腸出血性大腸桿菌效應(yīng)因子z2151的E3泛素連接酶活性鑒定

陳芳紅，李 濤，李 嶄，孫超塵，王 慧

◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

腸出血性大腸桿菌效應(yīng)因子z2151的E3泛素連接酶活性鑒定

陳芳紅1，2，李 濤2，李 嶄2，孫超塵2，王 慧1，2

目的 利用基因工程方法原核表達(dá)z2151蛋白，并鑒定其E3泛素連接酶活性。方法 以腸出血性大腸桿菌O157∶H7為模板，PCR擴增目的基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET22b-z2151，轉(zhuǎn)化BL21（DE3），誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，采用鎳柱親和純化獲取目的蛋白；通過體外泛素化實驗檢測蛋白泛素連接酶活性。結(jié)果 親和純化得到較高濃度和純度的z2151蛋白，其在體外泛素化反應(yīng)中能夠促使泛素小分子形成多聚泛素鏈，即有E3泛素連接酶活性；而且對E2泛素結(jié)合酶具有一定的選擇特異性。結(jié)論 原核表達(dá)質(zhì)粒pET22b-z2151構(gòu)建成功，目的蛋白z2151具有泛素連接酶的體外泛素化能力，并且針對不同的E2酶親和力不同，這些都為后續(xù)功能機制研究奠定了基礎(chǔ)。

基因工程；腸出血性大腸桿菌O157∶H7；泛素連接酶；體外泛素化

腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157∶H7是人和動物重要的腸道致病菌［1］，可通過侵染水源、食物等感染宿主導(dǎo)致腹瀉、出血性結(jié)腸炎等，帶來嚴(yán)重的臨床危害［2］，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［3］。2006年P(guān)NAS上報道過一些EHEC效應(yīng)因子，其中z2151屬于效應(yīng)分子之一，存在于細(xì)菌前噬菌體上，屬于非毒力島編碼的效應(yīng)因子，是一種含有類似Ring結(jié)構(gòu)域（環(huán)指結(jié)構(gòu)）的E3泛素連接酶。E3泛素連接酶發(fā)現(xiàn)較晚，數(shù)量龐大且功能復(fù)雜，是近年來研究的熱點，E3泛素連接酶是泛素化途徑中決定底物特異性的關(guān)鍵酶，參與細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)等的介導(dǎo)調(diào)控［4］。此外，在底物靶蛋白未知的情況下，E3酶可以調(diào)控泛素分子之間形成多聚泛素鏈或者將泛素鏈連接在自身蛋白上［5］。該研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并純化得到His-z2151蛋白；后續(xù)活性檢測顯示其具有泛素連接酶的體外泛素化能力，初步探究了z2151分子的泛素化作用，為后續(xù)其他功能機制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 腸出血性大腸桿菌O157∶H7菌株EDL933、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-T1 simple載體均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET22b載體為實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 高保真TransStart Taq DNA聚合酶、DNA Marker及蛋白Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；基因組提取試劑盒購自美國Promega（北京）公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自美國New England Biolab公司；LB培養(yǎng)基（干粉）購自英國OXOID公司；氨芐西林（Amp）、IPTG購自德國Sigma公司；HisTrap FF crude 5 ml預(yù)裝柱、半干膜電轉(zhuǎn)儀購自美國GE（北京）公司；E1酶（UBE1）、E2酶（UBE2D2、UBE2E3）、抗泛素抗體（anti-Ub）、泛素（Ub）購自美國Boston Biochem公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；瓊脂糖凝膠電泳儀購自北京六一儀器廠；超聲波細(xì)胞粉碎機購自寧波新芝生物科技股份有限公司；蛋白電泳儀及凝膠成像分析儀ChemiDocTMXRS購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 PCR引物由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成，用于擴增z2151基因，其中z2151上游引物：5′-CATATGATGCCTGTAGATTTAACG-3′（下劃線標(biāo)注限制性內(nèi)切酶酶切位點NdeⅠ），下游引物：5′-CTCGAGATTTTTTAAAACGAAGTTAC-3′（下劃線標(biāo)注限制性內(nèi)切酶酶切位點XhoⅠ）。

1.2.2 目的基因z2151的克隆 LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)EHEC O157∶H7，次日提取基因組。然后以EHEC O157∶H7基因組為模板，PCR擴增z2151基因，序列大小為642 bp，PCR擴增條件：95℃、10 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、40 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。純化回收PCR產(chǎn)物，與克隆載體pEASY-T1 simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進行克隆。次日挑取克隆，引物z2151F、z2151R進行PCR鑒定，將陽性克隆提取重組質(zhì)粒。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切pEASY-z2151和空載體pET22b，并回收目的片段和載體，兩者16℃連接過夜。取5 μl連接產(chǎn)物加入到100 μl剛解凍的感受態(tài)細(xì)胞中（DH5α），冰浴30 min，42℃熱激45 s，冰上2 min，加入500 μl常溫的LB培養(yǎng)基，37℃搖菌1 h，取100 μl菌液涂勻涂于含氨芐的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日挑取克隆，引物z2151F、z2151R進行PCR鑒定，將陽性克隆提取重組質(zhì)粒，測序正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，SDS-PAGE鑒定表達(dá)。

1.2.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 陽性單克隆培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接至1 L LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min，培養(yǎng)至菌液光密度（optical density，OD）值0.6，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，20℃、110 r/min誘導(dǎo)表達(dá)20 h。用緩沖液A（20 mmol/L磷酸鈉、500 mmol/L氯化鈉、40 mmol/L咪唑，pH 7.4）沖洗菌體，收集菌體并超聲破碎，獲取細(xì)菌蛋白，5 000 r/min、4℃離心取上清液，預(yù)裝柱純化目的蛋白步驟如下，取100 ml蒸餾水洗預(yù)裝柱，小心注射，防止帶進氣泡；用100 ml緩沖液A平衡柱子，蛋白混合液上清緩慢注入預(yù)裝柱；再用100 ml A液平衡預(yù)裝柱；最后用洗脫液B（20 mmol/L磷酸鈉、500 mmol/ L氯化鈉、400 mmol/L咪唑，pH 7.4）洗脫收集目的蛋白，每管5 ml，收集6管；再用B液80 ml洗預(yù)裝柱，除去殘余蛋白后保存于20%酒精。SDS-PAGE蛋白電泳鑒定目的蛋白，透析蛋白，緩沖液（0.5 mmol/LTCEP、300mmol/LNaCl、10mmol/L HEPES，pH 7.5）透析保存，并檢測蛋白純度和濃度。

1.2.5 目的蛋白z2151泛素連接酶活性的鑒定20 μg反應(yīng)體系：2 μg His6-z2151蛋白，0.13 μg E1酶，2 μg E2酶（UBE2D2、UBE2E3），4 μg泛素蛋白，反應(yīng)緩沖液［50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），100 mmol/L NaCl，10 mmol/L ATP，10 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L DTT］，37℃水浴孵育1 h，4×SDSPAGE loading buffer終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物和預(yù)染Marker進行SDS-PAGE電泳，初始電壓110 V、20 min，然后調(diào)換電壓至180 V、60 min進行分離。將PVDF膜用甲醇浸濕30 s，將分離膠、PVDF膜及濾紙同時浸泡在電轉(zhuǎn)緩沖液中30 min。使PVDF膜位于正極，膠位于負(fù)極，65 mA電轉(zhuǎn)1.5 h，使蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將電轉(zhuǎn)后的PVDF膜浸泡于脫脂奶粉中，室溫封閉2 h后PBST溶液洗膜3次，每次10 min。將PVDF膜置于密封袋，加入稀釋好的一抗溶液（anti-Ub），4℃放置過夜。洗膜5次，加入稀釋好的二抗，室溫震蕩40 min，PBST溶液充分洗滌后進行曝光檢測。

2 結(jié)果

2.1 目的基因z2151的擴增 高保真Taq酶PCR擴增z2151基因，大小642 bp，測序鑒定正確，與Genbank公布序列一致，瓊脂糖膠回收并純化PCR產(chǎn)物，連接克隆載體pEASY-T1 simple進行片段擴增，用于后續(xù)酶切。見圖1。

圖1 PCR擴增z2151基因M：2 000 bp DNA Marker；A：z2151基因片段

2.2 重組克隆的篩選與鑒定 雙酶切基因片段和pET22b載體，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，次日挑選氨芐LB平板上的單克隆，以引物z2151F、z2151R鑒定重組菌，片段大小為642 bp，證明表達(dá)載體構(gòu)建成功。見圖2。重組質(zhì)粒pET22bz2151轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞用于蛋白的表達(dá)。

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 添加IPTG誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的BL21（DE3）表達(dá)菌，以5 000 r/min、4℃離心30 min獲取菌體沉淀，裂解變性后SDSPAGE鑒定有明顯蛋白表達(dá)，蛋白大小為24 ku，與預(yù)測理論值相同，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)成功。見圖3。

圖2 PCR鑒定z2151基因M：2 000 bp DNA Marker；A：PCR擴增的目的基因片段

圖3 目的蛋白z2151的表達(dá)鑒定M：Marker；A：全菌表達(dá)鑒定（箭頭所示）

2.4 目的蛋白的親和純化 大批發(fā)酵的菌體蛋白經(jīng)超聲破碎后，8 000 r/min、4℃離心30 min取上清液，利用蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽這一特性，采用鎳柱親和純化，洗脫后，對先后洗脫的蛋白液分別進行SDS-PAGE分離鑒定，可見目的蛋白（箭頭所示）從第2管開始被洗脫出柱，至第4管仍有大量蛋白出現(xiàn)，雜蛋白較少，純度達(dá)到95%，Bradford定量，蛋白濃度高達(dá)0.8 mg/ml。見圖4。

圖4 z2151蛋白純化電泳圖M：Marker；A～D：純化的z2151蛋白（箭頭所示）

2.5 目的蛋白的泛素連接酶活性鑒定 在底物靶蛋白未知的情況下，E3泛素連接酶可以自身進行泛素化，抗泛素抗體檢測反應(yīng)復(fù)合物會呈現(xiàn)大小不同的蛋白條帶。體外泛素化反應(yīng)體系：E1（UBE1），E2：UBE2D2、UBE2E3，泛素（Ub），z2151蛋白，抗泛素抗體（anti-Ub）檢測。蛋白呈現(xiàn)梯形分布，泛素鏈大小是由泛素分子數(shù)量決定的，針對不同的E2酶（UBE2D2、UBE2E3），泛素鏈形成的大小與數(shù)量都有差異，z2151泛素連接酶與UBE2D2親和力更高，活性更大。分布在35～100 ku甚至更大的條帶均為泛素鏈蛋白。見圖5。

圖5 z2151蛋白的自身泛素化

3 討論

泛素化作為一種蛋白的翻譯后修飾，調(diào)控眾多生物進程，啟動細(xì)胞快速應(yīng)答周圍環(huán)境的改變［6］。泛素化最初是在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的［7］，泛素化是一個包括E1（泛素激活酶）、E2（泛素結(jié)合酶）、E3（泛素連接酶）蛋白的多酶級聯(lián)反應(yīng)［8］。其中，泛素連接酶E3在調(diào)節(jié)生物過程中起著關(guān)鍵作用，很多疾病的發(fā)生都與其異常表達(dá)有關(guān)。真核生物中已發(fā)現(xiàn)近千種E3酶，數(shù)量龐大，而且功能復(fù)雜各異。然而在細(xì)菌中是缺乏這樣典型的泛素化系統(tǒng)的，即缺失所有或者部分關(guān)鍵酶，沒有完整泛素化必備元件，必須借助外界條件進行泛素修飾。研究［9-10］表明許多細(xì)菌病原體利用一些毒力因子破壞并開發(fā)宿主泛素化系統(tǒng)，有效觸發(fā)宿主泛素化系統(tǒng)，使病原菌逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊。已有許多證據(jù)顯示一些病原菌編碼分泌的效應(yīng)因子具有E3泛素連接酶活性。這些E3酶效應(yīng)物運輸進入宿主體內(nèi)，挾持宿主泛素化途徑，使得細(xì)菌顛覆宿主防御系統(tǒng)，篡奪宿主細(xì)胞功能，操縱宿主信號系統(tǒng)來利于自身生存。如在EHEC中發(fā)現(xiàn)了有E3連接酶活性的NleL效應(yīng)分子［11］，其作為一種E3泛素連接酶，在EHEC的定植和侵染擴散細(xì)胞過程中扮演重要角色。

EHEC是一種食源性致病菌，也是人和動物重要的腸道致病菌，可引起嚴(yán)重腹瀉，其感染還會帶來嚴(yán)重的臨床危害。在EHEC的效應(yīng)分子中發(fā)現(xiàn)了z2151分子，為了證實z2151分子E3泛素化連接酶活性及后續(xù)的功能機制，是否參與細(xì)菌的感染與治病等。本研究成功獲得z2151的可溶性原核表達(dá)，并且體外泛素化實驗顯示，重組z2151具有E3泛素連接酶活性，并且針對不同的E2酶選擇性不同。這為后續(xù)深入研究酶的功能機制及可能的底物關(guān)系奠定良好的基礎(chǔ)。并且有助于豐富細(xì)菌調(diào)控宿主免疫系統(tǒng)的理論研究。

［1］ Piscatelli H，Kotkar S A，McBee M E，et al.The EHEC typeⅢeffector NleL is an E3 ubiquitin ligase that modulates pedestal formation［J］.PLoS One，2011，6（4）：e19331.

［2］ Pacheco A R，Sperandio V.Shiga toxin in enterohemorrhagic E.coli：regulationand novel anti-virulence strategies［J］.Front Cell Infect Microbiol，2012，2：81.

［3］ Tyler J S，Beeri K，Reynolds J L，et al.Prophage induction is enhanced and required for renal disease and lethality in an EHEC mouse model［J］.PLoS Pathog，2013，9（3）：e1003236.

［4］ Ashida H，Kim M，Sasakawa C.Exploitation of the host ubiquitin system by human bacterial pathogens［J］.Nat Rev Microbiol，2014，12（6）：399-413.

［5］ 李楊，李棟.泛素連接酶-底物選擇關(guān)系的研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2015，31（1）：11-20.

［6］ 盧亮，李棟，賀福初.蛋白質(zhì)泛素化修飾的生物信息學(xué)研究進展［J］.遺傳，2013，35（1）：17-26.

［7］ 馬苗苗，李偉，井勇，等.牛孤雌胚胎發(fā)育過程中泛素定位與線粒體分布的相關(guān)性［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，41（1）：33-9.

［8］ 楊莉佳，王江，石秋燕，等.SCF E3泛素化連接酶的研究進展［J］.四川生理科學(xué)雜志，2014，36（3）：122-4.

［9］ Hicks S W，Galán J E.Hijacking the host ubiquitin pathway：structural strategies of bacterial E3 ubiquitin ligases［J］.Curr Opin Microbiol，2010，13（1）：41-6.

［10］Collins C A，Brown E J.Cytosol as battleground：ubiquitin as a weapon for both host and pathogen［J］.Trends Cell Biol，2010，20（4）：205-13.

［11］Lin D Y，Diao J，Zhou D，et al.Biochemical and structural studies of a HECT-like ubiquitin ligase from Escherichia coli O157∶H7［J］.J Biol Chem，2011，286（1）：441-9.

The E3 ubiquitin ligase activity identification of enterohemorrhagic Escherichia coli z2151 effector

Chen Fanghong1，2，Li Tao2，Li Zhan2，et al
（1Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Medical Sciences，
Anhui Medical University，Hefei 230032；2State Key Laboratory of Pathogens and Biosecurity，Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071）

Objective To express z2151 protein in E.coli by genetic engineering methods，and to identify its E3 ubiquitin ligase activity.Methods The full-length z2151 were cloned from EHEC O157∶H7 by PCR and were inserted into plasmid pET22b to construct the recombinant expression vector pET22b-z2151.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21（DE3）strains which were incubated for expression.And the recombinant protein was purified using Ni2+NTA Sephrose；the in vitro ubiquitination method was used to identify its ubiquitin ligase activity.Results The z2151 protein of high concentration and purity was obtained，and found its E3 ubiquitin ligase activity by which it could help ubiquitin to form polyubiquitin chains in vitro activity；what's more，the z2151 protein selectively interacted with human E2 ubiquitin conjugating enzymes.Conclusion The recombinant expression vector pET22b-z2151 has been constructed，and the protein z2151 shows good ubiquitin ligase activity.The experiments provide reference for the study of the functional mechanism in the future.

genetic engineering；EHEC O157∶H7；ubiquitin ligase；in vitro ubiquitination

R 378.21；Q 78

A

1000-1492（2016）08-1077-04

時間：2016-6-22 14：44：57

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.002.html

2016-05-04 接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81401643）

1安徽醫(yī)科大學(xué)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，合肥 230032

2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

陳芳紅，女，碩士研究生；

王 慧，女，研究員，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：Geno0109@vip.sina.com