再生纖維素微球對菠蘿蛋白酶吸附工藝研究

寧玉娟　周培林　張海明　蘇　宸　黃科林　藍　平

（1.廣西民族大學化學化工學院，廣西 南寧 530006；2.中國科技開發院廣西分院，廣西 南寧 530006）

再生纖維素微球對菠蘿蛋白酶吸附工藝研究

寧玉娟1周培林1張海明1蘇宸1黃科林2藍平1

（1.廣西民族大學化學化工學院，廣西 南寧 530006；2.中國科技開發院廣西分院，廣西 南寧 530006）

文章采用反相懸浮聚合法制備甘蔗渣再生纖維素微球，以菠蘿蛋白酶為吸附模型，考察單因素對菠蘿蛋白酶吸附量的影響，并測定菠蘿蛋白酶酶活及吸附率。結果表明：溫度313.2 K、pH為9、t為40 min、C0為1000 mg·L-1和振蕩速率為200 r·min-1時最佳，最后微球對菠蘿蛋白酶的最大吸附量為136.2 mg·g-1，酶活為0.1～0.25 F.I.P-U·g-1，吸附率為22.56～80.40 %。

再生；纖維素微球；菠蘿蛋白酶；吸附；工藝

1　概述

吸附效果一般用模型蛋白吸附量來衡量，吸附劑性能好差通常與其物理化學性質、種類、孔隙率等有關，還與吸附外界環境條件緊密相關，比如說環境溫度、體系pH、吸附質濃度等。

隨著菠蘿蛋白酶在食品［1-3］、日化［4］、醫藥［5，6］等行業中發揮著越來越重要的作用，國內外的很多專家對它的提取方法進行了大量的研究，目前運用到工業化生產的有單寧沉淀法、高嶺土吸附法和超濾濃縮法［7，8］。目前，離子交換層析法和電泳法可用于菠蘿蛋白酶分離純化，并且已經得到了單組分［9-11］，但是，由于純化的材料價格昂貴，所需的成本高，未能進行大規模化生產。目前工業上對菠蘿蛋白酶的提取有大量文獻，而甘蔗渣再生纖維素微球對菠蘿蛋白酶的吸附未見相關報道，本章擬設計單因素實驗優化微球對菠蘿蛋白酶的吸附工藝，為纖維素基吸附材料的開發與應用提供理論前提和實踐依據。

2　實驗試劑與儀器設備

2.1實驗試劑

表1　藥品與儀器列表

2.2儀器和設備

表2　儀器設備列表

2.3實驗內容

2.3.1微球的制備

參照鐘明良［12］方法制得甘蔗渣再生纖維素微球。

2.3.2不同pH緩沖溶液的配制

按Henderson-Hasselbalch方程配制pH值，用分析天平準確稱取6.1 g Tris（C4H11NO3）精確到0.0001 g，在室溫條件下，使之溶于500 mL的超純水中，用pH計驗證，若有偏差用事先配制好的1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH溶液將其調至所需pH值。

2.3.3標準溶液液配制

用分析天平精確稱量0.14g菠蘿蛋白酶溶于一定量超純水中，制成100.00mL標準母液，然后取不同體積的母液稀釋成濃度為200、400、600、800、1000、1200、1400 mg·L-1的菠蘿蛋白酶溶液，定容后搖勻于275 nm下測不同濃度的吸光度值，以酶溶液對吸光度值作圖，得標準曲線。

2.3.4測定酶活

主要有C.D.U.法、G.D.U.法、F.I.P.法和快速測試法［13］，本實驗采用F.I.P法測定酶活。

2.3.4.1各試劑的配制

所需各試劑參照實驗方法配制［14］。

2.3.4.2測定酶活操作步驟

準備兩支15 mL潔凈試管①和②，移液管精確量取2.5 mL底物溶液分別放入①和②置于超級恒溫槽，調至35 ℃；然后量2.5 mL的酶制備溶液，移置另外兩支編號③和④試管中，把③和④試管放入35 ℃±0.20C的恒溫槽預熱兩分鐘；③號管加入底物溶液并搖勻，計時恒溫10 min，隨后移入5.0 mL的蛋白質凝固劑，終止反應；④試管加入5.0 mL蛋白質凝固劑之后，再迅速加入經預熱酶制備溶液，恒溫30 min，過濾，④號管作空白對照，在紫外波長275 nm下測其吸光度值。

2.3.4.3酶活的計算

計算酶活可參照施特爾馬赫酶［13］所著酶活測定一書：

式中：

EF.I.P.——一個F.I.P.菠蘿蛋白酶單位酶活（F.I.P.-U/g或F.I.P.-U/mL）；

A275——酶試樣在275 nm處的吸光度；

W——酶試樣量（g或mL）；

0.126——0.1μmol/ml酪氨酸溶液在275nm處的吸光度；

10——反應時間（min）

2.3.5靜態吸附

本課題以甘蔗渣再生纖維素微球為吸附劑，以菠蘿蛋白酶溶液為模型，靜態吸附測其吸附量。精確稱重一定質量微球于100 mL錐形瓶，移取25 mL濃度為1000 mg·L-1待測液，用封口膜封住瓶口預防待測液飛濺，升至至預定溫度振蕩一定時間，離心后取清液，275 nm下測，并重復以上步驟三次計算平均吸光度值。

注：qt為t時刻吸附量，mg·g-1；qe為飽和吸附量，mg·g-1；C0為初始濃度，mg·L-1；Ct為t時刻待測液的濃度，mg·L-1；M為微球質量，g；V為菠蘿蛋白酶溶液的體積，mL。

2.3.6吸附率測定

吸附率等于吸附后待測液濃度與原液濃度的百分比。

式中：C0為初始濃度，mg·L-1；Ct為t時刻溶液濃度。

2.4結果與討論

2.4.1標準曲線測定

按2.3.3步驟繪制其標曲，如下：

圖1　菠蘿蛋白酶標準曲線

從圖1知，標準曲線方程如下。

其相關系數R2=0.9992，說明其線性關系良好，即可用于推算吸附前后菠蘿蛋白酶的濃度差，計算出它的吸附量。

2.4.2單位酶活

參照步驟2.3.4和式（1）計算，其酶活為0.1～0.25 F.I.P-U·g-1之間。

2.4.3吸附率計算

由式（4）計算知：微球對菠蘿蛋白酶吸附率為22.56～80.40 %之間。

2.4.4單因素實驗

以甘蔗渣再生纖維素微球為吸附劑，以菠蘿蛋白酶為模型蛋白，采用靜態吸附進行吸附實驗，考察菠蘿酶溶液初始濃度C0、時間t、溫度T、振蕩速率V、溶液pH等工藝條件的影響。

2.4.4.1初始濃度的影響

擬設計C0為400、600、800、1000、1200、1400 mg·L-1條件下測其對菠蘿蛋白酶的吸附效果的關系，結果如下：

圖2　初始濃度與吸附效果關系

從圖2可知，吸附量隨著C0加大呈現快速上升趨勢，而當C0過大時甘蔗渣再生纖維素微球吸附量迅速飽和后，不能繼續吸附菠蘿蛋白酶，而持續振蕩會導致部分吸附上的菠蘿蛋白酶被脫附下來，表現出來的及時其吸附量又呈現下降趨勢，當溶液濃度為1000 mg·L-1時，其吸附達到最大值89.0 mg·g-1，故選取C0為1000 mg·L-1最佳。

2.4.4.2溫度的影響

擬設計T為293.2、298.2、303.2、310.2、313.2、318.2 K條件下測T對菠蘿蛋白酶的吸附效果關系，結果如下：

圖3　溫度與吸附效果關系

從圖3可知，對比C0與吸附效果關系來說，溫度對其影響較小，隨著T升高吸附量增大，對模型蛋白吸附量先增大后略微下降，在振蕩溫度為313.2 K時，吸附量達到最大值92.9 mg·g-1。當溫度高于318.2 K時，菠蘿蛋白酶變性導致其自身結構發生變化，減少其接觸機會故吸附量下降。

2.4.4.3吸附時間的影響

擬設計振蕩時間為10、20、40、60、80、100、120 min條件下測其對菠蘿蛋白酶吸附效果的關系，結果如下：

圖4　時間與吸附效果關系

從圖4可知，在t為10～40 min內，菠蘿蛋白酶的吸附量隨時間的增加而快速上升，而在40 min后直至120 min期間內，菠蘿蛋白酶的吸附量幾乎變化不大，筆者可以認為吸附40 min后吸附量達到最大值為98.8 mg·g-1，故選取振蕩時間為40 min。

2.4.4.4振蕩速率的影響

考察振蕩速率V對吸附效果的影響，擬設計V為0、50、100、150、200、250 r·min-1條件下測其對菠蘿蛋白酶吸附量的關系。

圖5　速率與吸附效果關系

從圖5可知，振蕩速率V對吸附效果的影響很大，振蕩速率越快吸附效果越好，當V在0～50 r·min-1間，吸附相同的時間內其吸附量變化不明顯，是因為振蕩速率過小甚至靜置甘蔗渣再生纖維素微球與溶液接觸不充分，液質混合不均勻導致部分微球吸附不完全；而當速率由50 r·min-1升至100 r·min-1時吸附量顯著上升，隨之上升趨勢減弱，速率由200 r·min-1提升至250 r·min-1時吸附量變化不大，但是振蕩速率過高會造成溶液飛濺出錐形瓶和吸附劑黏在瓶壁上，導致實驗結果不準確。故本實驗選取振蕩速率由200 r·min-1為最佳，

此速度下甘蔗渣再生纖維素微球的吸附量為106.4 mg·g-1。

2.4.4.5體系pH的影響

擬設計體系pH分別為4、5、6、7、8、9、10條件下測其對菠蘿蛋白酶吸附效果的關系。

圖6　體系pH與吸附效果關系

從圖6可知，其吸附量隨體系pH值不斷上升而逐漸上升至最大后急劇下降，表現為：pH=9時吸附量最大為111.2 mg·g-1，而當體系pH=10時吸附量急劇下降，降至最小值59.3 mg·g-1。等電點（菠蘿蛋白酶）約為9.55，當體系pH=9時，菠蘿蛋白酶分子上正負電荷幾乎能相互抵消，在pH為10時失活，菠蘿蛋白酶變性使其結果發生變化從而影響菠蘿蛋白酶的吸附量［15］。分析認為，體系pH值得改變影響纖維素微球與菠蘿蛋白酶之間的靜電作用，再加上疏水基的影響，促進了吸附行為進行，所以當體系pH高于或低于其等電點，菠蘿蛋白酶表面所含負電荷增多，兩者之間的靜電排斥力影響吸附行為，直觀表現為吸附量下降。

2.5結論

本章以甘蔗渣再生纖維素微球為吸附劑，以菠蘿蛋白酶為模型蛋白，采用靜態吸附進行吸附實驗，考察菠蘿酶溶液初始濃度C0、時間t、溫度T、振蕩速率V、溶液pH等吸附工藝的影響。最佳方案為：C0為1000 mg·L-1、溫度313.2 K、pH為9、t為40 min和振蕩速率為200 r·min-1時最佳，微球對菠蘿蛋白酶的最大吸附量為136.2 mg·g-1，酶活為0.1～0.25 F.I.P-U·g-1之間，微球吸附率為22.56～80.40 %之間。

［1］ Ram Saran Chaurasiya， H.Umesh Hebbar，et al. Response surface optimization of bromelain-assisted gelatin extraction from surimi processing wastes［J］.Food Bioscience，2014，5: 9-18.

［2］ K.Pillai，A.Ehteda，J.Akhter，et al.P0203 Anticancer effect of bromelain alone and in combination with cisplatin or fluorouracil on malignant peritoneal mesothelioma cells［J］. European Journal of Cancer， 2014，50（4）:66.

［3］ Sunantha Ketnawa，Phanuphong Chaiwut，Saroat Rawdkuen. Pineapple wastes: A potential source for bromelain extraction［J］.Food and bioproducts processing，2012，90（3）: 385-391.

［4］ 張艷麗，邵龍泉.一種新型酶激活漂白牙膏的療效［J］. 中國口腔醫學繼續教育雜志，2013（3）:177-180.

［5］ Pandjaitan， Maruli， Nugraha. Bromelain Enzyme in Fresh Pineapple Juice as a Healing Pathway for HIV/AIDS［J］. Advanced Science，Engineering and Medicine，2014，6（1）: 119-123.

［6］ Jane E.Onken，Paula K.Greer，Brian Calingaert，Laura P. Hale. Bromelain treatment decreases secretion of pro-inflammatory cytokines and chemokines by colon biopsies in vitrio［J］. Clinical Immunology，2008，126（3）:345-352.

［7］ 王燕，趙力超.菠蘿蛋白酶工業化提取工藝的改良及酶學性質研究［J］.食品工業科技，2011，32（10）:65-68， 353-357.

［8］ 王平諸，孫軍社.菠蘿蛋白酶的三種生產工藝比較［J］.河南化工，2002（7）:1-3.

［9］ Helber B.Costa，Patricia M.B.Fernandesi，Wanderson Romao，et al.A new procedure based on column chromatography to purify bromelain by ion exchange plus gel filtration chromatographies［J］.Industrial Crops and Products，2014（59）: 163-168.

［10］ Ram Saran Chaurasiya， H.Umesh Hebbar，et al. Extraction of bromelain from pineapple core and purification by RME and precipitation methods［J］. Separation and Purification Technology，2013（111）: 90-97.

［11］ Paulo A.G.Soares，Antonio F.M.Vaz，Maria T.S.Correia， et al. Purification of bromelain from pineapple wastes by ethanol precipitation［J］.Separation and Purification Technology，2012，98: 389-395.

［12］ 鐘明良.甘蔗渣再生纖維素微球對牛血清蛋白的吸附性能研究［D］.南寧:廣西大學，2014.

［13］ 施特爾馬赫.酶的測定方法［M］.錢嘉淵，譯.北京:中國輕工業出版社，1992:9-101.

［14］ 易元龍.從菠蘿廢棄物分離提取菠蘿蛋白酶的研究［D］.南寧:廣西大學，2009.

［15］ Dubinin M.M.，Zaverina E.D.， Radushkevich L.V. Sorption and structure of activated carbons. I. Adsorption of organic vapours［J］.Zh. Fiz.Khim，1947，21（11）:1351-1362.

Adsorption technology to bromelain from cellulose microspheres

The optimal preparation condition and physio-chemical properties of microspheres were studied. The adsorption model of the regenerated cellulose microspheres to pineapple proteinase was discussed and the influencing factors were also investigated in the adsorption process.The enzyme activity and adsorption rate to bromelain were determinated. The results showed that the temperature313.2 K， pH 9， time 40 min， concentrations on the adsorption capacity of bromelain 1000 mg·L-1and speed 200 r·min-1were best. Finally the maximum absorptive capacity of microspheres was 136.2 mg·g-1， the enzyme activity was 0.1～0.25 F.I.P-U·g-1， also the adsorption rate was 22.56～80.40 %.

Regeneration； cellulose microspheres； bromelain； adsorption； technology

O636.11

A

1008-1151（2016）04-0038-04

2016-03-13

廣西民族大學—廣西化工研究院研究生聯合培養基地專項資助（BZD-001）；廣西民族大學研究生創新項目（gxun-chxs2015085）；

寧玉娟（1989－），女，廣西民族大學化學化工學院在讀碩士，研究方向為天然高分子材料的改性。

黃科林（1963－），男，中國科技開發院廣西分院教授級高級工程師，博士，研究方向為天然高分子材料的合成與改性。