HIF-1α基因介導的牙髓干細胞在體外的成血管作用

鄧立方，朱友明，王銀龍

HIF-1α基因介導的牙髓干細胞在體外的成血管作用

鄧立方，朱友明，王銀龍

目的 探索低氧誘導因子-1α（HIF-1α）基因誘導牙髓干細胞（DPSCs）在體外的成血管作用。方法 對HIF-1α進行基因突變，構建突變型、野生型以及對照組的慢病毒載體；體外培養DPSCs；分別用3種慢病毒轉染DPSCs后，檢測細胞轉染效率、目的基因HIF-1α在mRNA及蛋白水平的表達，MTT法檢測慢病毒載體對細胞增殖的影響；目的基因轉染成功后，qPCR、Western blot法檢測HIF-1α調控DPSCs成血管因子的表達。結果 MTT結果表明慢病毒載體對DPSCs的增殖幾乎無影響。qPCR和Western blot法檢測目的基因HIF-1α成功表達，HIF-1α能夠顯著上調DPSCs的成血管因子的表達（P＜0.05）。突變組和野生組的成血管作用明顯強于對照組（P＜0.05），而突變組又優于野生組（P＜0.05）。結論 HIF-1α基因可以促進DPSCs血管向分化作用。

HIF-1α；DPSCs；慢病毒轉染；成血管

牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）有很強的增殖能力和多向分化的潛能，隨著基因工程和組織工程技術的發展，DPSCs越來越多地被用作修復受損組織或器官的轉基因靶細胞［1］。低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是HIF-1的活性單位，調控數百種基因的轉錄活性，涉及骨髓源性血管細胞生成、血管反應、動脈血管形成等［2］。HIF-1α蛋白穩定性和轉錄活性均受細胞內氧濃度的調節［3］，為了使其在常氧狀態下實現穩定表達并且能夠保持高度活性，對HIF-1α基因進行抗降解突變和保持活性突變［4］。研究［5］表明血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以顯著增強DPSCs成血管的活性，而HIF-1α作為VEGF的上游靶基因，其在誘導DPSCs成血管作用方面具有更大的優勢。骨修復和再生

中，血管與骨形成是相輔相成不可分開的，HIF-1α是此生物學過程中必需的關鍵性因子［6］。該研究擬運用基因增強組織工程技術，將HIF-1α基因穩定轉染至DPSCs中，探索HIF-1α在體外的成血管作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司）；HIF-1α、成血管抗體（英國Abcam公司）；qPCR試劑盒（日本TaKa-Ra公司）；PVDF膜（美國Invitrogen公司）；細胞裂解液等。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒載體Lenti-MT、Lenti-WT及Lenti-LacZ的構建 首先將野生型的HIF-1α基因（wild type HIF-1α，WT）進行基因突變為突變型HIF-1α（mutant type HIF-1α，MT）：402位脯氨酸（Pro 402）突變成丙氨酸（Ala 402），803位天冬酰胺（Asn 803）突變成丙氨酸（Ala 803），564位脯氨酸（Pro 564）突變成丙氨酸（Ala 564）。然后分別合成過表達載體pcDNA6.2-WT及pcDNA6.2-MT，通過BP/ LR重組后，構建慢病毒載體Lenti-WT、Lenti-MT和Lenti-LacZ。最后病毒包裝后進行滴度測定。

1.2.2 DPSCs的培養和分離 臨床收集年輕因正畸需要拔除的健康前磨牙或阻生齒，無菌條件下劈開牙齒取出牙髓，剪碎。先在培養皿中滴入1滴培養液，用消毒過的鑷子將剪碎的組織放入培養液中，鋪平勿重疊。用無菌凡士林涂于蓋玻片四角，將蓋玻片輕輕蓋在組織上，使其貼壁生長，切勿產生氣泡。最后加入適量培養液于恒溫培養箱中培養，1周后有細胞爬出，待細胞長滿狀態良好進行傳代。

1.2.3 HIF-1α基因轉染DPSCs最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI）值的測定 DPSCs培養至第3代，按2×105/孔將細胞接種于6孔板中，設定MOI值分別為2、4、6、8、10，將病毒轉入細胞中。轉病毒后每天觀察各孔中的熒光表達情況，選擇熒光細胞達到一定比例的最低MOI值作為最佳的MOI值。

1.2.4 MTT比色分析慢病毒對DPSCs細胞增殖水平的影響 將DPSCs鋪入96孔板中，第2天棄去培養液和未貼壁的細胞，每個基因分5組，每組設6孔，轉病毒Lenti-LacZ、Lenti-WT及Lenti-MT，常規培養。連續7 d每天先向各孔中加入5 mg/ml的MTT各20 L，培養箱培養4 h后，再分別每孔加入150 μl的DMSO并置于搖床上緩慢震蕩30 min使結晶物充分溶解。最后用酶標儀測定各孔490 nm處的吸光度值。實驗重復3次，取均值。

1.2.5 qPCR法測定目的基因HIF-1α以及成血管相關因子（VEGF、SDF-1、Ang-2）的mRNA的表達

選擇狀態良好、處于對數生長期的DPSCs細胞進行鋪板。首先用0.25%胰酶消化后1 000 r/min離心5 min，用完全培養基將細胞沉淀重懸獲得單細胞懸液，細胞計數，按照每孔2×105個細胞傳于6孔板中。待細胞生長至60%～70%融合度時，按照之前測定的最佳MOI值加入相應體積的慢病毒轉染DPSCs細胞，實驗分組為Lenti-LacZ/DPSCs、Lenti-WT/DPSCs、Lenti-MT/DPSCs。分別于轉染后0、1、4、7、14及21 d收集細胞。TRIzol法提取細胞總RNA，核酸蛋白測定儀測定DNA濃度及純度，RNA純度為260/280 1.7～1.9，按照Invitrogen試劑說明書反轉錄cDNA置-20℃保存備用。最后按qPCR儀設定的PCR擴增體系進行PCR擴增，系統自帶軟件顯示各樣本Ct值，將標本檢測所得的Ct值與相應的β-actin基因Ct值相減，進行標準化，校正標本RNA質量和反轉錄效率的差別，實驗重復進行3次。ΔCt=CtHIF-1α-Ctβ-actin。ΔΔCt定義為ΔCt不同處理組-ΔCt未轉染組，計算2-ΔΔCt進行相對定量。

1.2.6 Western blot法檢測HIF-1α蛋白以及成血管相關蛋白（VEGF、SDF-1、Ang-2）的表達 實驗分組同qPCR，分別于病毒轉染后0、1、4、7、14及21 d收集細胞。加入2 μl蛋白酶抑制劑及200 μl細胞裂解液，置于冰袋上，搖床緩慢震蕩15 min，吹打收集細胞中的蛋白。最后于4℃、12 000 r/min離心10 min。BCA法測定蛋白質濃度，確定電泳每孔上樣量為30 μl。用10%的SDS-聚丙稀酰胺凝膠分離膠，濕式電轉移法將蛋白轉移至PVDF膜。TBST沖洗3次，每次10 min，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液附一抗，4℃過夜。第2天在室溫下附二抗2 h后TBST洗滌3次。DAB顯色，暗室曝光、顯影。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 細胞轉染效率檢測 DPSCs轉染病毒7 d后，病毒轉染效果最好。倒置熒光顯微鏡觀察MOI=10 pfu/cell時，轉染效率最高，達90%以上，DPSCs保持增殖狀態。見圖1。

圖1 細胞轉染結果 ×500

2.2 慢病毒轉染對DPSCs增殖的影響 在目的基因轉染DPSCs后1～7 d進行MTT檢測，結果顯示，轉基因組吸光度值高于LacZ組，MT組大于WT組（圖2）。這些結果也說明構建的突變型HIF-1α基因在體外常氧條件下可以穩定過表達并保持高度活性。另外，MTT結果表明慢病毒載體對DPSCs的增殖幾乎沒有什么影響，而且HIF-1α基因還有促進DPSCs增殖的作用。

圖2 慢病毒轉染對DPSCs增殖的影響

2.3 目的基因檢測 實時定量PCR結果顯示，Lenti-MT組目的基因轉染DPSCs后，第1天HIF-1αmRNA的表達開始增高，7 d后達到高峰，14、21 d雖有降低但仍維持在很高水平。Lenti-MT組的HIF-1α表達與Lenti-WT組轉染1 d后就出現差異，7 d及21 d mRNA的表達量，Lenti-MT組幾乎比Lenti-WT組高出1倍（P＜0.05），Lenti-WT組HIF-1a mRNA的表達緩慢增長后逐漸降低。Lenti-LacZ組雖然也有少量HIF-1α的表達，但其與目的基因組相比，4、7、14、21 d差異均有統計學意義（F=6.167，P＜0.05）。蛋白水平的表達趨勢與mRNA相符，LacZ組幾乎看不到HIF-1α蛋白的表達，而Lenti-MT組蛋白表達水平不斷升高，Lenti-WT組則相對穩定。見圖3。

圖3 目的基因檢測

2.4 HIF-1α促進DPSCs成血管因子mRNA表達的檢測 檢測3個（VEGF、SDF-1、Ang-2）與成血管作用密切相關的基因。其中，VEGF基因在第4天Lenti-MT組的表達量為Lenti-LacZ組的2～3倍（F =3.329，P＜0.05）（圖4 A）。SDF-1基因第4天時Lenti-MT組為Lenti-LacZ組的4～5倍，第7天為10～15倍（F=6.231，P＜0.05）（圖4 B）。Ang-2基因第7天、第14天Lenti-MT組為Lenti-LacZ組的20～30倍（F=2.457，P＜0.05）（圖4 C）。此外，成血管基因在Lenti-MT組的表達水平與Lenti-WT組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 HIF-1α促進DPSCs成血管因子蛋白表達的檢測 基因轉染后0、1、4、7、14、21 d，收集細胞，Western blot法檢測成血管相關蛋白的表達。在目的基因轉染后第1天，VEGF和SDF-1蛋白表達增高，其過表達持續到第21天。Lenti-WT組和Lenti-MT組的VEGF蛋白表達水平與Lenti-LacZ組比較差異有統計學意義（P＜0.01），VEGF蛋白Lenti-MT組高于Lenti-WT組（P＜0.05），SDF-1蛋白Lenti-MT組與Lenti-WT組之間無顯著差異。Ang-2蛋白在目的基因轉染后第4天出現過表達，第7～14天表達水平持續增高，與基因表達趨勢幾乎一致，Lenti-WT組和Lenti-MT組顯著高于Lenti-LacZ組（P＜0.05），同時，Lenti-MT組明顯高于Lenti-WT組（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

近年來有關骨組織工程的研究越來越多，其與同種異體骨和自體骨相比有很多的優點。當人體硬組織由于外傷或腫瘤等原因缺損時，可選擇組織工程骨加以修復。但當組織工程骨的厚度超過100～200 μm，必須在骨中形成血管才能為細胞提供氧及各種營養物質并且運輸出代謝廢物［7］。因此，骨組織工程中種子細胞復合支架材料后，除了要有細胞因子的誘導，還需要成功建立血運循環。

圖4 qPCR分析目的基因轉染DPSCs后在成血管相關基因的表達

圖5 Western blot法檢測成血管相關蛋白的表達

VEGF是重要的促進血管生成因子，其被低氧激活后，對誘導血管的發生起關鍵作用。但是僅憑VEGF調控不能獲得穩定且成熟的血管網［8］。HIF-1α是VEGF、SDF-1和Ang-2等成血管因子的上游調控基因，其具有更好的促血管生成作用［9］。低氧狀態下HIF-1α是血管發生的中心調控因子，調控其他生長因子的表達，直接參與血管發生的整個生物學過程［10］。

DPSCs作為種子細胞有4個優點：①獲取方便：可從脫落的乳牙或者拔除的正畸牙、智齒的牙髓中分離得到；②細胞擴增后可再植于自體需要修復的組織中，從而避免了免疫抑制劑的使用［11］；③多向分化：DPSCs來源于間葉組織能夠分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經元等［12］；④高度增殖：DPSCs的體外培養增殖速度是骨髓間充質干細胞的30～50倍，比骨髓間充質干細胞具有更高的克隆形成能力［13］；目前DPSCs的研究是口腔醫學領域中的一個熱點。

綜上所述，本實驗采用基因突變技術對HIF-1α基因進行區域突變，實現體外常氧條件下HIF-1α的穩定表達并保持其高度活性。然后構建Lenti-WT、Lenti-MT及Lenti-LacZ慢病毒載體，將上述載體成功轉染DPSCs后，體外檢測HIF-1α誘導DPSCs成血管因子（VEGF、SDF-1及Ang-2）的表達情況。初步證實了體外HIF-1α基因促進DPSCs成血管的作用，體外實驗結果為體內動物實驗研究奠定了基礎。但是HIF-1α體外誘導DPSCs成血管分化的作用機制以及如何在體內促進血管重建，還需要進一步的探索。

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On HIF-1α gene in promoting the formation of blood vessel by DPSCs in vitro

Deng Lifang，Zhu Youming，Wang Yinlong
（Stomatologic Hospital&College，Anhui Medical University，Key Lab.of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To explore the function of HIF-1α gene in promoting the differentiation of dental pulp stemcells（DPSCs）into blood vessels in vitro.Methods HIF-1α gene was mutated.The lentiviral vectors of Lenti-WT，Lenti-MT and Lenti-LacZ were constructed.The DPSCs were cultured and treated with three lentiviral vectors.Then the cells transduction efficiency and the expression of target gene at the level of mRNA and protein were detected.The influence on cell proliferation from lentiviral vectors was detected by MTT.After transduction，RNA and protein were extracted，the expression of angiogenic factor was detected by qPCR and Western blot.Results

HIF-1α；DPSCs；lentivirus transfection；angiogenesis

R 782

A

1000-1492（2016）08-1120-05

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.020.html

2016-05-04 接收

國家自然科學基金（編號：31501103）

安徽醫科大學口腔醫學院，安徽醫科大學附屬口腔醫院，

安徽省口腔疾病研究中心實驗室，合肥 230032

鄧立方，女，碩士研究生；

王銀龍，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：wangylah@sina.com

MTT showed that there was no effect on DPSCs proliferation from lentiviral vectors.The results of qPCR and Western blot showed that HIF-1α gene was located in cell nucleus，expression of target gene was detected at both mRNA and protein level.After gene transduction，expression of angiogenic factor at the mRNA and protein levels was significantly increased（P＜0.05）.The formation of blood vessel in Lenti-MT and Lenti-WT groups was better than that in Lenti-LacZ group（P＜0.05），and the best result was found in Lenti-MT group（P＜0.05）.Conclusion

HIF-1α could promote DPSCs to form blood vessels.