miRNA21抑制劑對食管癌細胞凋亡的影響

李紅霞，李玉芝，高峻峰，劉思涵，葛 磊，鮑揚漪，汪正廣

miRNA21抑制劑對食管癌細胞凋亡的影響

李紅霞1，李玉芝1，高峻峰1，劉思涵1，葛 磊1，鮑揚漪1，汪正廣2

目的 探討miRNA21抑制劑對食管癌細胞EC109凋亡的影響。方法 實時熒光定量PCR法檢測20例食管癌及癌旁組織中miRNA21的表達。轉染miRNA21抑制劑入人食管癌細胞株EC109，Caspase 3活性檢測試劑盒分析Caspase 3活性變化，DNA片段檢測試劑盒分析DNA片段變化，Western blot法檢測Caspase 3及BCL-2表達。結果 相對癌旁組織，食管癌組織中miRNA21表達明顯升高；miRNA21抑制劑能顯著增加EC109細胞凋亡；同時miRNA21抑制劑促進食管癌細胞EC109 Caspase 3的表達上調，Bcl-2的表達下調。結論 食管癌的發生可能與miRNA21的高表達有關，miRNA21抑制劑可能通過下調Bcl-2的表達誘導人食管癌細胞EC109的凋亡。

食管癌；細胞凋亡；miRNA21；Bcl-2

食管癌是常見的消化道腫瘤之一［1］，在我國食管癌的發病率和死亡率位于前列［2］。手術切除術是目前治療食管癌的主要方法，但手術切除對患者有嚴格的要求，如已呈惡病質、發生遠端轉移等的患者均不能行根治性手術治療。因此，尋找食管癌進展及轉移等病變的特異性指標對其治療及提高患者的生存率具有重要的理論和實際意義。microRNA（miRNA）是一類廣泛存在于真核細胞中，長度一般為21～23個核苷酸的RNA分子［3］。研究［4］顯示，miRNA對真核細胞的基因表達具有調控作用。miRNA通過與靶標基因轉錄的mRNA分子的3′端非編碼區域互補結合，阻斷蛋白質翻譯的過程從而發揮對靶標的調控。miRNA在腫瘤的發生發展過程中的作用已有相關報道［5］，但在食管癌中研究較少。該實驗在研究食管癌組織標本中miRNA21表達變化的基礎上，在人食管癌細胞EC109中轉染miRNA21抑制劑，探討其對食管癌細胞凋亡的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織、細胞及主要試劑 標本來自安徽醫科大學第三附屬醫院胸外科手術切除并經病例證實的食管癌及癌旁組織；人食管癌細胞株EC109（中國科學院上海細胞庫）；miRNA熒光定量PCR試劑盒（HG SYBR Green RNU6B，AP01501，中國北國?；锟萍加邢薰荆?；小鼠抗人Bcl-2及Caspase 3單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RNA抽提試劑盒（美國Gibco-BRL公司）；Caspase 3活性檢測試劑盒（美國BIOMOL Research Laboratories公司）；DNA片段檢測試劑盒（瑞士Roche Applied Science公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA的制備 取食管癌及癌旁組織標本于勻漿器中勻漿。加入1 ml TRIzol試劑后冰上放置5 min，加0.2 ml氯仿，震蕩混勻后靜置3 min，14 000 r/min離心15 min。上層水相移至離心管加異丙醇，放10 min，14 000 r/mim離心15 min，棄上清液，加75%乙醇洗滌。棄乙醇干燥10 min，沉淀重懸于無RNA酶的水中。

1.2.2 miRNA21的檢測 miRNA檢測試劑盒分析miRNA21的表達（參考試劑盒說明書）。

1.2.3 細胞培養及轉染 食管癌EC109細胞于RPMI 1640的培養基中培養（含20%胎牛血清），EC109細胞呈單層后消化細胞，接種至6孔板中（細胞計數每孔約5×105個，48 h后用RPMI 1640培養液洗滌3次（不含血清），分別轉染miRNA21抑制劑和miRNA陰性對照，半小時后加入脂質體Lipofectamine2000 10 μl/孔，轉染6 h后更換培養基，進行后續實驗。

1.2.4 Caspase 3活性檢測 Caspase 3活性檢測試劑盒分析其活性。方法如下：待EC109細胞密度長到80%～90%時，PBS洗3遍，加入1 ml胰酶，37℃消化3 min，吹打細胞液至單細胞懸液。將Lipfectamine2000與miRNA21抑制劑及對照的混合液加入不同的培養板中孵育48 h。離心2 min，PBS洗滌2次，加入100 μl裂解緩沖液，冰上放置15 min，渦旋振蕩15 s，離心5 min。取10 μl蛋白上清液，加入90 μl檢測緩沖液中，加入10 μl Ac-LEHD-pNA，避光反應1～2 h后檢測結果。

1.2.5 DNA片段檢測 DNA片段檢測試劑盒分析其變化（參考試劑盒說明書）。待EC109細胞密度長到80%～90%，用PBS洗3遍，加入1 ml胰酶，37℃消化3 min，吹打細胞液至單細胞懸液。將Lipfectamine2000與miRNA21抑制劑及對照的混合液加入不同的培養板中孵育48 h。離心2 min，PBS洗滌2次，加BrdU至終濃度為10 mmol/L。培養過夜。去培養基，PBS洗2次。加入過氧化物酶結合的BrdU抗體，450 nm檢測吸光度。

1.2.6 Western blot法檢測 待EC109細胞密度長到80%～90%，用PBS洗3遍，加入蛋白裂解液以裂解細胞，BAC法檢測蛋白濃度。配制SDS-PAGE凝膠后行蛋白電泳后將凝膠中蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉3 h，分別加入相應的抗體Bcl-2、Caspase 3及GAPDH，孵育過夜后PBS洗滌3次，每次10 min，加二抗，孵育3 h后PBS洗滌3次，每次10 min，ECL法顯色。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，符合正態分布的定量變量以±s表示。多組計量資料的比較采用單因素方差分析，多組之間的兩兩比較采用LSD-t檢驗的方法，兩獨立樣本均數比較采用成組設計的t檢驗。

2 結果

2.1 miRNA21在食管癌中的表達 實時熒光定量PCR結果顯示：相對于癌旁組織，食管癌組織中miRNA21表達明顯升高（t=2.645，P＜0.05），達到230%（圖1）。

圖1 食管癌中miRNA21含量的變化

2.2 miRNA21抑制劑對食管癌EC109細胞Caspase 3活性的影響 將miRNA陰性對照、miRNA21抑制劑用Lipofeetamine2000轉染EC109細胞，接種于6孔板中。Caspase 3檢測結果顯示：相對于正常對照組及miRNA陰性對照組，miRNA21抑制劑組Caspase 3活性明顯升高（F=64.78，P＜0.05）。提示miRNA21能顯著誘導EC109細胞凋亡。見圖2。

2.3 miRNA21抑制劑對食管癌EC109細胞DNA片段的影響 將miRNA陰性對照、miRNA21抑制劑用Lipofeetamine2000轉染EC109細胞，接種于6孔板中。DNA片段檢測試劑盒結果顯示：相對于正常對照組及miRNA陰性對照組，miRNA21抑制劑組DNA片段出現明顯增加（F=12.80，P＜0.05）。提示miRNA21抑制劑能顯著誘導EC109細胞凋亡。見圖3。

圖2 miRNA21抑制劑對食管癌EC109細胞Caspase 3活性的影響

圖3 miRNA21抑制劑對食管癌EC109細胞DNA片段的影響

2.4 miRNA21抑制劑對食管癌EC109細胞Caspase 3表達的影響 Western blot結果顯示：相對于正常對照組及miRNA陰性對照組，miRNA21抑制劑能顯著促進Caspase 3表達（F=34.56，P＜0.05）。見圖4。

圖4 miRNA21抑制劑對食管癌EC109細胞Caspase 3表達的影響

2.5 miRNA21抑制劑對食管癌EC109細胞Bcl-2表達的影響 Western blot結果顯示：相對于正常對照組及miRNA陰性對照組，miRNA21抑制劑能顯著抑制Bcl-2表達（F=25.31，P＜0.05）。見圖5。

圖5 miRNA21抑制劑對食管癌EC109細胞Bcl-2表達表達的影響

3 討論

食管癌是我國乃至世界范圍內的惡性腫瘤，盡管手術切除術及放化療法在臨床上廣泛應用，得到了很大的發展，但是患者的預后并不理想。因調節秀麗線蟲發育作用，使得Lin-4成為首個發現的miRNA［6］。而在對慢性淋巴細胞白血病的研究［7］顯示miRNA與腫瘤發生發展及診斷治療之間具有重要的相關性，在此之后人們開始關注并進行了大量廣泛的研究。研究［8-9］表明，腫瘤的發生和發展與miRNA的異常表達（包括上調和下調）密切相關，miRNA作為調控基因表達的一類小分子RNA，主要通過與下游靶基因mRNA的相互作用，調控著腫瘤的發生發展，扮演著非常重要的角色。研究［10-11］表明，miRNA與腫瘤的發生發展、診斷治療有重要的相關性，而在食管癌與miRNA方面研究的相對較少。

miRNA21被廣泛用于結直腸癌研究。研究［12］顯示其可以下調腫瘤抑制基因和誘導細胞增殖。研究［13］表明miRNA21可以作為結直腸癌的一個生物標記物。在食管癌中是否具有一定的生物學作用，目前仍不清楚。本實驗結果顯示相對癌旁組織，在食管癌標本中miRNA21表達明顯升高，提示miRNA21起了癌基因的作用，在食管癌的發生發展中發揮一定的作用。為證實miRNA21的功能，本研究進一步用miRNA21抑制劑處理食管癌EC109細胞，觀察miRNA21抑制劑是否對細胞的凋亡產生影響，結果顯示miRNA21抑制劑處理后的EC109細胞，其Caspase 3活性、DNA片段等反映細胞凋亡指標發生顯著的變化。進一步研究顯示抗凋亡蛋白Bcl-2的表達出現了明顯的降低。以上結果提示miRNA21抑制劑可能通過抑制Bcl-2的表達促進EC109細胞的凋亡。

本實驗結果表明miRNA21抑制劑能明顯誘導食管癌EC109細胞的凋亡，為食管癌的診斷、治療及預防提供了一定的實驗基礎，但miRNA21抑制劑是否直接通過靶向Bcl-2進而調節食管癌EC109細胞的凋亡，目前并不清楚。下一步將利用生物信息學的方法對miRNA21的靶標進行預測，并利用相關實驗法對miRNA21潛在靶標進行驗證，為治療食管癌提供新的靶點。

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Effect of miRNA21 inhibitor on the apoptosis of esophageal cancer cell line

Li Hongxia，Li Yuzhi，Gao Junfeng，et al
（Dept of Oncology，The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230061）

Objective To investigate the effect of miRNA21 inhibitor on the apoptosis of esophageal cancer cell line EC109.Methods The expression of miRNA21 in 20 cases of esophageal cancer and adjacent tissues was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.miRNA21 inhibitor was transfected into human esophageal cancer cell line EC109.Caspase 3 activity was analyzed by Caspase 3 activity test kit，DNA fragment changes were measured by DNA fragment detection kit.Western blot was used to detect Caspase 3 and Bcl-2 expression.Results Real-time fluorescence quantitative PCR results showed that compared with adjacent tissue to carcinoma，miRNA21 expression in esophageal cancer tissues increased significantly.Caspase 3 activity and DNA fragment analysis indicated that miRNA21 inhibitor could significantly increase the EC109 cells apoptosis.Western blot showed that Caspase 3 expression was significantly up-regulated and Bcl-2 expression was significantly down-regulated in esophagus cancer EC109 cells transfected with miRNA21 inhibitor.Conclusion The occurrence of esophageal carcinoma may be related to the high expression of miRNA21.miRNA21 inhibitor may induce apoptosis of human esophageal cancer cell EC109 by down regulating the expression of Bcl-2.

esophageal carcinoma；apoptosis；miRNA21；Bcl-2

R 735.1

A

1000-1492（2016）08-1124-04

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.022.html

2016-05-04 接收

安徽省自然科學基金（編號：1608085MH182）

1安徽醫科大學第三附屬醫院腫瘤科，合肥 230061

2安徽醫科大學第一附屬醫院普外科，合肥 230022

李紅霞，女，副主任醫師；

鮑揚漪，女，主任醫師，責任作者，E-mail：1262074653@qq. com