流式細胞術檢測IgD與IgD受體結合實驗方法的建立

陳恒石，吳育晶，黃 瓊，陳文生，董 進，魏 偉

流式細胞術檢測IgD與IgD受體結合實驗方法的建立

陳恒石，吳育晶，黃 瓊，陳文生，董 進，魏 偉

目的 建立非放射性熒光標記的配體受體結合實驗，檢測IgD與其受體結合的作用特性。方法 以配體受體結合理論為基礎，利用熒光標記抗體技術，建立非放射性配體受體結合實驗方法。利用流式細胞術檢測人CD4+T細胞和人滑膜細胞上IgD與IgD受體結合的親和力。結果 人CD4+T細胞上IgD與IgD受體結合的解離常數（KD）和受體最大結合容量（Bmax）分別是8.10×10-10mol/L和6 605相對值/104細胞，人滑膜細胞上IgD受體與IgD結合的KD和Bmax值分別是7.02×10-10mol/L和5 977相對值/104細胞。結論 該方法避免了傳統受體與配體結合分析中放射性標記的問題，操作簡便、穩定性好、靈敏度及選擇性均較高，可為分析配體受體結合提供新的方法。

配體受體結合；親和力；IgD；熒光標記

免疫球蛋白D（immunoglobulin D，IgD）作為一類免疫球蛋白，一方面可作為B細胞表面受體（B cell receptor，BCR）發揮免疫功能，另一方面可以作為配體與其受體（IgD receptor，IgD-R）結合激活下游信號通路［1］。在病理狀態下，IgD與IgD-R的過度結合，可能導致自身抗體生成增多、自身免疫反應增強，從而介導自身免疫疾病的發生。目前，相關研究僅確定了IgD-R分布以及表達量，IgD-R的編碼基因和分子結構尚不明確，IgD與IgD-R特異性結合后產生的相關作用及機制更是了解甚少［2］，因此，IgD與其受體結合的動力學參數是研究IgD和IgD-R特性的基礎性環節。受體動力學特性的檢測主要通過配體受體結合實驗，該方法考察的是受體與配體結合能力，而非受體的功能，且不涉及受體信號通路研究。經典的放射性配體受體結合（radioligand-receptor binding assays，RRA）實驗方法應用放射性核素標記配體與特異性受體相結合，研究受體的親和力和受體的數量，以及研究受體亞型，廣泛用于測定受體的密度和親和力［3-4］。鑒于RRA存在放射性元素標記困難，需要進行安全防護，放射性廢物處理繁瑣且費用昂貴等缺點，該實驗采用一種非放射性熒光標記抗體的技術，來檢測IgD與IgDR結合的親和力等特性，克服了傳統受體配體結合分析中放射性標記技術的問題，為進一步篩選IgD與IgD-R結合的競爭性藥物奠定實驗基礎，并為藥物結構設計和新藥篩選提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人外周血和滑膜組織的來源 抽取安徽醫科大學第一附屬醫院體檢中心健康志愿者靜脈血10 ml，肝素鈉抗凝；正常者滑膜取材于安徽醫科大學第一附屬醫院骨科外傷截肢患者，均知情同意，研究方案獲得安徽醫科大學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 人IgD蛋白（美國Abcam公司）；PE-抗IgD抗體、APC-Cy7標記的鏈霉親和素（美國BD公司）；DMEM培養基、細胞培養基（RPMI-1640）、胰酶、胎牛血清（美國GIBCO公司）；人CD4磁珠（德國美天旎生物技術有限公司）；人外周血淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 Napco-6100 CO2細胞培養箱（美國杜邦公司）；FC500型流式細胞儀（美國貝克曼公司）；超純水系統（美國密理博公司）；Vortex-Qilinbeier 5渦旋儀（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；3-30K高速離心機（美國Sigma公司）；MACS分選器（德國美天旎生物技術有限公司）；MaxQ 6000恒溫箱（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人外周血單個核細胞的制備 取2 ml淋巴分離液于離心管內，同時用毛細吸管吸取約2 ml的血漿輕輕加入分離液上，以水平轉子離心機1 500 r/min離心20 min。離心后，可見分成多層，最下層是紅細胞，中間層是分層液，最上層是血漿。在血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個核細胞層。用毛細吸管插入到單個核細胞層并吸取該層，放入另一試管中，計數細胞。

1.2.2 人CD4+T細胞的分離與鑒定 每107個/ ml細胞為一個單位，1 500 r/min離心10 min收集待分離細胞，用少量生理鹽水充分混懸細胞，加入CD4磁珠（10～20 μg/ml終濃度），4℃孵育15 min。用2 ml生理鹽水、1 500 r/min離心10 min棄上清液，再加生理鹽水充分混懸細胞，將分離柱安裝入磁場中，加入2 ml生理鹽水，在重力作用下自然流盡，以預處理分離柱。將孵育完畢的細胞加入分離柱中，自然流盡，生理鹽水洗柱2次，取下柱子，加5 ml生理鹽水，快速打出里面標記的細胞，即為CD4+T細胞。取磁珠分選前后的細胞1×105，離心，棄上清液，加入80 μl PBS，10 μl FITC-抗CD4抗體，混勻，25℃恒溫箱中避光放置30 min，流式細胞儀檢測分析。

1.2.3 人滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes cells，FLS）的分離和培養 術中取出的滑膜組織于無菌條件下剪碎至1 mm3大小，用不含Ca2+、Mg2+的D-Hanks液反復沖洗，用玻璃吸管吸取均勻排列于培養瓶（預先用含20%胎牛血清DMEM培養液濕潤）的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培養箱中培養6 h，使其貼壁。再輕輕翻轉培養瓶，使培養液剛剛覆蓋組織塊，每隔2～3 d換1次培養液，觀察到有大量成纖維細胞長出后輕輕取出組織塊，繼續培養，待細胞快長滿時用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代培養，取第3～8代細胞用于實驗。

1.2.4 細胞形態學觀察 倒置顯微鏡下動態觀察CD4+T細胞和FLS的形態、數量的變化并拍照記錄。

1.2.5 IgD結合CD4+T細胞親和力實驗 人CD4+T細胞以1×106/孔的細胞密度鋪6孔板，加入含0.1%BSA的不同濃度IgD（0.1、0.3、1、3、10、30 μg/ml）作為結合組，和非特異性結合對照組在37℃恒溫箱中孵育2 h，每孔總體積為1 ml。PBS洗滌細胞2次后用2 000 r/min離心10 min，去上清液后，PBS 100 μl重懸細胞，結合管加入PE-抗IgD抗體20 μl，非特異性結合對照管加入同型對照抗體20 μl，25℃恒溫箱孵育30 min，PBS洗滌細胞2次并用網紗過濾后用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.2.6 IgD結合FLS親和力實驗 因為FLS為貼壁細胞，在IgD結合受體前或結合后消化細胞，設計方法1和方法2進行了比較。方法1：人FLS以1× 106/孔的細胞密度鋪6孔板，待細胞貼壁長至80%并形態良好，用PBS洗滌細胞2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌2次后用2 000 r/min離心10 min，去上清液后，加入含0.1%BSA的不同濃度IgD（0.1、0.3、1、3、10 μg/ml）作為結合組，和非特異性結合對照組在37℃恒溫箱中孵育2 h，每管總體積為1 ml。孵育結束再次用PBS洗滌細胞2次，2 000 r/min離心10 min，去上清液后，PBS 100 μl重懸細胞，結合管加入PE-抗IgD抗體20 μl，非特異性結合對照管加入同型對照抗體20 μl，25℃恒溫箱中孵育30 min，PBS洗滌細胞2次并用網紗過濾后用流式細胞儀檢測熒光強度。方法2：將6孔板中FLS細胞先用PBS洗滌細胞2次，在板中加入含0.1%BSA的不同濃度IgD（0.1、0.3、1、3、10 μg/ ml）作為結合組，和非特異性結合對照組在37℃恒溫箱中孵育2 h，每孔總體積為1 ml。PBS洗滌細胞2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌2次后以2 000 r/min離心10 min，去上清液后，PBS 100 μl重懸細胞，按方法1中步驟加入流式抗體孵育并上機檢測。

1.2.7 繪制飽和曲線 配體IgD與IgD-R的結合特性用熒光強度（fluorescent intensity，FI）值來計算。根據流式細胞儀檢測結果，設置同型對照管為非特異結合管，其他各濃度組的熒光強度減去同型對照管熒光強度即為各濃度組IgD的特異性結合的量，以不同濃度IgD為X軸，對應的特異性結合的量為Y軸，繪制飽和曲線。

1.2.8 最大結合量（maximum binding capacity，Bmax）和解離常數（dissociation constant，KD） 根據飽和曲線，B表示受體與配體特異性結合的量，故IgD最大結合量用Bmax表示，F代表配體濃度（即IgD濃度），KD為解離常數，根據公式：

轉換為Scatchard方程，用B/F對B作圖，可得直線，其斜率為-1/KD，縱軸截距為B/KD，橫軸截距為Bmax，藉此可求出KD和Bmax［5］。

2 結果

2.1 人CD4+T細胞的鑒定 經流式細胞儀檢測，原PBMC中CD4+T細胞占28%，分選后CD4+T細胞純度為96%（圖1），符合后續實驗的要求。

2.2 人CD4+T細胞親和力實驗 為了檢測IgD與CD4+T細胞上IgD-R之間結合的親和力，本實驗采用流式細胞術檢測IgD配體與其受體的結合。不同濃度IgD與IgD-R結合，結合的孵育條件是37℃，孵育抗體后，IgD與IgD流式抗體結合發出熒光，可通過流式細胞儀收取并獲得1×104個細胞，檢測其平均熒光強度（mean fluorescent intensity， MFI）。結合總細胞數（1×104）計算總FI，并根據IgD濃度和結合后的FI作出結合曲線（圖2、3），再轉換成Scatchard直線方程（圖4）Y=-6.591 3X+ 43 535，r=-0.967。計算出解離常數KD和受體最大結合容量Bmax分別是8.10×10-10mol/L和6 605相對值/104細胞。

圖1 分選前后人CD4+T細胞純度的鑒定

2.3 人FLS親和力實驗 人FLS為貼壁細胞，胰酶消化前后細胞的形態差異較大，實驗比較了兩種處理方法后的結果。第一種先將滑膜細胞消化，再進行IgD配體與其表面IgD-R結合（方法1）；第二種是維持滑膜細胞的形態，在IgD配體先與細胞表面IgD-R結合后再消化細胞，并檢測（方法2）。比較兩種方法得到的結合曲線Scatchard直線方程等參數（圖5）。比較IgD在FLS消化后結合受體的結果與先結合受體后消化的結果顯示：方法1的Scatchard直線方程是Y=-2.77 X+5 265，方法2的Scatchard直線方程是Y=-7.61X+45 492；其中方法1的KD值為1.95×10-9mol/L，顯著大于方法2的7.02×10-10mol/L；方法1的Bmax值為1 894相對值/104細胞，顯著小于方法2的5 977相對值/ 104細胞，表明方法1檢測的親和力和結合力都偏小，且方法1線性回歸的相關系數為-0.733，低于方法2的-0.817，可能由于FLS形態變化導致了細胞表面IgD-R數量減少，造成親和力降低和數據精確性不夠等問題。因此，對于貼壁細胞，實驗優先選用在IgD配體先與細胞表面IgD-R結合后再消化細胞的操作方法。

圖2 流式細胞術檢測不同濃度IgD及其受體結合后MFI的變化

圖3 IgD結合CD4+T細胞表面IgD-R飽和曲線

圖4 IgD結合CD4+T細胞表面IgD-R轉換成Scatchard直線方程

圖5 比較兩種方法IgD結合人FLS表面IgD-R的飽和曲線和Scatchard直線方程

3 討論

根據Clark的占領理論，受體與配體之間的相互作用是可逆的，受體與配體的結合反應遵循質量作用定律，KD值表示受體與配體親和力的大小，值越小，親和力越大。繪制的飽和曲線的高度反映了受體數量的多少，曲線上升的快慢則反映受體和配體的親和力大小，即親和力越大，曲線上升越快［6］。

受體與配體的結合反應一般都較快（多數在數十秒至數十分鐘）達到平衡。在反應體系中加入定量配體及定量受體，于反應開始后不同時間測定特異性結合配體量，可以計算出反應動力學的常數。多點飽和法是受體結合分析常用的方法，指在一定量的受體樣本中，逐步增加配體的量，使受體結合趨于飽和可通過曲線擬合法或直線擬合法計算受體結合容量和配體與受體結合的親和力（用KD表示）［7］。

受體數量的檢測通常主要通過配體與受體直接結合的方法，目前有許多技術和方法應用于受體配體結合實驗。傳統的受體配體結合實驗較為簡單，將配體與一個合適的標記相結合，與另一個結構類似的化合物相競爭，共同作用于受體上，并在受體適宜的濃度下進行孵育。這樣的方法通常用于藥物的篩選、診斷和環境的研究［8］。過去幾十年，配體主要用放射性的3H或者125I進行放射性標記。近幾年一方面由于非同位素的標記發展，另一方面伴隨著熒光強度分析、熒光共能量轉移等熒光技術的發展，利用熒光標記抗體方法來檢測配體與受體結合得到廣泛關注。熒光標記技術因具有操作簡便、穩定性好、靈敏度及選擇性均較高等特點，已廣泛應用于體內外藥物的定量檢測中。

熒光標記技術是一種非放射性的標記技術，其通過將能發射熒光的物質共價結合或物理吸附在所要的研究分子的某個基團上，使后者也能具有某種能被定性及定量檢測的熒光特性，并由此提供給研究者需要獲得的被研究對象的相關信息。目前國外已有文獻［9］報道將熒光標記技術應用于受體配體結合實驗中，有人利用熒光分光光度計來檢測標記在配體上的熒光探針的MFI。檢測免疫球蛋白IgM及B細胞刺激因子與其受體結合特性時也利用了熒光標記替代放射性標記，并利用流式細胞儀來檢測MFI，靈敏度更高，并且可以更加準確地計算細胞的平均MFI［10-11］，利用熒光標記檢測配體受體結合實驗的方法研究不多，有其重要價值。

圖6 放射性配體受體結合實驗和熒光標記配體受體結合實驗原理的比較

與其他Ig類型類似，IgD除了作為B細胞表面受體BCR發揮免疫功能，還可以作為配體與其受體結合激活下游信號通路，而IgD-R的基因序列結構等尚未知，所以經典的配體受體結合實驗對于研究IgD與IgD-R之間受體動力學特性必不可少。通過借鑒放射性配體受體結合實驗原理，利用熒光標記的抗體代替了傳統的放射性標記的配體，再利用流式細胞術檢測MFI，建立了熒光標記配體受體結合實驗方法，并首次將此方法應用于IgD與IgD-R的結合實驗中（圖6）。

傳統放射性配體受體結合實驗中不可避免的是非特異性結合。非特異性結合是放射配體與靶受體以外的位點結合，非特異性結合的測定對計算配體的特異結合是非常重要的。非特異性結合包括組織中非靶受體的結合，非組織（如濾紙）的結合和未被沖洗掉的游離放射配體。在本實驗中標記同型抗體作為非特異性結合管，同時利用孵育液中的牛血清白蛋白（0.1%）來減弱非特異性結合的作用，并且通過流式細胞術識別細胞避免了部分非組織結合。一個普遍的問題是用于標記配體的熒光染料不能影響到配體受體之間本身的特性，且不能削弱配體和受體之間的親和力［12］。本實驗中配體IgD先與IgD-R受體結合，再利用IgD的熒光抗體檢測已結合的IgD，避免了這些問題。

本實驗利用建立的配體受體結合實驗分別檢測了CD4+T細胞和FLS細胞表面IgD與IgD-R結合的動力學特征，其中CD4+T細胞為懸浮細胞，FLS細胞為貼壁細胞。已有文獻［13］報道人CD4+T細胞上有IgD-R表達，而人滑膜細胞FLS上是否也有IgD-R表達目前沒有文獻報道，我所前期實驗顯示人滑膜細胞上有IgD-R的表達。在本文中利用配體受體結合實驗檢測出IgD與人CD4+T細胞和FLS上IgD-R結合的KD值理論上是相近的，分別為0.810 nmol/L和0.702 nmol/L，說明IgD分別與人CD4+T細胞和FLS上IgD-R結合的親和力相似，也證實了FLS上有IgD-R的存在，說明IgD-R在此兩種不同的細胞上受體特性相近，都發揮重要的免疫學功能。本文選用的FLS為貼壁細胞，胰酶消化前后細胞的形態差異較大，通過設計方法1和方法2比較胰酶消化對結合實驗的影響。結果顯示：FLS消化后形態變化較大，會影響到IgD與其受體的結合，故而在貼壁細胞的結合實驗中，建議采用配體受體結合后再消化細胞的方法。

本文建立的配體受體結合實驗也有一定的局限性：首先，要求被檢測的細胞中不含有配體（如IgD）的干擾；另外，由于流式細胞儀的局限性，本方法適用于細胞表面配體受體結合實驗，而不適用于組織中的配體受體結合實驗。

流式細胞術在受體與配體結合分析中的應用為配體與受體結合分析開辟了新的途徑，該方法避免了放射性和熒光分析中存在的問題，利用熒光抗體標記配體代替放射性配基，避免了放射性元素標記困難、需要進行安全防護、放射性廢物處理繁瑣而且費用昂貴等缺點。

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Novel fluorescence based ligand-receptor binding assay：study on IgD receptor

Chen Hengshi，Wu Yujing，Huang Qiong，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Key Laboratory of Anti-Inflammatory and Immune Medicine，Ministry of Education，Collaborative Innovation Center of Anti-Inflammatory and Immune Medicine in Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To establish a fluorescence method for the detection of receptor binding assay and to detect the affinity of IgD ligand receptor binding.Methods Based on the experimental results of the ligand receptor binding assay，fluorescence based receptor binding assay was established using fluorescent labeled antibody.The binding affinity of IgD receptors on human CD4+T cells and human fibroblast-like synoviocytes（FLS）was detected by flow cytometry.Results The dissociation constant（KD）and the maximum binding capacity（Bmax）of IgD receptors on human CD4+T cells were 0.810 nmol/L and 6 605 arbitrary unit/104cells，respectively.The KDand Bmaxvalue of IgD receptors on human FLS was 0.702 nmol/L and 5 977 arbitrary unit/104cells respectively.Conclusion This method avoids the defects of the radioactive label in the binding of the receptor and the ligand，and offers simple operation，good stability，high sensitivity，which can provide a new way for the ligand and receptor binding.

ligand receptor binding；affinity；IgD；fluorescence based receptor binding assay

R 9-331

A

1000-1492（2016）08-1105-06

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.014.html

2016-04-19 接收

國家自然科學基金（編號：81330081、81173075、81202596）；安徽醫科大學“青年拔尖人才支持計劃”項目；高等學校博士學科點專項科研基金（編號：20113420120006、20123420110003）；安徽省科技攻關計劃項目（編號：1301042098）；安徽省自然科學基金青年項目（編號：1408085QH173）

安徽醫科大學臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物教育部重點實驗室、安徽抗炎免疫藥物協同創新中心，合肥 230032作者簡介：陳恒石，男，碩士研究生；

魏 偉，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wwei@ ahmu.edu.cn