T細胞因子4在胃癌細胞增殖凋亡中的作用研究

林明政，沈國棟，沈 干，徐佳慧，程 民，徐婷娟，胡世蓮

T細胞因子4在胃癌細胞增殖凋亡中的作用研究

林明政1，沈國棟2，沈 干2，徐佳慧2，程 民2，徐婷娟2，胡世蓮2

目的 研究T細胞因子4（TCF4）在胃癌細胞中的表達以及對胃癌細胞增殖及衰老、凋亡中的作用。方法 培養人胃癌細胞株MGC803、SGC7901、HSC44-PE、44As3、MKN45、NCI-N87以及人永生化胃黏膜上皮細胞株GES-1，使用Western blot法比較TCF4在各細胞之間的表達差異。選擇其中TCF4表達高與低的細胞株，分別通過穩定轉染TCF4表達質粒及dominant negative TCF4（dnTCF4）的方法上調與下調細胞TCF4表達，采用體外細胞增殖實驗及實時無標記細胞檢測分析（RTCA）等技術檢測TCF4對胃癌細胞增殖與凋亡的影響。建立胃癌細胞裸鼠移植瘤模型，觀察TCF4蛋白對胃癌移植瘤生長的影響。結果 TCF4在胃癌細胞中的表達高于對照GES-1細胞。胃癌細胞株按TCF4的表達量從高到低排列依次為NCI-N87、44As3、HSC44-PE、MGC803、MKN45、SGC7901。TCF4的表達與胃癌細胞的增殖能力呈正相關性，而與胃癌細胞的衰老、凋亡呈負相關性。結論 TCF4在胃癌細胞中呈高表達，其能促進胃癌細胞的增殖、抑制胃癌細胞的衰老及凋亡。

胃癌；TCF4；增殖；凋亡

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發生率和死亡率分別位居第二位和第三位［1-2］。Wnt信號通路是調控動物胚胎發育、細胞生長增殖的重要信號通路。既往研究［3-4］顯示，Wnt信號通路的異常激活與腸癌等多種腫瘤的發生密切相關，但其在胃癌發生、發展中的作用仍不清楚。T細胞因子4（T cell factor 4，TCF4）是TCF家族的一員，其基因是TCF7L2（transcription factor 7-like 2），是Wnt信號通路中重要的信號分子［5-6］。該研究以TCF4為研究對象，探索其在胃癌細胞中的表達以及在增殖與衰老、凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人永生化胃黏膜上皮細胞株GES-1、人胃腺癌細胞株MGC803、SGC7901、MKN45購自中科院上海細胞生物學研究所；人胃腺癌細胞NCI-N87購自中國醫學科學院北京腫瘤細胞研究所；人胃癌細胞株44As3及HSC44-PE由日本名古屋大學武井佳史教授贈送。

1.1.2 質粒及菌株 pspax2、pMD2G質粒、DH-5α感受態E.coli由中國科技大學鐘永軍博士贈送；表達EF1alpha-dnhTcf4/SV40-PuroR質粒的EdTP菌種購自美國Addgene公司；TCF4全長序列表達質粒購自美國Origene公司。

1.1.3 實驗動物 裸鼠（BALB/c-nu）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF級，22只，雌性，6～8周齡，飼養于安徽醫科大學附屬省立醫院SPF級動物房中。

1.1.4 主要試劑 RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）購自美國HyClone公司；胰酶消化液、RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自上海碧云天公司；蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑購自瑞士Roche公司；DMEM培養基、BCA試劑盒、化學發光顯影液購自美國Thermo公司；β-actin、TCF4兔抗人單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司；Axyprep質粒DNA小量試劑盒購自美國Axygen公司；轉染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 以上細胞解凍復蘇后，培養于含10%FBS的RPMI 1640培養基中，置于37℃、5% CO2細胞培養箱內培養。

1.2.2 Western blot法檢測 提取正常生長的GES-1、MGC803、SGC7901、NCI-N87、44As3、MKN45及HSC44-PE細胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度并用PBS調平，加入蛋白上樣緩沖液煮沸5 min，經SDS-PAGE電泳分離后半干轉至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫條件下封閉1 h。一抗以兔抗人β-actin為內參，兔抗人TCF4為目的蛋白，4℃孵育過夜。以HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，使用化學發光凝膠成像系統成像檢測各組細胞TCF4的差異表達。

1.2.3 質粒的擴增及提取 將待擴增的pspax2、pMD2G質粒分別轉入DH-5α感受態E.coli中，按照質粒使用說明使用含有適量Ampicillin的LB固體培養基篩選菌株，在LB固體培養基中挑取單克隆菌落接種到LB液體培養基中，置于氣浴搖床中37℃、200 r/min搖菌12～18 h。質粒的提取步驟如下：取10 ml轉入質粒的菌液加入離心管中，10 000 r/min離心1 min，棄上清液；加入500 μl Buffer S1重懸細菌，再加入500 μl Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉4～6次，使菌體充分裂解，室溫放置5 min，直至溶液變得透亮黏稠；加入700 μl Buffer S3，上下翻轉6～8次見形成白色絮狀沉淀，10 000 r/ min離心10 min，吸取上清液加入到制備管中并將制備管置于收集管中，10 000 r/min離心1 min，棄濾液；將制備管放回收集管中，加入500 μl Buffer W1，10 000 r/min離心1 min，棄濾液；將制備管放回收集管中，加入700 μl Buffer W2，10 000 r/min離心1 min，棄濾液，重復上一步驟1次；將制備管放回收集管中，10 000 r/min離心1 min，取出制備管置于超凈臺中室溫干燥30 min后，移入新的1.5 ml EP管中，加入60～80 μl Eluent或去離子水，室溫靜置1 min，10 000 r/min離心1 min收集擴增的質粒；分光光度計測定質粒濃度。

1.2.4 慢病毒包裝及感染 包裝慢病毒前1 d，在3.5 cm培養皿中接種適量密度的293T細胞，每個樣品需要1×106個293T細胞。包裝步驟如下：取1.5 ml滅菌EP管，加入2 μg EdTP、3 μg pspax2、1 μg pPD2G質粒以及250 μl的無血清培養基，輕柔混勻，室溫孵育5 min；取1.5 ml滅菌EP管，取9 μl脂質體LP2000溶于250 μl無血清培養基中，輕柔混勻，室溫孵育5 min；將DNA溶液和脂質體溶液輕柔混勻，室溫孵育20 min；用胰酶消化并記數293T細胞并用含血清的培養基重懸細胞；在6孔板中每孔加入1 ml含血清的生長培養基，再加入DNA-脂質體復合物；將1 ml重懸的293T細胞（1×106個細胞/ml）加入到平板中，37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育過夜；移除含有DNA-脂質體復合物的培養基，代之以DMEM培養基；轉染后48～72 h取上清液，3 000 r/min離心20 min，取上清液即為病毒懸液。感染24 h前，分別在3.5 cm培養皿中接種適量密度的44As3、NCI-N87細胞（約2×105/ml），待細胞生長面積達50%～80%時即可用于慢病毒感染。取2 ml新鮮培養基替換原培養基，加入適量的慢病毒懸液，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h；更換新鮮培養基繼續培養48～72 h后，加入purocymin進行篩選獲得konck-down TCF4的44As3/dnTCF4、N87/dnTCF4細胞。

1.2.5 質粒轉染 轉染24 h前，在3.5 cm培養皿中接種適量密度的SGC7901細胞（約2×105/ml），待細胞生長面積達50%～80%時即可用于轉染。配制溶液1：240 μl無血清培養基+10 μl LP2000，室溫孵育5 min；溶液2：250 μl無血清培養基+2 μg TCF4表達質粒，室溫孵育5 min；將溶液1與溶液2混合，室溫下放置20 min；將6孔板中的細胞用無血清培養基沖洗細胞2遍后，加入2 ml無血清培養基；將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養板，輕輕混勻；置于在37℃、5%CO2細胞培養箱中保溫4～6 h；更換含有血清的全培養基，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，按照1∶10接種到新的培養皿中繼續培養，根據質粒使用說明書加入適量purocymin進行篩選獲得knock-in TCF4的SGC/TCF4細胞。

1.2.6 細胞增殖實驗 取對數期生長的SGC7901、SGC/TCF4、NCI-N87以及N87/dnTCF4細胞株，PBS清洗2遍，胰酶消化，細胞計數，按每個3.5 cm培養皿接種105個細胞，重復3次，分別在24、48、72 h時觀察細胞生長狀態并消化、計數，比較SGC/TCF4與對照SGC7901細胞，NCI-N87與對照N87/dnTCF4細胞的增殖能力。

1.2.7 實時無標記細胞檢測技術（RTCA） RTCA是基于微電子傳感技術，通過實時監測阻抗的變化來進行細胞增殖、轉移、耐藥等實時細胞分析［7］。在配套的E16孔板中每孔接種2×104個細胞，觀察、比較SGC7901與SGC/TCF4以及NCI-N87與N87/dnTCF4的增殖情況。

1.2.8 細胞衰老檢測 取對數期生長的SGC7901、SGC/TCF4、NCI-N87以及N87/dnTCF4細胞株，PBS清洗2遍，胰酶消化，細胞計數，按每個3.5 cm培養皿接種5×103個細胞，48 h后參考文獻［8］使用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒染色，選擇3個不同視野統計陽性細胞。

1.2.9 裸鼠成瘤實驗 裸鼠經適應性飼養1周后進行試驗。取預先培養呈對數期生長的胃癌細胞消化，1 000 r/min離心，PBS重懸使細胞密度達到1× 107/ml，裸鼠脅部皮下接種0.1 ml，每種胃癌細胞接種6只裸鼠，待細胞成瘤后用游標卡尺每周測量2次腫瘤體積，比較上調TCF4表達的SGC/TCF4與對照組SGC7901、下調TCF4表達的44As3/dnTCF4與對照組44As3的腫瘤生長情況。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，多組樣本均數的比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Games-Howell檢驗。

2 結果

2.1 TCF4在胃癌細胞中表達 TCF4在胃癌細胞中的表達要高于對照GES-1細胞，胃癌細胞按TCF4表達量從高到低表達排列依次為NCI-N87、44As3、HSC44-PE、MGC803、MKN45、SGC7901（圖1A）。

2.2 TCF4促進胃癌細胞增殖 通過質粒轉染等手段，建立knock-in TCF4的SGC/TCF4及knockdown TCF4的N87/dnTCF4細胞系，Western blot法證實TCF4在SGC/TCF4表達升高、在N87/dn TCF4表達降低（圖1B、1C）。細胞增殖實驗結果顯示TCF4調高組細胞SGC/TCF4相較于SGC7901細胞，其增殖能力明顯提高（圖2A），而TCF4調低組細胞N87/dnTCF4相較于NCI-N87細胞，其增殖能力明顯降低（圖2B）；這一結果也在RTCA實驗中得到進一步證實（圖2C、2D）。

圖1 TCF4在胃癌細胞中表達

圖2 TCF4促進細胞增殖

2.3 TCF4抑制胃癌細胞衰老與凋亡 細胞培養過程顯示，相較于NCI-N87細胞，N87/dnTCF4細胞出現更多的凋亡細胞；而在SGC7901與SGC/TCF4對照中，SGC/TCF4細胞出現更多的多偽足狀細胞，提示其有更高的活力及遷移能力（圖3）。為了證實TCF4是否能抑制胃癌細胞的衰老和凋亡，選用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒進行染色，結果提示N87/dnTCF4細胞染色陽性率明顯高于NCI-N87細胞，SGC/TCF4細胞染色陽性率明顯低于SGC7901細胞（P＜0.05）（圖4）。

2.4 TCF4促進胃癌裸鼠移植瘤生長 按照實驗方法1.2.9建立裸鼠移植瘤模型，10 d后結果顯示所有接種點均成瘤，生長14 d腫瘤體積測量結果顯SGC/TCF4細胞移植瘤體積顯著大于對照SGC7901移植瘤，而44As3/dnTCF4移植瘤體積顯著小于44As3移植瘤（圖5），從而證明TCF4能促進胃癌細胞裸鼠移植瘤的生長。

圖3 胃癌細胞在含20%FBS的培養基中培養10 d后細胞形態學改變 ×100

圖4 衰老細胞β-半乳糖苷酶染色 ×200

3 討論

圖5 胃癌細胞裸鼠移植瘤14 d生長情況

胃癌是嚴重危害人類身心健康的惡性腫瘤，然而由于其早期臨床癥狀表現不明顯，且缺乏特異有效的生物標志物，目前僅有少數患者能得到早期診斷及治療［9-10］。因此，深入研究胃癌的發生、發展機制，對胃癌的早期診斷及治療具有重要意義。Wnt信號通路是一條在進化上高度保守的信號通路，其活性受多種蛋白調節，而其中TCF4蛋白是Wnt信號通路的關鍵調節因素之一，表現為當Wnt蛋白與細胞膜表面的Frizzled家族跨膜蛋白（FZ）受體以及低密度脂蛋白受體相關蛋白結合時，可引起β-catenin在細胞質內大量聚集并進入細胞核，入核的β-catenin與TCF4結合形成β-catenin-TCF4復合物，激活Wnt信號通路下游諸如原癌基因c-Myc、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）等在內的一系列靶基因［3，5-6］。既往的研究已經證實Wnt信號通路的異常激活與腸癌等多種腫瘤的發生密切相關，而這其中TCF4的異常表達在這一過程中發揮著重要作用，Chen et al［11］報道TCF4能直接與LIN28B基因的內含子結合并促進LIN28B基因的表達，增強人乳腺癌、肺癌細胞的干細胞潛能，促進人乳腺癌、肺癌的生長與轉移；研究［12］表明分化誘導因子-1能通過降低TCF4表達抑制人乳腺癌與宮頸癌裸鼠移植瘤的生長。

本實驗以Wnt信號通路的關鍵蛋白TCF4為研究對象，結果顯示TCF4在胃癌細胞中的表達量明顯高于胃黏膜上皮細胞，這與課題組在臨床標本中的檢測結果一致。選取TCF4表達最高NCI-N87、44As3細胞及表達最低的SGC7901細胞，通過慢病毒包裝及質粒轉染手段分別獲得TCF4調高組細胞SGC/TCF4及調低組細胞N87/dnTCF4、44As3/ dnTCF4，體外細胞增殖實驗及RTCA實驗結果顯示SGC/TCF4細胞增殖能力明顯高于SGC7901細胞，N87/dnTCF4細胞增殖能力明顯低于N87細胞，差異有統計學意義；鏡下形態學觀察及細胞衰老染色顯示N87/dnTCF4細胞染色陽性率高于NCI-N87細胞，SGC/TCF4細胞染色陽性率明顯低于SGC7901細胞；之后通過建立裸鼠荷瘤模型，觀察比較胃癌細胞在體內生長情況，14 d結果顯示SGC/TCF4組腫瘤體積明顯大于SGC7901組，44As3/dnTCF4組腫瘤體積明顯小于44As3組。

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Effects of T cell factor 4（TCF4）on the proliferation and apoptosis in gastric cancer cells

Lin Mingzheng1，Shen Guodong2，Shen Gan2，et al
（1Dept of Geriatrics，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，
2Anhui Provincial Key Laboratory of Tumor Immunotherapy and Nutrition Therapy，Hefei 230001）

Objective To research the expression of T cell factor 4（TCF4）and the function of proliferation，senescence and apoptosis in gastric cancer cells.Methods Human gastric cancer cell lines MGC803，SGC7901，HSC44-PE，44As3，MKN45，NCI-N87 and immortalized human gastric epithelial cell line GES-1 were cultured and the differential expressions of TCF4 among them were detected by Western blot analysis，then TCF4 expression and dominant negative TCF4 plasmid were transfected into the lowest and highest one respectively.The influence of TCF4 in vitro cells was tested by cell proliferation assay and RTCA.Meanwhile，the model of nude mice bearing tumor was established to detect the effect in vivo.Results The expression of TCF4 in gastric cancer cells was higher than the control GES-1，the highest one was NCI-N87，followed by 44As3，HSC44-PE，MGC803，MKN45 and SGC7901.TCF4 was positively correlated with proliferation，and negatively associated with senescence，apoptosis in gastric cancer cells.Conclusion TCF4 is overexpressed in gastric cancer cells.It could promote the proliferation，inhibit the senescence and apoptosis of gastric cancer cells.

gastric cancer；TCF4；proliferation；apoptosis

R 730.2；R 735.2

A

1000-1492（2016）08-1092-05

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.008.html

2016-04-15 接收

國家自然科學基金（編號：81071808）；安徽省自然科學基金（編號：1408085MH167）；安徽省科技計劃項目（編號：1301042094）

1安徽醫科大學附屬省立醫院老年病科，老年醫學研究所，合肥 230001

2腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室，合肥 230001作者簡介：林明政，男，碩士研究生；

胡世蓮，女，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：hushilian @126.com