加味丹參飲預處理中JAK2/STAT3通路對大鼠心肌細胞的保護機制研究

姚橘泉　常　拓　傅大霖　王慶高

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530001）

加味丹參飲預處理中JAK2/STAT3通路對大鼠心肌細胞的保護機制研究

姚橘泉1常拓1傅大霖1王慶高2

（1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530001）

目的：研究JAK2/STAT3通路在加味丹參飲預處理中對大鼠心肌細胞再灌注損傷的調控作用，從信號轉導水平探討加味丹參飲對梗死大鼠心肌的保護機制。方法：1.取各組大鼠各三只以Evans-bule，TTC雙染色法染色心肌，測定心肌梗死面積。2.石蠟包埋，切片，在光鏡行細胞心態學觀察。3.取各組大鼠各三只Western blot測定各組心肌細胞JAK2、STAT3蛋白的表達。最后應用SPSS 17.0 for Windows統計軟件將實驗結果進行統計學處理。多組比較采用單因素方差分析，p ＜0.05認為有統計學意義。結果：1.I/R組ST段向上抬高約0.75（心電圖背景的一豎格記為1）。加味丹參飲預處理組，ST抬高為0.50，下降了約33.3%。2.JDD組比I/R組梗死面積減少11%。3.加味丹參飲預處理組病理改變較I/R輕。4.I/R組的灰度值低于其他4組，有顯著差異（p＜0.05）。JDD組JAK2、STAT3表達與I/R組比較，有明顯的差異（P ＜0.05），JDD+AG490組，JDD+RPM組的STAT3灰度值明顯低于IPC組，有顯著性差異（P＜0.05）。JDD+RPM組的JAK2灰度值低于其他組，有顯著性差異（P＜0.05）。結論：在心肌梗死再灌注后存在缺血再灌注損傷，加味丹參飲預處理能有效對抗這種損傷，減輕心肌缺血再灌注損傷，降低心電圖抬高的ST段，改變心肌細胞的病理形態學，其機制與JAK/STAT轉導通路的干預有關，在JAK2/STAT3通路中，JAK2對STAT3有調控作用，而stat3對JAK2的表達同樣有反饋作用。他們共同在缺血再灌注損傷中起到保護缺血心肌的作用。加味丹參飲預處理通過激活JAK/STAT轉導通路，參與心肌細胞凋亡的保護。

JAK2/STAT3轉導通路；加味丹參飲；缺血預處理；缺血再灌注損傷

隨著人們生活方式的改變，心血管疾病已經成為危害人類健康的主要疾病之一，心肌梗死急性期治療的原則是盡快缺血心肌的血供。但是，心肌缺血再灌注（I/R）可以導致復雜的生理病理變化，即缺血再灌注損傷（reperfusion injury）。缺血再灌注損傷可使缺血區存活心肌及血管內皮細胞發生可逆及不可逆損傷壞死，導致缺血損傷加重及壞死面積加大。因此，解決再灌注損傷對心肌的再次傷害成為當務之急。

加味丹參飲在丹參飲（《時方歌括》）基礎上加川芎、赤芍、當歸、黃芪、扶芳藤、青蒿、黃連等藥化裁而成，功用行氣活血、化瘀解毒。該方以丹參為君，以活血化瘀。佐以當歸、扶芳藤補血活血，即取“若欲通之，必先充之”之意。川芎、赤芍、黃芪、檀香活血行氣，使氣行則血行。青蒿、黃連，清解瘀毒。青蒿素能減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，其機制可能與青蒿具有抗氧化和清除自由基的作用有關。

而JAK/STAT轉導信號通路是1992年發現的，涉及免疫、細胞增殖分化、細胞凋亡、炎癥、腫瘤等多種生理、病理過程的重要細胞內信號轉導通路。心力衰竭、缺血預處理誘導的心肌保護以及缺血再灌注引起的心功能障礙都與這個信號通路密切相關。其中JAK2/STAT3起到保護心肌的作用。那么，共同作為保護心肌的機制，加味丹參飲及JAK2/STAT3之間是否存在一定的內在聯系呢？本實驗此問題進行多層面的探討。

1　實驗方法

健康Wister大鼠50只，每只250～300g，適應性喂養一周后，將90只大鼠按照隨機數字法分為正常組（NC組）、缺血再灌注組（I/R組）、加味丹參飲預處理組（JDD組）、加味丹參飲+雷帕霉素組（JDD+RPM）組、加味丹參飲+JAK抑制劑α-氰基-（3，4-羥基）N-芐苯乙烯胺組（JDD+AG490組）。按照《藥理實驗方法學》（徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京:人民衛生出版社，2001:1179.）的造模方法制作心肌缺血再灌注模型。實時監測心電圖，心電圖ST段向上抬高為結扎成功。結束后：（1）取各組大鼠各三只以Evans-bule，TTC雙染色法染色心肌，測定心肌梗死面積，梗塞面積以壞死心肌重量與缺血區心肌重量之比表示。再取各組大鼠各三只石蠟包埋，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，常規HE染色，樹脂封片。在光鏡下以HP10x40行細胞心態學觀察。（2）取各組大鼠各三只Western blot測定各組心肌細胞JAK2、STAT3蛋白的表達。最后應用SPSS 17.0 for Windows統計軟件將實驗結果進行統計學處理。多組比較采用單因素方差分析，p＜0.05認為有統計學意義。

2　相關結果結論

2.1心電圖

結扎冠脈不同的時間后可造成心肌細胞不同程度的缺血損害。本實驗取結扎45min時的實施心電圖，多組對比后發現：I/R組在缺血結扎45 min時，ST段向上抬高約0.75（圖2，心電圖背景的一豎格記為1）。JDD組反復4次的5 min結扎，10 min再灌注的預處理后，再缺血結扎45 min時，ST段抬高有下降，ST抬高為0.50，下降了約33.3%（圖3，圖4）。說明JDD預處理可以改善缺血再灌注損傷心電圖。而與JDD+AG490組相比較，JDD組ST段抬高有所下降約0.2（圖3，圖4），說明JDD預處理有一定的拮抗AG490對JAK2的抑制效果。

圖1　正常心電圖

圖2　I/R結扎45 min

圖3　加味丹參飲預處理結扎45 min

圖4　JDD+AG490結扎45 min

2.2心肌梗死面積的測定

圖5　Evans-bule，TTC雙染色后心肌

結果顯示JDD組比I/R組梗死面積減少（p＜0.05），說明JDD預處理可以保護心肌缺血再灌注損傷；JDD+AG490組與JDD組相比，梗死面積增加（P＜0.05），說明JAK2/STAT3通路在缺血再灌注損傷中有保護心肌不收損傷的功效。見表1。

表1　心肌梗死面積比較（%

表1　心肌梗死面積比較（%

注：兩兩比較，與I/R組比較△p＜0.05 ，與IPC組比較 *p＜0.05

組別 梗死面積正常組 19.05%±0.34 I/R組 25.80%±0.31△JDD組 13.98%±0.36△JDD+AG490 19.94%±0.57*

3　病理觀察

結果顯示正常組的心肌組織未見充血、出血或炎性細胞浸潤，心肌肌原纖維排列整齊，肌節長度一致、排列規整，橫紋清晰，染色質清楚。I/R組的心肌纖維變長，排列紊亂和斷裂，肌纖維間距增寬，肌節縮短，排列不規整，間質水腫、充血或出血，有炎癥細胞浸潤。加味丹參飲預處理組雖有心肌的損傷但是心肌肌原纖維排列較規整，肌節排列亦較為整齊，偶見炎性細胞與紅細胞浸潤，病變較I/R輕。說明加味丹參飲預處理與IPC能減輕心肌梗死再灌注損傷的作用（圖6）。

圖6　左I/R組，右加味丹參飲預處理組

4　加味丹參飲預處理對JAK2/STAT3蛋白表達的影響

筆者將正常組設為A組，I/R組設為B組，JDD組設為C組，JDD+AG490組設為D組，JDD+RPM組設為E組進行Western blot測定可以發現：

（1）對于JAK2蛋白來講，與正常組比較，I/R組反而有所降低，差異有統計學意義（p＜0.05），說明在正常組織中，JAK2蛋白即有所表達，但在缺血再灌注損傷中，受到某種原因抑制。而JDD組JAK2蛋白的表達水平高于正常組且高于I/R組（B組），有明顯的差異（P＜0.05）。說明加味丹參飲預處理都可以激活JAK2的表達（表2）。

表2　各組灰度水平比較（）

表2　各組灰度水平比較（）

注：兩兩比較，與正常組比較**p＜0.05，與I/R組比較△p＜0.05，與JDD組比較*p＜0.05，***p＜0.05

組別 n JAK2 STAT3 A組 5 73.2±5.9 103.6±5.1 B組 5 63.4±3.6 ** 98.4±3.1** C組 5 109.6±4.7△ 143.2±5.8△* D組 5 99.3±1.8△* 117.3±6.6*** E組 5 114.1±1.8*** 123.3±6.6*

（2）同樣對于STAT3蛋白來講，I/R組表達低于正常組，差異有統計學意義（p＜0.05），即缺血再灌注損傷中，STAT3的表達一樣受到某種原因的抑制。暗中提示JAK2與STAT3有存在某種聯系。而JDD組STAT3蛋白表達水平依舊高于正常組與I/R組，有明顯的差異（p＜0.01），說明JDD預處理也可以提高STAT3的表達水平。

（3）在加入了JAK2抑制劑AG490后，JDD+AG490組的灰度值也明顯低于JDD組，有顯著差異（p＜0.05）。結合梗死面積及病理觀察可知在加入了抑制劑后，JDD+AG490組梗死面積增大，病態組織細胞增多，可以說明抑制了JAK2蛋白的表達后，缺血預處理與加味丹參飲預處理保護心肌再灌注損傷的作用都會減弱，即在IPC與JDD保護心肌再灌注損傷的過程中，JAK2蛋白起著重要的作用。

（4）同樣在加入了STAT3抑制劑RPM后，JDD+RPM組的灰度值也明顯低于JDD組，有顯著差異（p＜0.05）。同樣結合梗死面積及病理觀察可以說明STAT3蛋白也在缺血預處理與加味丹參飲預處理保護心肌再灌注損傷的過程中起著重要的作用。

（5）同時筆者還發現與JDD組比較，JDD+AG490組的STAT3蛋白的灰度值也明顯降低，差異有統計學意義（p＜0.05）。說明在抑制了JAK2蛋白的表達后，STAT3蛋白的表達也受到了抑制。即JAK2蛋白參與了調控STAT3蛋白的表達水平。而與JDD組比較，JDD+RPM組的JAK2蛋白的灰度值反而有所增高，說明在抑制了STAT3蛋白的表達后，對JAK2蛋白的表達有反饋增強作用。揭示了JAK2蛋白與STAT3蛋白的內在聯系。

圖7　各組JAK2/STAT3的免疫印跡的圖片及柱狀圖

綜上所述，可得出結論在心肌梗死再灌注后存在缺血再灌注損傷，加味丹參飲預處理能有效對抗這種損傷，減輕心肌缺血再灌注損傷，降低心電圖抬高的ST段，改變心肌細胞的病理形態學，其機制與JAK2/STAT3轉導通路的干預有關，在JAK2/STAT3通路中，JAK2對STAT3有調控作用，而STAT3對c-myc有調控作用，反過來講，c-myc對stat3的表達有一定影響，而stat3對JAK2的表達同樣有反饋作用。他們共同在缺血再灌注損傷中起到保護缺血心肌的作用。加味丹參飲預處理通過激活JAK2/STAT3轉導通路，參與心肌細胞凋亡的保護。

5　討論

JAK/STAT轉導通路中JAK1、JAK2、STAT1、STAT3與IPC相關［1］。Hattori等［2］報道離體大鼠心臟模型在IPC后即刻和再灌注2h JAK2和STAT3酪氨酸磷酸化增加，同時心功能改善，梗死面積和凋亡細胞數減少。表明JAK2/STAT3通路有保護心肌再灌注損傷的作用。王高頻等［3］在離體大鼠心臟I/R過程的實驗中發現，隨著再灌注時間的延長，心功能逐漸惡化，壞死心肌細胞數逐漸增多，JAK/STAT通路的兩個亞型STATl、STAT3均被激活。在缺血30min 時STAT3 即被激活，先于大量心肌細胞壞死和明顯心功能惡化之前，隨后的再灌注過程中STAT3保持原有激活狀態，與缺血30 min比未見進一步增高，而STATl的激活則遲于STAT3，在缺血30 min時未見明顯變化，在再灌注5 min開始激活，30 min達到高峰，后略有降低，但仍處于較高水平的激活狀態。從上述實驗結果可以看出，STAT3蛋白的激活存在于整個缺血及再灌注過程中，其與心功能和心肌細胞壞死程度呈高度相關性，說明STAT3蛋白參與了I/R損傷，IPC修復的全過程。已有報道［4］，給予小鼠6個循環的4min缺血4min再灌注，IPC后即刻在再灌注區即可見JAK2的激活。而在IPC后30min，Western Blot表明STAT3從胞質易位到核，伴有核內2種蛋白成分磷酸化的增多，說明這兩種轉錄因子被激活。參與了IPC的保護作用。本實驗中，IPC組與JDD組的JAK2/STAT3蛋白明顯高于I/R組，與上述試驗結果一致，結合病理梗死面積等試驗可得出結論，JAK2/STAT3蛋白在心肌缺血再灌注的損傷中起保護心肌細胞的作用。

加味丹參飲關于心肌缺血預處理已經有了不少研究，動物實驗結果也已經取得了成效。易剛強［5］，李鑫輝［6］，蘇偉［7］等的實驗研究結果表明加味丹參飲能夠降低心肌酶譜的水平從而達到保護心肌的作用；廖菁等［8］的做了加味丹參飲預處理的實驗在證明加味丹參飲預處理能夠抑制血小板的粘附與聚集，預防冠心病的發生；李鑫輝［9-10］究證明了對于抑制心肌細胞的凋亡及降低炎癥因子水平的保護作用，加味丹參飲預處理后也能做到；王慶高等［11］，黃政德等［12］的研究表明用加味丹參飲對大鼠的心肌預處理后發現能夠延遲心肌的損傷從而保護心肌損傷的作用；黃政德等［13］還做了兔實驗研究證明加味丹參飲預處理后能夠改善心功能，改善生活質量；李鑫輝［14］的實驗得出了加味丹參飲預處理能夠改善動脈內皮功能及超微架構的作用，預防心肌重構，抑制心肌肥大等作用。

6　結語

目前西醫研究最多的是與缺血機制有關的受體、酶、離子通道的特異性激動劑及抑制劑，如腺苷A1受體興奮劑R-PLA，蛋白激酶C的激動劑DOG，ATP依賴鉀通道激動劑等，但這些藥物具有西藥的典型副作用，同時缺少運用于臨床的實驗依據，尚不能放心的在臨床上使用［15］。而祖國醫學在這方面有很大優勢，如扶芳藤，青蒿等再如本文的加味丹參飲。所以，探討藥物預處理對缺血再灌注損傷心肌的保護，發揚傳統醫學，還需進行進一步的研究和探索。

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［15］ 譚元生，鄧圣明，譚超.藥物預處理對缺血再灌注損傷心肌的保護作用［J］.中醫藥學刊，2003，21（6）:877.

Study on the protective mechanism of Jiaweidanshenyin preconditioning on JAK2/STAT3 pathway in rat myocardial cells

Objective: To study the regulation of JAK2/STAT3 signaling pathway in Jiaweidanshenyin preconditioning on myocardial cells of ischemia-reperfusion injury in rats and investigate the protective mechanism of Jiawei Danshen Decoction on myocardial infarction in rats from signal transduction. Methods: 1 rats of each three to Evans-bule， TTC double staining of myocardium， myocardial infarct size was determined， 2 paraffin embedded sections， observed under light microscope for cell mentality. The expression of 3 rats each take three Western blot measured the myocardial cell JAK2， STAT3 protein. The application of SPSS 17 for Windows statistical software test results were analysed statistically. Multiple groups were compared with single factor analysis of variance， P ＜0.05 was considered statistically significant. Results: the ST segment of the 1.I/R group was raised up to about 0.75 （a vertical grid of the ECG background was 1）. Modified Danshen Decoction pretreatment group， ST elevation of 0.50， a decrease of about 33.3%. The infarct area of 2.JDD group was 11% less than that of group I/R. 3 the pathological changes of the pretreatment group were lighter than I/R. The gray value of 4.I/R group was lower than the other 4 groups， and there was significant difference （p＜0.05）. JAK2 and STAT3 expression in JDD group compared with I/R group， with significant difference （P ＜0.05）， JDD+AG490 group， JDD+RPM group， the gray value of STAT3 was significantly lower than IPC group，there was significant difference （P＜0.05）. In group JDD+RPM， the gray value of JAK2 was lower than that of the other group， there was significant difference （P＜0.05）.Conclusion: in the myocardial infarction and reperfusion of ischemia reperfusion injury， Jiawei Danshen Decoction pre treatment can be effective against this damage， reduce myocardial ischemia reperfusion injury， reduce the elevation of electrocardiogram ST segment， morphological changes of myocardial cells， and the mechanism of JAK / STAT pathway related to the intervention， in the JAK2 / STAT3 pathway in JAK2 STAT3 have regulation， and expression of JAK2 STAT3 also feedback. They are common in ischemia reperfusion to protect myocardial ischemia injury in rats. Jiaweidanshenyin preconditioning via activation of JAK/STAT signaling pathway， involved in the protection of myocardial cell apoptosis.

JAK2/STAT3 transduction pathway； Jiaweidanshenyin； ischemic preconditioning； ischemia reperfusion injury

R28

A

1008-1151（2016）04-0066-04

2016-03-03

國家自然科學基金項目（81160437）。

姚橘泉，廣西中醫藥大學在讀碩士，從事中西醫結合防治心血管疾病研究。

王慶高，廣西中醫藥大學第一附屬醫院副教授，從事中西醫結合防治心血管疾病研究。