三叉神經痛模型大鼠三叉神經節神經元中NPR-A表達量的變化

韓 良，崔曼曼，徐文華，劉悅雁，王烈成，王元銀

三叉神經痛模型大鼠三叉神經節神經元中NPR-A表達量的變化

韓 良1，崔曼曼1，徐文華1，劉悅雁2，王烈成3，王元銀1

目的 檢測三叉神經痛（TN）模型大鼠的三叉神經節（TG）神經元中NPR-A受體mRNA表達量的變化。方法

三叉神經節；慢性壓迫性損傷；三叉神經痛

三叉神經痛（trigeminal neuralgia，TN）是一種神經病理性疼痛，累及三叉神經一支或幾支，其分布區域內出現陣發性、電擊樣劇烈疼痛，持續數秒鐘至數分鐘，疼痛具有周期性，間歇期無癥狀［1］。近年來已經建立多種較為成熟的TN動物模型，如光化學損傷誘導TN動物模型［2］、眶下神經縮窄TN動物模型［3］以及本課題組前期建立的經眶下孔注射相關炎癥因子制造大鼠TN模型［4］。利鈉肽（natriuretic peptides，NPs）是一種神經肽，包括心房利鈉肽、腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、C型利鈉肽、D型利鈉肽和V型利鈉肽。BNP在與其受體NPR-A結合后，通過第二信使cGMP在體內發揮相應的生理學功能。該研究將建立兩種不同的TN模型，即眶下神經縮窄模型和經眶下孔注射腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）模型，觀察其行為學改變及TG神經元中NPR-A的mRNA的動態變化，以探討NPR-A在兩種不同造模方式下三叉神經元內的變化規律，為TN新的治療途徑提供生理學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠，普通級，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，180～200 g，分籠常規飼養、自由飲水，在標準環境下飼養（相對濕度：約50%，溫度：20～25℃，12 h明/12 h暗）。實驗開始前1周，對實驗大鼠進行適應性刺激（用Von-Frey hairs疼痛測試棒刺激大鼠雙側三叉神經分布區域內的顏面部觸須墊），每日連續刺激5次，間歇不少于30 s，雙側交替進行，選用對以上刺激反應平靜且口鼻部毛發觸須完整的大鼠用于造模。

1.2 實驗分組及造模方法 將符合實驗標準的大鼠隨機分為6組，即對照組1（假手術組）、眶下神經慢性縮窄1周組、眶下神經慢性縮窄2周組、對照組2（生理鹽水注射組）、TNF-α 1周組、TNF-α 2周組。每組5只。配置10%水合氯醛，將各組大鼠稱重后，按0.35 ml/100 g的標準腹腔注射，待麻醉顯效后，縮窄模型組大鼠沿大鼠手術側（左頰部）顴骨下緣距鼻背部約0.5 cm，做長度為0.5～1 cm切口，鈍性分離肌肉，顯露眶下神經。從近端向遠端分離約4～5 mm的長度。生物解剖鏡下將兩根鉻線（4-0）力度適中的結扎眶下神經，間距約2～3 mm。壓迫標準：在鏡下可見眶下神經直徑稍微變細，但是神經傳導不能完全被阻斷，且其外膜的血液循環暢通。假手術組除不結扎眶下神經外，其余手術方法均與ION-CCI模型組相同。TNF-α組大鼠待麻醉顯效后，對注射側（左側）觸須墊常規消毒后，固定大鼠頭部，持微量注射器自左側鼻翼旁約1 cm處與皮膚呈45°向上、后進針1.5 cm，刺入眶下孔，注射5 μl用0.1%牛血清白蛋白配制的0.01 ng/μl TNF-α。生理鹽水注射組注射5 μl 0.9%Nacl。操作均在無菌條件下進行。

1.3 模型的驗證 眶下神經支配區機械痛閾測定參照Christensen［5］、Vos et al［6］的標準，在安靜的實驗環境下，將大鼠置于鼠籠10 min后，持VonFrey hairs疼痛測試棒緩慢靠近大鼠，刺激大鼠手術側觸須墊，在刺激過程中測試棒強度需由小到大緩慢增加，每個強度分別刺激10次，2次刺激應至少間隔30 s。大鼠的陽性反應包括：①攻擊行為，表現出大鼠迅速抓咬刺激物；②縮頭反應，表現出頭部迅速后縮；③連續搔抓面部受刺激區域的行為，一般情況下均伴隨后退動作。刺激實驗陽性標準：出現以上3種反應中任意1項或1項以上。使大鼠產生陽性反應的最小刺激強度值即為手術側觸須墊機械痛閾值。

1.4 Q-PCR法檢測NPR-A的mRNA含量 大鼠斷頭處死后，快速取出左側三叉神經節（trigeminal Ganglion，TG），用TRizol提取液提取組織總RNA，然后用NanoDrop ND-3000（美國NanoDrop公司）定量RNA樣品。通過PrimeScriptTMRT試劑盒進行逆轉錄。使用sybrgreen takara PCR試劑盒進行PCR的擴增，總反應體系20 μl。所涉及的引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行分析，兩組數據間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗側觸須墊機械痛閾的變化 ION-CCI組大鼠術后1周，面部觸須墊機械痛域明顯下降［從（16.66±1.59）g下降到（7.90±1.34）g］，術后第2周時痛域降至最低（4.22±1.06）g，這種效應至少持續至術后第8周（9.17±1.66）g，與假手術組比較差異均有統計學意義（n=5，F=74.32、282.59，P＜0.01）（圖1A、表2）。TNF-α組大鼠注射后1周即出現面部機械痛域降低［從（16.65±1.69）g下降至（5.86±1.23）g］，術后第2周下降至最低（3.66±1.26）g，與生理鹽水注射組比較差異有統計學意義（n=5，F=103.04、123.16，P＜0.01）（圖1B、表3）。TNF-α組大鼠后期機械痛域逐漸上升，至第8周（14.61±1.85）g基本恢復到術前水平（圖1B）。而兩組對照組大鼠術前術后的疼痛閾值沒有顯著性改變（圖1）。

圖1 ION-CCI組和TNF-α組觸須墊機械痛域的變化

2.2 NPR-A的mRNA在TG的表達 與相應對照組比較，ION-CCI組和TNF-α組在術后1周NPRA mRNA的表達皆有所升高，其中TNF-α組差異有統計學意義（n=4，F=4.99、30.30，P＜0.05）。術后第2周，ION-CCI組和TNF-α組的NPR-A mRNA含量均進一步升高，與相應對照組比較差異具有統計學意義（n=4，F=16.10、109.43，P＜0.01）。見圖2。

表2 假手術組和ION-CCI組觸須墊機械痛域的統計結果（±s）

表2 假手術組和ION-CCI組觸須墊機械痛域的統計結果（±s）

與同時間點假手術組比較，**P＜0.01

項目假手術組ION-CCI組F值注射前16.46±1.4016.66±1.590.04注射后1周14.17±0.927.90±1.34**74.32注射后2周14.25±0.814.22±1.06**282.59注射后3周15.45±1.744.63±1.42**116.53注射后4周16.35±2.284.97±1.37**91.38注射后5周15.42±1.826.78±1.61**63.21注射后6周14.76±1.387.53±1.50**62.64注射后7周15.70±1.668.31±1.58**51.99注射后8周14.88±1.459.17±1.66**33.76

表3 對照組2和TNF-α組觸須墊機械痛域的統計結果（±s）

表3 對照組2和TNF-α組觸須墊機械痛域的統計結果（±s）

與同時間點生理鹽水注射組比較：**P＜0.01

項目生理鹽水注射組TNF-α組F值注射前16.26±2.5816.65±1.69 8.34注射后1周15.41±1.705.86±1.23**103.04注射后2周14.83±1.863.66±1.26**123.16注射后3周14.99±1.464.19±1.13**171.26注射后4周15.03±1.825.78±1.73**67.91注射后5周15.57±0.797.99±1.13**151.55注射后6周15.08±1.0511.02±1.24**31.14注射后7周14.97±1.4112.27±1.578.14注射后8周15.31±1.1414.61±1.850.51

圖2 ION-CCI組和TNF-α組NPR-A的mRNA表達含量變化趨勢

3 討論

本實驗中ION-CCI模型和經眶下孔注射TNF-α模型大鼠，在術后第1周出現面部眶下神經支配區域機械痛域顯著降低，到約第2周到達痛域的最低值，至少可以維持至術后第6周。對照組術后相同區域機械痛域無顯著性改變，與前期文獻［4，7］報道相一致。

現已發現神經節中存在多種神經肽及其受體。CGRP在TG中直徑較小的細胞中表達，受到刺激后可有C纖維和A纖維釋放［8］。生長抑制素及其受體在TG有表達，可抑制較小直徑的TG神經元的興奮性［9］。這些神經肽及其受體的含量在外周神經受損或炎癥時有較大的改變。這種改變暗示著神經肽及其受體可能在TN的痛覺傳遞和調節中有潛在的作用。BNP最初是從豬腦組織中分離出來，其合成和分泌主要是在心房和心室內，而且心房中BNP量是心室中BNP量的50～100倍［10］。至目前為止，在哺乳動物體內發現三種利鈉肽受體（natriuretic peptide receptor，NPR），即NPR-A、NPR-B、NPR-C，NPs選擇性與其相應受體結合并產生生理學效應。NPR-A基本上分布在某些大血管、腎臟、腎上腺，其是心房利鈉肽和BNP的共同受體［11］。NPR-A是一種鳥嘌呤環化酶受體，分子量120～140 ku，分為細胞外結構域、激酶同源結構域以及鳥嘌呤環化酶結構域3個結構域。BNP與其受體的細胞外結構域結合，激活細胞內鳥嘌呤環化酶，產生第二信使cGMP［12］，繼而調節cGMP依賴蛋白的活性來發揮生理學活性。這三種cGMP依賴蛋白分別是依賴于cGMP的蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinases G，PKG）、依賴于cGMP的磷酸二酯酶、環核苷酸門控離子通道。細胞外結構域可與ATP結合，使其鳥嘌呤環化酶活性增大；細胞外結構域在一定條件下可磷酸化和去磷酸化，這種結構的變化對NPR-A的生理功能調節發揮極大影響［13］。在外周神經節中，BNP在與NPR-A受體結合后，通過其受體的腺苷酸環化酶催化GTP轉化成第二信使cGMP，再通過cGMP參與PKG等不同信號通路的調節，可能會參與疼痛的發生發展，且對疼痛起調節作用。

近年來，有研究顯示BNP對痛覺具有調控作用，主要集中在背根神經節和脊髓組織；其可能機制是傷害性感覺神經元中BNP及其受體NPR-A的基因表達在外周組織炎癥作用下顯著增加，并在谷氨酸作用條件下，BNP通過增大BKca開放概率來減少傷害性感覺神經元興奮性，抑制了痛覺信息的傳入。在脊髓腔內注射BNP后，急性和慢性炎癥痛可被顯著性的抑制［14］。通過激活位于突觸前的NPR-A，由傷害性感覺傳入纖維分泌的BNP可對興奮性突觸傳遞起抑制性調節作用。在大鼠的離體TG中小神經元中也有BNP及其受體的存在，并可通過調節TRPV1和P2X3受體的活性參與疼痛的傳導［15］。本研究顯示大鼠ION-CCI模型中術后1周NPR-A的mRNA表達約為對照組的1.7倍，術后2周時NPR-A的mRNA的表達約為對照組的2.9倍。在經眶下孔注射TNF-α制造大鼠TN模型中，術后第1周NPR-A的mRNA約為對照組1.94倍，術后第2周其mRNA約為對照組的4.9倍。此結果的變化趨勢與術后大鼠機械痛域的變化趨勢相符，提示NPRA可能會參與疼痛的發生發展。

綜上所述，本實驗從兩種不同的TN模型大鼠中均可檢測到NPR-A的mRNA表達升高，提示在疼痛的發生發展過程中NPR-A可能會起調節作用。在后續研究中，將進一步觀察兩種不同模型大鼠三叉神經元中BNP和NPR-A對疼痛的具體調節機制，為深入探索TN的病因及其機制提供依據。

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Variation of NPR-A receptor expression on mouse
trigeminal ganglion neurons of trigeminal neuralgia model

Han Liang，Cui Manman，Xu Wenhua，et al
（College of Stomatology，Anhui Medical University，The Affiliated Stomatological Hospital of Anhui Medical University，Key Lab of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To investigate the expression of NPR-A receptor on mouse trigeminal ganglions of trigeminal neuralgia model.Methods Male SD rats were randomly assigned into 6 groups：control group 1（sham group），control group 2（infraorbital foramen inject normal saline group），chronic constriction injury of the infraorbital nerve guoup（ION-CCI group）1 week and 2 weeks and infraorbital foramen inject TNF-α group（TNF-α group）1 week and 2 weeks.The expressions of NPR-A mRNA were detected by Q-PCR.Results The expression of NPR-A was detected in all groups.And the expressions of NPR-A in the ION-CCI group 2 weeks and TNF-α group 1 week and 2 weeks were higher than that in the corresponding control group.Conclusion NPR-A receptor on mouse trigeminal ganglions may be involved in the trigeminal neuralgia and inflmmatory pain.

trigeminal ganglion；chronic constriction injury；trigeminal neuralgia

R 745.7

A

1000-1492（2016）08-1097-04

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.010.html

2016-04-19 接收

國家自然科學基金（編號：81271162）；安徽省高等學校省級優秀青年人才基金項目（編號：2012SQRL070）；安徽省高校省級優秀青年人才基金重點項目（編號：2013SQRL146ZD）

1安徽醫科大學口腔醫學院，安徽醫科大學附屬口腔醫院，合肥 230032

2皖西衛生職業學院生理學教研室，六安 237000

3安徽醫科大學基礎醫學院生理學教研室，合肥 230032作者簡介：韓 良，女，碩士研究生；

王元銀，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：wyy1970548@sohu.com

采用眶下神經縮窄術和經眶下孔注射腫瘤壞死因子α（TNF-α）將雄性SD大鼠隨機分成6組，即對照組1（假手術組）、對照組2（生理鹽水注射組）、眶下神經縮窄模型組（ION-CCI組）術后1周和2周以及經眶下孔注射TNF-α組（TNF-α組）注射后1周和2周。Q-PCR法檢測NPR-A受體mRNA的表達。結果 每組大鼠TG均表達NPR-A受體mRNA。其中ION-CCI組術后2周以及TNF-α組注射后1周和2周TG內NPR-A受體mRNA表達含量均顯著高于相應對照組（n=4，P＜0.05）。結論 大鼠TG表達的NPR-A受體可能與大鼠TN及炎性痛的發生和發展相關。