檸檬醛調控突變型p53基因和AIF基因表達誘導急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4凋亡

王亞萍，王 娟，吳中惠，張 慧，侯小芳，宋 琴，夏海龍

檸檬醛調控突變型p53基因和AIF基因表達誘導急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4凋亡

王亞萍1，王 娟1，吳中惠1，張 慧1，侯小芳1，宋 琴2，夏海龍1

目的 探討檸檬醛誘導急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4凋亡的分子機制。方法 用不同濃度的檸檬醛處理NB4細胞48 h，通過實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測突變型p53（mtp53）基因和凋亡誘導因子AIF基因的mRNA表達變化。結果 檸檬醛實驗組與空白對照組比較，mtp53基因表達量減低（P＜0.05）；檸檬醛實驗組與空白對照組比較，AIF基因表達量增加（P＜0.05）；乙醇對照組與空白對照組比較，mtp53和AIF的mRNA表達量無明顯差異；隨著檸檬醛濃度（5、10、20 mg/L）的遞增，mtp53 mRNA表達量逐漸下降，AIF mRNA的表達量逐漸上升，mtp53、AIF在不同濃度檸檬醛實驗組表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論

檸檬醛；白血病；急性早幼粒細胞白血病細胞株；p53；凋亡誘導因子

山蒼子油的主要成分檸檬醛，不僅可作為香料和食品添加劑，還有抗菌、抑菌、平喘等多種作用。研究［1-3］表明檸檬醛可誘導多種腫瘤細胞如A549、RAW264.7、HL-60、U937、MCF-7等的凋亡，且對人正常胸腺細胞和脾細胞無毒性作用。研究［4-5］表明檸檬醛可以通過激活內源性線粒體途徑，抑制核因子NF-κB的表達，誘導急性早幼粒細胞白血病（acutepromyelocyticleukemia，APL）細胞株NB4的凋亡，但具體機制尚不明確。該研究旨在通過研究檸檬醛誘導NB4細胞凋亡過程中突變型p53（mtp53）基因、凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）基因表達的變化，進一步探討檸檬醛誘導NB4細胞凋亡的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 胎牛血清、RPMI 1640購自美國Gibco公司；檸檬醛購自美國Sigma公司，純度＞95%，用乙醇溶解備用；TRIzol、SuperScriptⅢRT反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；引物由北京百奧思科生物醫(yī)學技術有限公司合成。目的基因及內參基因引物序列和產物長度見表1。所測引物用Primer-BLAST軟件驗證，p53 Tm 58.8℃，AIF Tm 58.0℃。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列以及產物長度

1.2 細胞來源與培養(yǎng) APL細胞株NB4細胞由天津血研所惠贈，該細胞株p53基因是突變型。NB4細胞于5%CO2、37℃、飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，2～3 d換液1次。實驗所用細胞處于對數生長期，臺盼藍染色拒染率＞95%，維持細胞濃度在（2～3）×105/ml。

1.3 實驗分組 分為檸檬醛實驗組和對照組。檸檬醛實驗組：選取處于對數生長期的NB4細胞，分別加入不同濃度的檸檬醛（5、10、20 mg/L，培養(yǎng)基乙醇終濃度5‰）培養(yǎng)。空白對照組：培養(yǎng)基中不加檸檬醛和5‰乙醇進行NB4細胞培養(yǎng)；乙醇對照組：培養(yǎng)基中不加檸檬醛，僅加乙醇至終濃度5‰進行NB4細胞培養(yǎng)。

1.4 采用qPCR法檢測mtp53及AIF的表達 收集檸檬醛處理48 h后的細胞，用RNA提取試劑盒提取總RNA，再用反轉錄試劑盒superscriptⅢ進行反轉錄反應，反應體系為dNTP 1 μl、DTT 2 μl、5× Buffer 4 μl、RT酶1 μl、RNA 200 ng，補水至10 μl，1 000 r/min離心5 min后，置于42℃水浴箱水浴60 min，85℃孵育10 min。反應結束后置于-20℃保

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行分析，數據以±s表示。單變量兩獨立樣本的比較采用t檢驗，多組樣本間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 細胞生長計數 空白對照組NB4細胞培養(yǎng)呈對數生長狀態(tài)時，調整細胞濃度均為（2～3）×105/ ml。檸檬醛實驗組分別加入不同濃度的檸檬醛（5、10、20 mg/L，培養(yǎng)基乙醇終濃度5‰），乙醇對照組加入乙醇至終濃度5‰，與空白對照組同時進行細胞培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)12、24、36、48 h時進行臺盼藍染色，計數活細胞數。乙醇對照組與空白對照組比較細胞計數差異無統(tǒng)計學意義；各實驗組與空白對照組比較，細胞計數差異有統(tǒng)計學意義（F= 21.000，P＜0.05）；不同濃度實驗組比較細胞計數差異有統(tǒng)計學意義（F=23.134，P＜0.05）。NB4細胞生長計數曲線見圖1。

圖1 細胞生長計數曲線

2.2 PCR產物的分析 擴增曲線及熔解曲線顯示，p53、AIF和內參基因GAPDH的PCR產物呈單峰。熔解溫度均一，曲線中沒有其他雜峰，擴增產物具有特異性。見圖2、3。

圖2 不同基因的擴增曲線

圖3 不同基因的熔解曲線

2.3 突變型p53（mtp53）mRNA的表達量檢測

乙醇對照組和空白對照組比較，mtp53 mRNA的表達量差異無統(tǒng)計學意義；實驗組與空白對照組比較，mtp53 mRNA的表達量差異有統(tǒng)計學意義（F= 53.46，P＜0.05）；各實驗組間隨檸檬醛濃度遞增，mtp53 mRNA的表達量遞減，差異有統(tǒng)計學意義（F =71.03，P＜0.05）。見表2、圖4。

表2 不同濃度檸檬醛作用于NB4細胞48 h后mtp53 mRNA表達量的變化（n=3）

圖4 檸檬醛對mtp53基因mRNA表達量的影響

A：空白對照組；B：乙醇對照組；C：5 mg/L實驗組；D：10 mg/L實驗組；E：20 mg/L實驗組；與空白對照組比較：*P＜0.05；與5 mg/ L實驗組比較：#P＜0.05；與10 mg/L實驗組比較：△P＜0.05

2.4 AIF mRNA的表達量檢測 乙醇對照組與空白對照組比較，AIF mRNA的表達量差異無統(tǒng)計學意義；各實驗組與空白對照組比較，AIF mRNA的表達量差異有統(tǒng)計學意義（F=50.04，P＜0.05）；各實驗組間隨檸檬醛濃度遞增，AIF mRNA的表達量遞增，差異有統(tǒng)計學意義（F=73.82，P＜0.05）。見表3、圖5。

表3 不同濃度檸檬醛作用于NB4細胞48 h后AIF mRNA表達量的變化（n=3）

圖5 檸檬醛對AIF基因mRNA表達量的影響

3 討論

APL作為急性髓系白血病的的一種特殊亞型，是高度異質性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。APL有特異性的基因異位t（15；17），形成PML-RARα融合基因［6］。維甲酸和三氧化二砷分別通過不同的途徑誘導APL細胞凋亡，使得APL患者達到緩解。維甲酸和亞砷酸治療APL取得了巨大成就，但在治療過程中出現一定的不良反應，部分病例對維甲酸、三氧化二砷耐藥［7］，研發(fā)新的治療藥物成為進一步提升APL治療效果的重要問題。

研究［8］表明檸檬醛能夠誘導APL細胞株NB4出現細胞凋亡的典型形態(tài)學改變，這種誘導作用在檸檬醛作用48 h時最強。研究［9］表明檸檬醛作用于NB4細胞后，凋亡相關基因Bcl-2的表達量明顯下降，BAX基因、Caspase蛋白的表達量明顯增加，這些結果表明檸檬醛通過線粒體凋亡相關途徑誘導NB4細胞凋亡，但更為詳盡的分子信號機制還有待進一步研究。

由于本實驗使用的檸檬醛難溶于水，需要用乙醇進行溶解，設計了空白對照組和乙醇對照組，以觀察5‰乙醇對正常NB4細胞生長及突變型p53基因、AIF基因表達的影響。結果表明，5‰乙醇對NB4細胞生長、突變型p53基因及AIF基因的表達無明顯影響。

本研究表明檸檬醛作用NB4細胞48 h，突變型p53基因mRNA表達量均降低。p53基因可以通過抑制有絲分裂的進程，阻止細胞進入DNA合成期，參與DNA損傷修復或者啟動細胞的凋亡，防止細胞向惡性轉化；p53基因的突變會導致其正常生物學功能喪失，促進細胞的惡性轉化和增殖，抑制細胞凋亡。研究［10］表明惡性腫瘤中，p53基因的突變占50%，細胞系中血液系統(tǒng)腫瘤p53突變率最高，約占17%。本實驗細胞株具有典型t（15；17）異位，細胞株中的p53基因屬于突變型［11］。野生型p53基因作為BAX/BAK的上游調控基因，可以通過下調BCl-2的表達，改變BCL-2/BCl-xL比例，形成BAX蛋白的寡聚化，上調BAX的表達，改變線粒體通透性誘導細胞凋亡［12-14］。突變型p53基因作用則與之相反，本研究顯示NB4細胞中突變型p53基因表達較高，隨著檸檬醛濃度的遞增，突變型p53基因的表達量呈下降的趨勢，提示檸檬醛可能通過下調突變型p53基因的表達，調控與之相關的下游調控因子，改變線粒體通透性，誘導細胞凋亡。

AIF位于染色體Xq25-26，由16個外顯子組成，其編碼可以產生67 ku、62 ku、57 ku 3種亞型蛋白。正常情況下，AIF蛋白位于線粒體內，當細胞中BAX增多時，BAX形成二聚體并轉移到線粒體膜上，線粒體膜的通透性功能發(fā)生改變，線粒體通透性轉換孔開放，57 ku AIF蛋白可以從線粒體中釋放到細胞質并轉移到細胞核內，降解DNA導致DNA片段化，從而促進細胞凋亡［15］。本研究結果顯示，檸檬醛作用于NB4細胞48 h，AIF基因表達量明顯增加，NB4細胞產生過量的57 ku AIF蛋白，有可能通過線粒體途徑誘導NB4細胞凋亡。

綜上所述，檸檬醛可能通過線粒體途徑誘導NB4細胞凋亡。可能機制是：檸檬醛下調mtp53基因的表達，影響下游Bcl-2/BAX的比例，增加BAX的表達，從而改變線粒體膜的通透性，上調AIF等活性物質的釋放。檸檬醛是否存在線粒體以外的凋亡通路誘導細胞凋亡，尚需進一步研究。

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Mechanisms of apoptosis in NB4 cells induced by citral via regulation of mtp53 gene and AIF gene

Wang Yaping，Wang Juan，Wu Zhonghui，et al
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the mechanism of the apoptosis induced by citral in the acute promyelocyticleukemia cell line NB4.Methods NB4 cells were treated with citral for 48 h at the various concentration，and then the mRNA expression of mutation p53（mtp53）and AIF was detected by method of qPCR.Results The expression of mtp53 gene decreased when the critral groups compared with the control group，the difference between them was statistically significant（P＜0.05）；the expression of AIF gene was increased when the critral group compared with the control group，the difference between them was statistically significant（P＜0.05）；ethanol group compared with the control group，mRNA expressions of mtp53 and AIF had no significant difference.With citral concentration（5，10，20 mg/L）increasing，the level of expression of mtp53 mRNA reduced，while the level of expression of AIF mRNA gradually increased，both mtp53 and AIF expression in different concentrations of citral group differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Citral can induce apoptosis in NB4 cells by downregulating the expression of mtp53 and upregulating the expression of AIF.

citral；leukemia；NB4；p53；apoptosis inducing factor

R 733.71；R 979.1

A

1000-1492（2016）08-1101-05

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.012.html

2016-04-19 接收存待用。取2 μl逆轉錄成的cDNA，進行qPCR反應。以管家基因GAPDH為內參，每份樣本設3組平行對照。反應體系為20 μl，條件：95℃、2 min，94℃、20 s，65℃、20 s，72℃、30 s，40個循環(huán)。所測基因的表達量RQ=2-ΔΔCt［ΔΔCt=（待測樣品的目的基因的Ct平均值-待測樣本的看家基因的Ct平均值）-（對照樣品的目的基因的Ct平均值-對照樣本的看家基因的Ct平均值）］，RQ值越大，基因的表達量越大。

安徽省自然科學基金（編號：1308085MH159）

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液內科，合肥 230022

2安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，合肥 230022

王亞萍，女，碩士研究生；

夏海龍，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者：E-mail：xhl1999cn@163.com

檸檬醛通過下調NB4細胞mtp53的表達，上調AIF的表達誘導NB4細胞凋亡。