髓內(nèi)促炎因子及抗炎因子的表達

陜西省寶雞市人民醫(yī)院骨二科(寶雞 721000)

蘇 權(quán) 黨曉謙△▲ 王坤正△ 時志斌△

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大鼠脊髓缺血再灌注后早期脊髓內(nèi)促炎因子及抗炎因子的表達

陜西省寶雞市人民醫(yī)院骨二科(寶雞 721000)

蘇 權(quán)黨曉謙△▲王坤正△時志斌△

目的： 研究脊髓缺血再灌注后早期不同時相點脊髓組織內(nèi)促炎因子TNF-α、IL-6及抗炎因子IL-4、IL-10的表達,探討TNF-α、IL-6、 IL-4及IL-10在脊髓缺血再灌注后早期的變化規(guī)律及其意義。方法：健康成年SD大鼠120只,隨機分為假手術(shù)組、缺血30 min組、缺血45 min組及缺血60 min組,每組30只。各組再分為處理后2 h、4 h、8 h、16 h、24 h共5個時相組,每個時相組6只。參照Zivin法制作脊髓缺血再灌注損傷動物模型。每組在2 h、4 h、8 h、16 h、24 h各時相點分別評估大鼠后肢運動功能后立即處死動物,取L2～L5節(jié)段脊髓，重80～100 mg,剝離脊髓組織外膜,-80℃凍存?zhèn)溆?采用雙抗體夾心ELISA法檢測脊髓勻漿中TNF-α、IL-6、IL-4及IL-10含量。結(jié)果：各時相點假手術(shù)組大鼠后肢運動功能評分明顯高于各缺血組,缺血60 min組的評分最低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。促炎因子TNF-α、IL-6在2 h時相組即有明顯升高,8 h達到高峰,24 h仍維持在較高水平；抗炎因子IL-4、IL-10亦具有近似的變化規(guī)律。結(jié)論：促炎因子TNF-α、IL-6及抗炎因子IL-4、IL-10的共同釋放參與脊髓缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程,促炎因子與抗炎因子的同步變化規(guī)律提示其之間存在一個動態(tài)的相互平衡關(guān)系。

脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia reperfusion injury, SCII)是脊柱手術(shù)及胸腹主動脈手術(shù)的災(zāi)難性并發(fā)癥,其發(fā)生機制目前仍未明了，學(xué)者們提出了許多學(xué)說如：炎癥反應(yīng)、氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用、Ca2+超載、興奮性氨基酸的毒性作用、細胞凋亡及相關(guān)基因表達、血-腦脊髓屏障通透性改變等。其中炎癥反應(yīng)參與脊髓缺血再灌注后的繼發(fā)損傷機制受到了廣泛的關(guān)注。本實驗采用大鼠脊髓缺血再灌注模型，動態(tài)觀察大鼠脊髓組織內(nèi)炎性因子TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10的在脊髓組織內(nèi)的表達，探討促炎因子及抗炎因子的變化規(guī)律及其在脊髓缺血再灌注損傷中的作用。

材料與方法

1 動物分組及模型建立 120只健康成年SD大鼠(由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供),雄雌不限，體重200～250 g,隨機分為假手術(shù)組(A組)、缺血30 min(B組)、缺血45 min(C組)及缺血60 min(D組),每組均為30只。各組再分為造模后2、4、8、16、24 h共5個時相組(亞組),每個時相6只。用10 %的水合氯醛(0.4 ml/100g)腹腔注射麻醉，麻醉后腹部、背部剪毛,將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上,加熱墊維持直腸體溫在37～38 ℃。對B、C及D組大鼠參照Zivin法[1]建立SCII動物模型,常規(guī)消毒,采用腹部正中切口,仔細分離暴露腹主動脈至腎動脈水平,于左腎動脈起點下方約0.5 cm處用無創(chuàng)動脈夾夾閉腹主動脈,并證實遠端動脈搏動消失,以上各組分別夾閉30 min、45 min及60 min后開放,制作脊髓缺血再灌注損傷模型,假手術(shù)組除不夾閉腹主動脈外所有操作相同。每組在2、4、8、16、24 h各時相點分別采用改良Tarlov評分評估大鼠后肢運動功能后立即處死動物,取L2～L5節(jié)段脊髓,重80～100 mg,剝離脊髓組織外膜,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 檢測指標及方法 ①后肢運動功能觀察：評分采用改良Tarlov評分[2]標準: 下肢無運動,不能負重為0分；下肢有可觀察到的運動,但不能負重為1分；后肢活動頻繁或有力,不能負重為2分；下肢可承受體重,能走1～2步為3分；可行走，僅有輕度障礙為4；行走正常為5分。②脊髓組織內(nèi)促炎因子及抗炎因子檢測：將凍存的脊髓組織解凍、勻漿，分別采用大鼠TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國R﹠D公司分裝)，按說明書步驟進行操作。

結(jié) 果

1 改良Tarlov評分比較 見表1。在各個時間觀察點，假手術(shù)組中的大部分動物后肢功能正常，各缺血組的動物后肢運動功能不同程度減退。后肢運動功能障礙嚴重程度：缺血60 min組>缺血45 min組>缺血30 min組>假手術(shù)組(P<0.05)。

表1 各時相點動物后肢運動功能評分

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30min組比較，#P<0.05；與缺血45min組比較，△P<0.05

2 TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10含量比較 見表2～5。促炎因子TNF-α、IL-6在2 h時相組即有明顯升高,8 h達到高峰,24 h仍維持在較高水平；抗炎因子IL-4、IL-10亦具有近似的變化規(guī)律。

表2 4組動物不同時間點脊髓組織內(nèi)TNF-α含量比較(ng/g, n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30 min組比較，#P<0.05；與缺血45min組比較，△P<0.05

表3 4組動物不同時間點脊髓組織內(nèi)IL-6含量比較(ng/g,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30 min組比較，#P<0.05；與缺血45 min組比較，△P<0.05

表4 4組動物不同時間點脊髓組織內(nèi)IL-4含量比較(ng/g,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30 min組比較，#P<0.05；與缺血45 min組比較，△P<0.05

表5 4組動物不同時間點脊髓組織內(nèi)IL-10含量比較(ng/g,n=6)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血30 min組比較，#P<0.05；與缺血45 min組比較，△P<0.05

討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)元對缺血缺氧因素極其敏感，缺血30 min脊髓組織就會出現(xiàn)明顯的病理變化，即使短時間內(nèi)血流恢復(fù),其病理變化在原缺血損傷的基礎(chǔ)進一步加重，甚至出現(xiàn)遲發(fā)性癱瘓。

實驗結(jié)果顯示,在缺血再灌注2 h TNF-α、IL- 6即有明顯的表達,并隨灌注時間逐漸上升,8 h時達到高峰,隨后逐漸下降。脊髓缺血再灌注后早期TNF-α的大量表達并作為一種重要的炎癥介質(zhì)參與脊髓炎癥反應(yīng)的發(fā)生,同時TNF-α可上調(diào)其它細胞因子IL-1、IL-6等的產(chǎn)生,TNF-α可能是眾多細胞因子的重要啟動因子[3]。NF-κB可被缺血、缺氧等因素激活,并可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)TNF-α、IL-1、IL-6的表達,TNF-α、IL-1及IL-6等細胞因子活化后可增強NF-κB的表達形成一個正反饋機制,產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng),形成惡性循環(huán)。此外,NF-κB的激活可導(dǎo)致大量細胞粘附分子的釋放,NF-κB的信號通路與細胞凋亡密切相關(guān),而這些均參與脊髓缺血再灌注損傷發(fā)生機制。創(chuàng)傷、缺血及感染等因素可激活CNS中的巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元等細胞并由這些細胞分泌TNF-α、IL-6及其它炎性因子[4]。TNF-α及IL- 6作為炎癥反應(yīng)的信號分子，其水平往往反應(yīng)炎癥反應(yīng)的程度，而炎癥反應(yīng)與組織損傷密切相關(guān)。于是我們認為缺血再灌注后8 h內(nèi)是脊髓里炎癥反應(yīng)逐漸加劇的階段,在這個時間段內(nèi)神經(jīng)組織遭受的損害比較嚴重。缺血時間延長,各時相點的促炎因子及抗炎因子表達量越高,即炎癥反應(yīng)程度約嚴重,缺血缺氧是脊髓缺血再灌注后脊髓炎癥反應(yīng)程度的決定性因素,TNF-α和IL- 6可敏感反應(yīng)脊髓組織損傷的嚴重程度。

IL-10是一個典型的抗炎因子,主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生，同時也是一種有效的單核細胞/巨噬細胞減活化劑，減少單核細胞/巨噬細胞對促炎細胞的合成[5]。在炎癥過程中，IL-10抑制促炎因子IL-6、TNF-α以及COX-2的作用產(chǎn)物前列腺素的分泌。另外,還可通過激活巨噬細胞并減少星形膠質(zhì)細胞的激活,抑制細胞免疫和抑制TNF-α、IL-6等促炎因子的合成和釋放,下調(diào)組織損傷引起的繼發(fā)炎癥反應(yīng)和細胞因子表達,在脊髓缺血再灌注后早期發(fā)揮關(guān)鍵的作用[6]。IL-4是一種屬于白介素家族的免疫介質(zhì)，是參與體液免疫最重要的因子之一，主要調(diào)節(jié)Th淋巴細胞向Th2方向分化及提高細胞活性。在其它領(lǐng)域的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-4與IL-10同樣具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用,并且IL-4及IL-10具有協(xié)同作用,在血液誘導(dǎo)的軟骨損傷實驗中聯(lián)合應(yīng)用IL-4及IL-10比單獨應(yīng)用IL-10更好的抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表達[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)脊髓缺血再灌注后IL-4的表達變化與IL-10相似，這表明IL-4是脊髓缺血再灌注后脊髓內(nèi)的炎癥反應(yīng)中同樣是一個重要的炎性因子并在脊髓損傷的病理生理過程發(fā)揮重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn),脊髓缺血再灌注后引起促炎因子TNF-α、IL-6在再灌注2h即有明顯的升高，抗炎因子IL-10在再灌注2h同樣有明顯的升高，IL-4在再灌注4h開始有明顯的升高，且促炎因子及抗炎因子具有相似的變化規(guī)律。促炎因子升高，隨后誘發(fā)抗炎因子迅速的上升，抗炎因子抑制促炎因子,使其下降，隨后抗炎因子也隨之下降。Van Meegeren等[8]認為，在脊髓損傷里存在一個促炎因子/因素與抗炎因子/因素之間的相互平衡的網(wǎng)絡(luò)。本研究發(fā)現(xiàn),在脊髓缺血組動物的脊髓組織里,促炎因子TNF-α和IL-6與抗炎因子IL-4和IL-10呈正相關(guān)，且脊髓缺血時間越長,炎性因子的表達量越高,于是我們認為,TNF-α、IL-6、IL-4及IL-10均參與脊髓缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，且與脊髓組織的損傷程度密切相關(guān)。促炎因子與抗炎因子之間存在一個直接或間接的相互平衡關(guān)系，脊髓缺血再灌注后損傷后的炎癥反應(yīng)是一個“自身調(diào)節(jié)”和“自我修復(fù)”的過程。

脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)是一把“雙刃劍”，它同時具有細胞毒性和細胞保護的雙重作用。適當?shù)难装Y反應(yīng)可以清除損傷因子、組織碎片并可分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子,甚至對于脊髓組織的修復(fù)是必需的,但過度的炎癥反應(yīng)可引起重要組織結(jié)構(gòu)與功能的損害,對于不可再生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)來說是毀滅性的[9]。因此,如何利用這把“雙刃劍”使其既要充分發(fā)揮其細胞保護作用的一面同時給予適當?shù)母深A(yù)使其盡可能避免細胞毒性作用是我們繼續(xù)努力探索的方向。本研究明確了SCII后早期脊髓組織內(nèi)炎性因子自身變化情況,但沒有觀察到炎性因子表達水平恢復(fù)至正常水平,這與實驗設(shè)計的觀察時間過短有關(guān)。另外,通過抑制炎性因子的表達來防治脊髓缺血再灌注損傷尚待進一步研究。

[1] 王中權(quán),王 府,冉龍寬,等.右美托咪定對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的影響及其機制[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2015,37(5)：433-438.

[2] 吳 卓,趙 敏,王永紅,等.大鼠脊髓損傷后不同行為學(xué)評分方法的比較研究[J].中國矯形外科雜志,2014,22(13)：1221-1225.

[3] 高宗強,郭 雄,陳君長,等.大骨節(jié)病、骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞分泌IL-1β、TNF-α及透明質(zhì)酸對其影響實驗研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2015,44(7):774-778.

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[7] Ozkul A, Ayhan M, Akyol A,etal. The effect of insulin resistance on inflammatory response and oxidative stress in acute cerebral ischemia[J].Neuro Endocrinol Lett, 2013, 34(4): 52-57.[8] Van Meegeren MER, Roosendaal G, Jansen NWD,etal. IL-4 alone and in combination with IL-10 protects against blood-induced cartilage damage[J]. Osteoarthritis and Cartilage, 2012, 20(7): 764-772.

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(收稿：2016-03-18)

△西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科

▲通訊作者

脊髓 再灌注損傷 腫瘤壞死因子-α 白細胞介素類 大鼠

R651.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.005