SETDB1在乳腺癌中的表達及對癌細胞株增殖和遷移能力的影響

王小利，許德英，劉 剛，常永超

SETDB1在乳腺癌中的表達及對癌細胞株增殖和遷移能力的影響

王小利1，許德英1，劉 剛2，常永超1

目的 研究組蛋白甲基化酶SETDB1在乳腺癌中的表達情況及對其癌細胞株增殖和遷移能力的影響。方法

乳腺癌；SETDB1；基因沉默；細胞增殖；細胞遷移

世界衛生組織最新統計數據顯示，乳腺癌在全世界女性中成最高發的癌癥，而中國乳腺癌亦位于女性發病率第一位，故探討乳腺癌的發生發展機制，尋找新的治療靶點與藥物，對其診斷和預后評估具有重大意義。SETDB1（SET domain bifurcated 1）又稱ESET或KMT1E，是一種組蛋白賴氨酸甲基轉移酶（histone lysine methyltransferases，HMT），屬Suvar3-9家族。SETDB1在染色體結構中由高度保守的150個氨基酸序列結合而成［1］，其編碼的蛋白質位于人染色體1q21［2］，可促使組蛋白H3-K9甲基化［3］，這種甲基化作用可作為一種異染色質蛋白1（heterochromatin protein 1，HP1）甲基化組蛋白表觀遺傳轉錄抑制的標簽［4］。已被證實SETDB1在肺癌［5］、黑色素瘤［6］、前列腺癌［7］、肝癌［8］等多種腫瘤中高表達，目前有報道［9］SETDB1在乳腺癌細胞株中亦高表達，但在乳腺癌組織及細胞功能學方面研究尚未見報道。該研究擬首先在乳腺癌組織及細胞株中檢測其表達情況，再通過轉染手段檢測其被沉默后對癌細胞株增殖和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床標本及細胞系來源 收集河南科技大學第一附屬醫院乳腺科原發性乳腺癌及癌旁（距病灶≥2 cm以上）組織38例，所有樣本經本院病理中心確診，采集均經過患者及家屬知情同意，所有患者術前未行放化學等治療，無其他原發腫瘤；此38例患者年齡34～81（52.97±12.14）歲。T47D、ZR75-1、ZR75-30、BT549、MDA-MB-453、HBL100共6株細胞系均為復旦大學腫瘤醫院乳腺癌研究所贈送（其中HBL-100為乳腺上皮細胞株，余為乳腺癌細胞株），293T細胞株為實驗室自備。

1.2 主要試劑 2×SYBR Green qPCR Mix（瑞士Roche公司）；SETDB1及GAPDH引物（上海生工生物公司）；RPMI 1640、DMEM培養基及胎牛血清（FBS）（以色列BI公司）；SETDB1（H300）抗體（美國Santa Cruz公司）；Alexa Fluor 488熒光抗兔IgG Fab2（美國Cell signaling公司）；流式細胞周期試劑盒（德國Miltenyi公司）。

1.3 主要儀器 實時熒光定量PCR儀（美國ABI-7500公司）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad-Universal HoodⅡ公司）；全自動酶標儀（美國Thermo-354公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon-TI-DH公司）；流式細胞儀（美國BD-FACS Calibur公司）。

1.4 細胞培養 常規培養人乳腺細胞系，ZR75-1、ZR75-30、HBL100用含10%FBS的RPMI 1640培養基，T47D、BT549、MDA-MB-453及293T用含10% FBS的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱，取對數生長期細胞進行試驗。

1.5 慢病毒包裝穩定轉染 SETDB1 4個shRNA干擾序列分別為GGGTATCTCTATGGAGGAACT、GCATGCGAATTCTGGGCAAGA、GCTCAAGAGTGGCCAGCTTAT、GCGGTTGACAGTGATGATATC，利用293T細胞對shRNA表達質粒及含GFP的對照組質粒進行慢病毒包裝，將收獲的24 h和48 h病毒加入剛貼壁的每孔約5×105個目的細胞的6孔板中，觀察熒光，待出現熒光細胞數達50%以上時用嘌呤霉素（1 μg/ml）篩掉未感染細胞，以此克隆出沉默靶基因的細胞，提取總蛋白及RNA檢測SETDB1表達，篩選出沉默效果最佳的兩組克隆細胞，進行下一步實驗。

1.6 RT-PCR實驗 提取38例癌及癌旁組織和融合度至80%～90%的細胞株中總RNA，取1 μg RNA樣品20 μl體系行逆轉錄反應，條件為：42℃、60 min，25℃、5 min，70℃、5 min，4℃、5 min；取1 μl cDNA產物進行RT-PCR反應，體系為20 μl，反應條件為：95℃、15 min 1個循環預變性，之后95℃、10 s，60℃、32 s，共40個循環。熒光定量PCR引物由Primer 5.0軟件設計（以GAPDH為內參），序列如下：SETDB1上游引物：AAGACCAGAAGCTCCGTGAA，下游引物：CCTGGGAACTGCTCTTCTTG；GAPDH上游引物：CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，下游引物：TGAGCGATGTGGCTCGGCT。以HBL-100細胞株作對照，用2-ΔΔCt法計算SETDB1相對表達量，實驗重復3次，選擇表達量最高的細胞株用以沉默SETDB1基因，行后續實驗。

1.7 IHC實驗 取38例患者癌及癌旁石蠟組織切片，經烤片、脫蠟、水化、抗原修復，滴加過氧化物酶阻斷劑，經血清封閉后加一抗SETDB1（1∶100稀釋）過夜，翌日用PBS清洗過后加二抗結合及鏈霉卵白素工作液，然后DAB染色至細胞核著色時終止反應，再經蘇木精復染，鹽酸酒精分化，返藍、脫水、透明、封片，由兩位病理醫師閱片。

1.8 Western blot實驗 收獲融合度80%～90%的細胞，加入250～500 μl蛋白裂解液，提取總蛋白定量并變性，經8%SDS-PAGE電泳、轉膜、5%脫脂牛奶封閉，孵育SETDB1一抗4℃過夜，室溫孵育二抗2 h，TBST洗膜后ECL顯影，凝膠成像系統檢測，實驗重復3次，Image Lab軟件分析目標條帶的分子量和光密度值，用以檢測SETDB1蛋白水平上的相對表達情況。

1.9 免疫熒光（IF）實驗 計數5×103個細胞接種于載玻片培養瓶，待細胞平鋪均勻時，固定、通透、封閉后孵育SETDB1一抗4℃過夜，PBS洗3次，加熒光二抗室溫避光孵育2 h，DAPI染核，熒光觀察，PBS及蒸餾水洗后封片，熒光拍照。

1.10 CCK-8檢測細胞活性 制備單細胞懸液，調整細胞濃度為3×104個/ml，每孔加100 μl細胞懸液接種于96孔板，行常規培養，酶標儀測吸光度（optical density，OD）值，前4 h每孔加10 μl CCK-8溶液，在450 nm波長處測其OD值，共設置7個時間檢測點，即第1、3、5、7、9、11、12天，每組每個檢測點設6個復孔，繪制生長曲線。

1.11 流式細胞術檢測細胞周期 每孔2×106個細胞接種于6孔板，待長至對數生長期后收獲細胞，經固定、洗滌、計數，使每管細胞量約1×106個，加入400 μl溴化乙錠（PI，50 μg/ml）及100 μl RNase A（100 μg/ml），4℃避光孵育30 min，上機檢測，每組實驗重復3次。

1.12 軟瓊脂克隆形成率 1.2%Argrose與2×完全培養基（20%FBS+2×DMEM+2×抗生素）1∶1混合，加1.5 ml下層膠于6孔板中，室溫靜置待其凝固；用2 ×完全培養基配好單細胞懸液與0.7%Argrose 1∶1混合，取1 ml鋪上層膠，每孔鋪1×103個細胞，待上層瓊脂凝固后，置于培養箱培養4～5周，間隔2 d補加200 μl完全培養基，每組細胞設置3個復孔。計數視野中＞0.05 mm的克隆和所有克隆數，克隆形成率（%）=大于0.05 mm克隆數/接種細胞數×100%。

1.13 干細胞成球率 配制專用培養基，每500 ml DMEM基礎培養基中加入10 ml B-27（50×）及終濃度為20 ng/ml的EGF，取處于對數生長期的克隆細胞組及對照組細胞制備單細胞懸液，接種于低吸附6孔板中，每孔約5×103個細胞，每2 d加入1 ml專用培養基，培養12 d后拍照，利用圖像以球直徑≥50 μm為標準計數成球數，每組細胞設置3個復孔，微球體形成率（%）=球體形成數/接種細胞數× 100%。

1.14 Transwell方法測定遷移能力 選擇Corning FlouroBlok基底膜的12孔板Transwell小室，上室加50 μl無血清培養基置于37℃平衡1 h，取5×105個/ml無血清細胞懸液200 μl加至上室，600 μl 20%DMEM培養基加至下室，室溫靜置30 min。熒光顯微鏡下（×100）計數濾膜下表面穿膜細胞數，培養48 h后，隨機計數5個視野，計算穿膜細胞均數。

1.15 IHC半定量分析 采用學術界公認的方法：①癌細胞陽性細胞數為0、≤25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，分別計為0、1、2、3和4分；②癌細胞染色強度棕褐色小塊狀、棕色粗顆粒狀、淺棕色細顆粒狀、未染色分別計為3、2、1和0分。兩項的乘積＞3分為免疫反應陽性。

1.16 統計學處理 采用Graph Pad Prism 5.0軟件對數據進行分析，計量資料以±s表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用方差分析；計數資料采用χ2檢驗或Fisher's檢驗。

2 結果

2.1 SETDB1在乳腺癌旁及癌組織和細胞株中的表達情況 IHC結果顯示，38例樣本中有23例癌組織、13例癌旁組織SETDB1陽性表達，15例癌組織、25例癌旁組織陰性表達（Fisher＇s檢驗，P= 0.04），見圖1。癌組織中的蛋白表達與患者的臨床病理特征關系見表1。RT-PCR檢測結果顯示，38例乳腺癌與癌旁組織的相對表達量分別為（1.20± 0.08）、（0.96±0.05）（t=2.44，P＜0.05），見圖2。以HBL-100作對照，余5種乳腺癌細胞株BT549、ZR75-30、ZR75-1、MDA-MB-453和T47D中SETDB1蛋白水平相對表達量分別為（1.30±0.20）、（2.18±0.16）、（1.83±0.06）、（2.59±0.10）和（3.77±0.25），均高于HBL-100細胞株（F=541.20，P＜0.001），其中T47D相對表達水平最高，見圖3A、3B。RT-PCR結果顯示，SETDB1的mRNA相對表達量分別是（1.21± 0.07）、（2.41±0.10）、（4.57±0.17）、（5.06±1.76）、（6.43±0.12），表達最高亦為T47D細胞株，差異具有統計學意義（F=643.30，P＜0.05），見圖3C。故在細胞功能學試驗中選取T47D細胞株。

圖1 SETDB1在癌組織、癌旁組織中表達情況 SP×400

表1 SETDB1蛋白在乳腺癌組織中表達與患者臨床病理學特征［n（%）］

圖2 SETDB1在38例配對組織中mRNA水平表達情況

2.2 在T47D細胞中沉默SETDB1基因后其表達情況 利用慢病毒轉染RNAi技術篩選出沉默SETDB1基因的克隆細胞株，以GFP株為對照組，在蛋白水平，sh1、sh2、sh3、sh4的相對表達量依次是（0.48±0.03）、（0.36±0.03）、（0.54±0.05）、（0.22±0.03），相對表達水平亦降低（F=181.50，P＜0.05），見圖4A、4B；在mRNA水平，4個沉默克隆組sh1、sh2、sh3、sh4相對表達水平均明顯降低，表達量依次為（0.28±0.01）、（0.39±0.05）、（0.39± 0.01）、（0.34±0.02），差異具有統計學意義（F= 56.70，P＜0.05），見圖4C；故綜合選擇克隆株sh2、sh4做下游細胞功能學實驗。

圖3 乳腺細胞株中SETDB1蛋白水平相對表達量

2.3 SETBD1在乳腺癌細胞中表達定位 T47D細胞IF實驗可明顯觀察到SETDB1的表達在細胞核及細胞質中均有表達，但以細胞核表達（天青色）為主，見圖5。

2.4 沉默SETBD1對乳腺癌細胞增殖能力的影響

利用CCK-8、軟瓊脂克隆形成及細胞周期實驗檢測沉默SETDB1對細胞增殖的影響。CCK-8實驗結果顯示在細胞對數生長期的增殖活性GFP株明顯高于sh2株和sh4株，以GFP株作對照，在第5、7、

9、11天即細胞對數生長期時，sh2株和sh4株的增殖活力明顯降低（P＜0.05）。見圖6。軟瓊脂克隆形成結果顯示，GFP、sh2、sh4株形成克隆數目分別是（70.00±2.00）、（42.67±1.53）和（13.33± 1.53）（F=834.00，P＜0.001），即沉默SETDB1可抑制癌細胞株的群體依賴性和惡性增殖，見圖7。流式檢測細胞周期顯示sh2株出現了G0/G1期阻滯（t=14.39，P＜0.01），而sh4株出現了G2/M期阻滯（t=6.95，P＜0.01），見圖8。

圖4 沉默SETDB1基因后其表達情況

圖5 SETDB1在T47D細胞中的免疫熒光表達定位情況 SP×400

圖6 CCK-8法檢測克隆細胞株的增殖活力情況

2.5 沉默SETBD1對乳腺癌細胞干細胞形成能力的影響 利用干細胞培養基培養GFP、sh2和sh4克隆細胞株，3者的微球體形成率分別為（4.50± 0.07）%、（2.61±0.05）%和（1.66±0.07）%（F= 493.50，P＜0.001），即沉默SETDB1后癌細胞株的干細胞活性和自我更新能力降低，見圖9。

2.6 沉默SETBD1對乳腺癌細胞株遷移能力的影響 用熒光倒置顯微鏡可觀察Corning FlouroBlok Transwell小室中穿膜的細胞數，GFP、sh2和sh4克隆細胞株在遷移48 h后，3者的穿膜個數分別是（54.25±1.71）、（16.50±1.29）、（9.00±0.82）個（F=1 344.00，P＜0.001），見圖10。

3 討論

圖7 軟瓊脂克隆形成實驗檢測克隆細胞株的增殖情況

圖8 流式細胞術檢測克隆細胞株的細胞周期情況

圖9 克隆細胞株干細胞形成能力情況 SP×200

圖10 克隆細胞株遷移48 h情況 SP×100

Ryu et al［10］首次報道了在人類“亨廷頓舞蹈癥”（Huntington's disease，HD）患者和R6/2轉基因HD小鼠模型中SETDB1的異常表達，發現SP1和SP3可作為SETDB1啟動子轉錄激活神經元，而光神霉素和烏洛托品聯合藥物治療可下調SETDB1表達；癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫亦顯示SETDB1是腫瘤高表達基因中排名最靠前基因之一［11］。本研究顯示SETDB1在乳腺癌組織及細胞株中高表達，IF實驗亦表明SETDB1細胞核、質均有表達，但以細胞核表達為主，臨床病理相關性分析表明，SETDB1陽性表達與患者年齡、分化程度、淋巴結轉移情況及病理指標PR、C-erbB-2間差異無統計學意義，但與ER卻存在相關性。

在人類肝細胞癌（HCC）細胞株中沉默SETDB1能抑制其增殖、遷移和侵襲能力，臨床病理相關性分析表明HCC的不同器官轉移灶中SETDB1亦高表達且高表達的患者預后療效差［8］；在肺癌組織及細胞系中SETDB1表達水平增高，沉默該基因則可抑制癌細胞增殖并促進癌細胞凋亡，通過體內實驗證實沉默SETDB1后小鼠的成瘤能力減弱［5］；本研究亦從細胞功能學方面證實在乳腺細胞株中沉默SETDB1可使癌細胞的增殖、克隆形成、遷移能力顯著降低，在細胞周期中沉默SETDB1后前列腺癌細胞株出現G0/G1期阻滯［7］，而在本實驗中sh2克隆株出現G0/G1期阻滯，sh4克隆株卻出現G2/M期阻滯，該現象可能是因為不同的克隆細胞株所使用的shRNA干擾序列不同所導致的。通過實驗顯示沉默SETDB1后，細胞株形成干細胞的能力顯著下降，自我更新能力降低，研究［12-13］顯示，SETDB1可維持小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）的自我更新能力，下調SETDB1將會導致ESCs標記OCT4表達降低，而滋養外胚層細胞（trophectoderm，TE）標記如Cdx2和Tcfap2a表達升高，從而加速ESCs向TE分化；且有助于調控ESCs發育過程中的整體H3K9me3甲基化水平，亦參與調控沉默逆轉錄酶病毒（transcription of endogenous retroviruses， ERVs），特別是ERV-I和II類。SETDB1在人類干細胞形成過程中存在怎樣的功能，仍需進一步探索。

本研究推測SETDB1在乳腺癌中扮演癌基因角色，其過表達可能促使乳腺癌的發生發展。研究［8］顯示，SETDB1在肝細胞癌中常染色體1q21區域基因擴增，調控多個下游靶基因如IGFBP3、CXCL3和NOS3等，SP1轉錄因子在轉錄水平上可促進SETDB1活性，轉錄后水平上miR-29與SETDB1負相關；經致癌藥物光神霉素治療亦可有效抑制癌細胞中SETDB1的表達水平，基因芯片及qCHIP結果顯示在肺癌中可能調控的下游靶基因是ADRB2、ANXA3、DNER、GPR64、NAV3、SGK1及TFAPIA等［5］；染色質修飾抗癌藥物DZNep（3-Deazaneplanocin A）在轉錄水平上也可以調控SETDB1啟動子活性使其表達降低從而誘導肺癌細胞株凋亡［14］；SETDB1調控的靶基因參與多種腫瘤相關的調控通路，包括鈣黏蛋白介導的細胞黏附及Wnt信號通路［15］。所以SETDB1參與癌癥的發生和進展過程，且具有細胞來源或腫瘤類型的特異性，SETDB1在乳腺癌中的下游調控靶基因以及參與的調控通路還未知，需要進一步探索。

近年來，腫瘤的靶向治療成為人們研究的熱點與難點，而本研究結果將對乳腺癌的靶向治療提供新的分子生物學依據，且對下一步實驗通過基因芯片技術探索其下游靶基因及尋找確切的調控通路奠定堅實基礎。

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SETDB1 expression in breast cancer and the effect on the proliferation and migration ability of cancer cells

Wang Xiaoli1，Xu Deying1，Liu Gang2，et al
（1Clinical Laboratory，2Cancer Epigenetics Laboratory，First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003）

Objective To study the histone methyltransferase SETDB1 expression in breast cancer and the proliferation and migration ability of breast cancer cells.Methods The SETDB1 expression on 38 cases of breast cancer tissues，cancer adjacent tissues and breast cancer cells were detected by RT-PCR，Western blot and IHC.The knockdown SETDB1 gene cell clones were screened out with stable transfection method，and the knockdown SETDB1 tumor cells proliferation ability was detected by CCK-8，clone forming and flow cytometry assay.The migration ability changes were detected by transwell assay.Results In 38 cases，23 cases of carcinoma tissues and 13 cases of tissue adjacent to carcinoma were positively expressed（P＜0.05），and the mRNA relative expression levels of SETDB1 were（1.20±0.08），（0.96±0.05）（t=2.44，P＜0.05）.The formed clone numbers in GFP，sh2，sh4 were（70.00±2.00），（42.67±1.53），（13.33±1.53）（F=834.0，P＜0.001）.sh2 blocked cell cycle in G0/G1phase，while sh4 was arrested in G2/M phase.The numbers of migration respectively were（54.25± 1.71），（16.50±1.29），（9.00±0.82）（F=1 344.00，P＜0.001）.Conclusion SETDB1 is frequently overexpressed in breast cancer.Knockdown SETDB1 can inhibit the proliferation and migration capacity of cancer cell，which indicates that SETDB1 is a new target for diagnosis and treatment of breast cancer.

breast cancer；SETDB1；knockdown gene；cell proliferation；cell migration

R 73-37

A

1000-1492（2016）08-1081-07

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.004.html

2016-04-19 接收

國家自然科學基金聯合項目（編號：U1204821）；國家自然科學基金面上項目（編號：81572794）

河南科技大學臨床醫學院、河南科技大學第一附屬醫院1檢驗科、2腫瘤表觀遺傳實驗室，洛陽 471003

王小利，女，碩士研究生；

劉 剛，男，教授，責任作者，E-mail：liugang72@163.com；常永超，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：ychchang123@163.com

采用RT-PCR、Western blot和IHC方法檢測38例乳腺癌與癌旁組織及癌細胞株中SETDB1的表達水平；采用穩定轉染方法篩選出沉默SETDB1基因的克隆細胞株，采用CCK-8、軟瓊脂克隆形成及流式細胞術檢測沉默SETDB1后對腫瘤細胞增殖能力的影響；采用Transwell方法檢測沉默后對腫瘤細胞遷移能力的影響。結果 38例乳腺癌與癌旁組織中23例癌組織、13例癌旁組織陽性表達（P＜0.05），SETDB1的mRNA水平相對表達量分別為（1.20±0.08）、（0.96± 0.05）（t=2.44，P＜0.05）；沉默T47D中SETDB1基因后，GFP、sh2、sh4株形成克隆個數分別是（70.00±2.00）、（42.67±1.53）和（13.33±1.53）個（F=834.00，P＜0.001）；細胞周期中sh2株出現了G0/G1期阻滯，而sh4株出現了G2/M期阻滯（P＜0.01）；48 h穿膜個數分別是（54.25±1.71）、（16.50±1.29）、（9.00±0.82）個（F=1 344.00，P＜0.001）。結論 SETDB1在乳腺癌中高表達，沉默該基因可影響癌細胞株的增殖和遷移能力，有望作為乳腺癌診斷及治療的新靶點。