ANXA3 mRNA和Livin mRNA在膽囊癌和膽囊息肉中的表達及意義

陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院(咸陽712000)

郝 瑞 張 熊 鄧 睿

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ANXA3 mRNA和Livin mRNA在膽囊癌和膽囊息肉中的表達及意義

陜西省咸陽市第一人民醫(yī)院(咸陽712000)

郝 瑞 張 熊 鄧 睿

目的：探討膜聯(lián)蛋白A3(ANXA3)mRNA和Livin mRNA 在膽囊癌和膽囊息肉組織中的表達及意義。方法：收集35例膽囊癌患者(膽囊癌組)和34例膽囊息肉患者(息肉組)的臨床資料,采用RT-PCR技術檢測組織ANXA3和Livin的表達,觀察兩標志物的變化與膽囊癌和膽囊息肉疾病之間的關系。結果：膽囊癌組ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達與息肉組比較顯著增高(P<0.01)。膽囊癌組ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達呈正相關(r=0.617,P<0.01)。膽囊癌組中ANXA3 mRNA和Livin mRNA的表達量分別和血清CEA、CA19-9及CA50具有相關性[(r=0.627, 0.593，0.607，P<0.01),(r=0.643, 0.610,0.623,P<0.01)]。結論：檢測組織ANXA3和Livin的表達有助于膽囊癌和膽囊息肉疾病的早期鑒別診斷,

膽囊癌是膽道最常見的惡性病變。膽囊息肉樣變是臨床上較常見的一種良性病變,可分為非腫瘤性息肉和腫瘤性息肉,后者中腺瘤性息肉惡變率為1.5%,一直被認為是膽囊癌的癌前病變,應及時手術切除膽囊，所以對膽囊癌和膽囊息肉的鑒別診斷顯得尤為重要[1]。目前B超對于<5mm的息肉診斷率可達90%以上,但難以定性息肉的性質(zhì)[2]。膜聯(lián)蛋白A3(ANXA3)屬于膜聯(lián)蛋白超家族且是非常重要的一員,近年來有研究顯示,ANXA3可能與多種惡性腫瘤的演進有密切相關性[3]。Livin基因是凋亡抑制蛋白家族中的重要成員，其可以抑制凋亡信號轉導過程而阻斷凋亡的發(fā)生,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系[4]。本文應用實時逆轉錄-聚合酶聯(lián)反應技術(RT-PCR)研究膽囊癌和膽囊息肉樣變組織中ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達狀況,探討其與膽囊癌和膽囊息肉樣變之間的關系。

對象與方法

1 研究對象 膽囊癌組為2011年3月至2015年3月在本院住院的膽囊癌患者35例,其中男9例,女26例,年齡35～70(平均55±10.7)歲；術前診斷為膽囊結石膽囊炎20例,膽囊息肉14例；膽囊結石患者病史7～26(平均11±3.5)年,主要的癥狀為右上腹痛,且向肩背部放射；膽囊息肉患者病史均在6年以上,其中25例于術前行MRCP檢查,10例行超聲檢查。35例膽囊癌病理分級：高分化5例、中分化9例、低分化21例。淋巴結轉移陰性17例,陽性18例。息肉組為同期本院行膽囊切除的患者,根據(jù)術后病理結果選取腺瘤性息肉患者34例,男12例,女22例,年齡35～67(平均56±11.2)歲；排除標準：合并糖尿病、甲狀腺功能亢進等代謝性疾病者；合并肝硬化及膽道梗阻者；近1個月內(nèi)服用膽酸、非甾體抗炎藥、激素類等影響代謝功能藥物者；B超檢查、術中及術后病理提示息肉與結石并存者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準,所有研究對象已簽署知情同意書。

2 方 法 ①細胞分離和總RNA的提取：RNA提取采用美國Invitrogen公司產(chǎn)品。采用trizol法提取組織中的總RNA，在分光光度計上檢測A260/280的比值以驗證RNA的純度。②PCR擴增：用pfimer5軟件設計引物,ANXA3 的引物序列為：正義鏈5’-CAGGCACCCGTGTGGTTGCT-3’,反義鏈 5’-AGGCTGGTGGGGCATCGAAC-3’；擴增產(chǎn)物長度205 bp；Livin引物序列為：正義鏈 5‘-ATGGGACCTAAAGACAGTGCC-3’,反義鏈5‘-GCGGCCAGTCATAGAAGGAG-3’；擴增產(chǎn)物長度190 bp;β-actin作為內(nèi)參照,引物序列為：正義鏈5’- ACCATGGATGATGATATCGCC-3’, 反義鏈5’-GCCTTGCACATGCCGG-3’, 擴增產(chǎn)物長度110bp。反應條件：94℃,30s→94℃,30 s→55℃,90 s→72℃,60 s，35個循環(huán)→72℃,10 min→4℃保存。③基因片段序列測定和分析：使用測序儀對PCR產(chǎn)物進行序列測定,將測序結果通過BLAST應用軟件與GenBank中的已知序列進行同源性比較。④對擴增的目的片斷進行凝膠電泳,通過紫外光凝膠成像系統(tǒng)進行掃描并記錄,測定各組的cDNA的特異性,ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達量用Ct值變化表示。△Ct(HVCT)均值-(Xn)Ct,(HVCT)是內(nèi)參照Ct的平均值,Xn表示每個受試對象的Ct值。miRNA的相對表達量為2-△ct。⑤采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測兩組患者血清CEA、CA19-9及CA50含量。

3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析,正態(tài)檢驗,率比較采用卡方檢驗及Fishers精確概率法檢驗,相對表達量比較采用t檢驗。相關性分析采用Pearson 法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 兩組患者ANXA3 mRNA和Livin mRNA 表達率和表達量比較 見表1,2。膽囊癌組兩標志物表達率與息肉組比較明顯增高(P<0.01)。膽囊癌組兩標志物表達量與息肉組比較明顯增高(P<0.01)。

2 兩組血清腫瘤標志物檢測結果比較 見表3。膽囊癌組中的CEA、CA19-9及CA50分別與息肉組比較均增高(P<0.01)。

表1 兩組患者ANXA3 mRNA和Livin mRNA 表達率比較 (%)

注：與息肉組比較，*P<0.01

表2 兩組患者ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達量比較±s)

注：與息肉組比較，*P<0.01

表3 兩組血清腫瘤標志物檢測結果±s)

注：與息肉組比較，*P<0.01

3 相關分析 ANXA3 mRNA和Livin mRNA在膽囊癌的表達量具有相關性(r=0.617,P<0.01)。膽囊癌組ANXA3 mRNA和Livin mRNA表達量與血清CEA、CA19-9及CA50水平有明顯相關性[(r=0.627, 0.593,0.607，P<0.01),(r=0.643, 0.610,0.623,P<0.01)] 。

4 利用ROC曲線來評價兩項標志物的價值 組織ANXA3和Livin表達量的AUC分別為(0.873,0.829,P<0.01),聯(lián)合檢測ANXA3和Livin 的AUC為0.953(P<0.01),即組織ANXA3和Livin 在鑒別膽囊癌和膽囊息肉疾病中有診斷意義。

討 論

膜聯(lián)蛋白A在哺乳動物細胞內(nèi)表達量較高,ANXA3是ANX超家族中的一員,研究證實,ANXA3的異常表達與膽囊癌,乳腺癌[5]，肺癌[6]等惡性腫瘤有關。有研究通過miRNA干擾ANXA3 在膽囊癌細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)癌細胞的增殖能力下降、G1期細胞阻滯，提示阻滯ANXA3的表達可以改善膽囊癌細胞的惡性生物學行為[7]。本研究采用RT-PCR技術通過對膽囊癌和膽囊息肉組織ANXA3的分析發(fā)現(xiàn)膽囊癌組ANXA3表達高于息肉組(P<0.01)，上述研究表明，ANXA3高表達可能與膽囊癌關系密切,并有望成為膽囊癌診斷治療的一個新靶點。

Livin 是凋亡抑制蛋白家族的重要成員。Livin在正常成人的組織中低表達或不表達,在多種腫瘤中過度表達[8]。研究發(fā)現(xiàn)Livin在卵巢癌[9]、肝癌[10]、胰腺癌[11]等腫瘤中過度表達。采用免疫組織化學方法檢測Livin在膽囊組織中的表達顯示膽囊腺癌組織中Livin顯著高于膽囊良性病變組織[12]。本研究顯示Livin在膽囊癌組織中的表達明顯高于息肉組織(P<0.01)。因此認為,檢測Livin可能為以Livin 基因為靶點的膽囊癌基因診斷和治療提供了重要的實驗依據(jù),Livin可能作為臨床上鑒別膽囊癌和膽囊息肉的分子標志物。

ANXA3 mRNA和Livin mRNA在膽囊癌組織中的表達量具有正相關性(P<0.01)，兩標志物也與血清CEA、CA19-9及CA50有相關性,提示兩標志物與膽囊癌的發(fā)生，發(fā)展密切相關。ROC曲線分析結果也顯示ANXA3和Livin在鑒別膽囊癌和膽囊息肉疾病中有診斷意義,提示檢測兩標志物有助于膽囊癌和膽囊息肉疾病的早期鑒別診斷,減少漏檢率,深入研究兩標志物在膽囊癌和膽囊息肉疾病中的關系、作用及其機制,將為膽囊癌的基因診斷、預防及治療提供新思路。

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(收稿：2016-03-25)

The clinical application of detection of ANXA3mRNA and Livin mRNA in tissues in the diseases with the gallbladder carcinoma and the gallbladder polyps

The First People’s Hospital of Xianyang City(Xianyang 712000)

Hao Rui Zhang Xiong Deng Rui

Objective：To explore the clinical application of detection of ANXA3mRNA and LivinmRNA in tissues in the diseases with the gallbladder carcinoma and the gallbladder polyps.Methods：The serum and clinical data in 35 cases of patients with gallbladder carcinoma (carcinoma group) and 34 cases of patients with gallbladder polyps(polyps group)were collected, used the real-time fluorescent quantitative PCR (Real - time - PCR, rt-pcr) technology to detect the expression of tissue ANXA3 and Livin to observe the changes and the relationship with gallbladder diseases for of the two markers.Results：In the carcinoma group the expression of tissue ANXA3 and Livin respectively with comparision to those in the controls were significantly higher, the differences had statistical significance (P<0.01),and the expression of ANXA3mRNA and LivinmRNA were positively correlated in the carcinoma group(r=0.617,P<0.01),which respectively were relevant with the levels of serum CEA and CA19-9 and CA50 (r=0.627,0.593,0.607,P<0.01), (r=0.643, 0.610, 0.623,P< 0.01).Conclution：Testing the expression of ANXA3 and Livin in tissues can help the gallbladder carcinoma and the gallbladder polyps disease in the early differential diagnosis。

Gallbladder neoplasms Adenomatous polyps Gene expression regulation @ANXA3 @Livin

膽囊腫瘤 腺瘤性息肉 基因表達調(diào)控 @膜聯(lián)蛋白A3 @Livin基因

R735.8

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.059