TSC1在肝纖維化中的表達及基因甲基化

陳 晨，黃 成，孟曉明，李 俊

TSC1在肝纖維化中的表達及基因甲基化

陳 晨1，2，黃 成1，2，孟曉明1，2，李 俊1，2

目的 通過檢測在大鼠肝纖維化模型及轉化生長因子-β1（TGF-β1）刺激的大鼠肝星形細胞（HSC）T6中結節(jié)性硬化癥（TSC）相關蛋白錯構素（hamartin）的表達，并檢測HSC T6細胞TSC1基因啟動子甲基化狀態(tài)，探討肝纖維化疾病治療的新靶點。方法 構建大鼠肝纖維化模型，培養(yǎng)HSC T6細胞。利用Western blot法檢測hamartin蛋白表達，利用焦磷酸測序檢測TSC1啟動子甲基化。結果 與正常對照組比較，肝纖維化模型組TSC1蛋白表達量較小（P＜0.01），且TSC1基因啟動子甲基化程度較高。結論 TSC1可能與肝纖維化形成有一定關聯(lián)。

TSC1；肝纖維化；甲基化

肝纖維化是許多慢性肝病發(fā)展到肝硬化的中間過渡階段，其中有25%～40%最終發(fā)展成為肝硬化，更嚴重的發(fā)展為肝癌。肝臟的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的合成和降解不平衡，而導致纖維結締組織的過度沉積，是肝纖維化的主要病理表現(xiàn)［1］。HSCs的激活與增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展其中的中心環(huán)節(jié)［2］。肝纖維化的形成是受各類因素網路調控的，目前的研究［1］表明其涉及多種相關細胞因子以及諸多信號轉導通路。結節(jié)硬化癥（tuberous sclerosis complex，TSC）是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，其發(fā)病機制是由于TSC1和TSC2基因中任何一個發(fā)生變異。TSC1基因定位9q34，TSC2基因定位于16p13.3，TSC1和TSC2編碼的基因產物分別為錯構素（hamartin）和結節(jié)素（tuberin），蛋白分子量大小為130 ku與200 ku［3-4］。研究［5］顯示TSC1在腎纖維化模型中低表達，并且敲除TSC1基因的轉基因小鼠可以顯示出腎間質纖維細胞的激活以及腎纖維化。該研究旨在探討TSC1是否在肝纖維化中有表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HSC T6細胞株來自安徽醫(yī)科大學藥學院。ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司；TSC1、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和膠原蛋白Ⅰ型（Collagen typeⅠ，ColⅠ）抗體均購自美國Santa Cruz公司；DNA抽提Kit、Eppendorf管、PCR管、移液器吸頭購自美國Axygen公司；亞硫酸鹽轉化試劑盒購自德國QIAGEN公司；TSC1引物由上海英駿生物技術有限公司提供；雙蒸水、TBE購自上海希匹吉生物技術有限公司。

1.2 動物及模型制備 清潔級SD大鼠50只，雌雄不限，180～220 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為正常對照組、肝纖維化模型組，每組10只。模型組的大鼠皮下注射以橄欖油稀釋的10%CCl4（0.5 mg/kg），每周2次，正常對照組的大鼠則注射同等體積的橄欖油溶媒；將肝纖維化模型組的大鼠于第12周末處死，正常對照組的大鼠在20周末處死，迅速取出肝組織，從肝右葉中部切取肝組織兩塊，分別置于10%甲醛中固定、采用石蠟包埋并提取肝臟總蛋白。

1.3 Western blot法檢測大鼠肝組織蛋白 取各組100 mg大鼠肝臟組織，將其剪成細小的碎片，置于勻漿器中加入裂解液，研磨至肝臟組織消失。12 000 r/min離心5 min，取上清液，測定蛋白濃度。取各組蛋白提取液，并加入等體積的上樣緩沖液，混合，于100℃沸水煮沸5 min，使蛋白變性。提取各組細胞總蛋白，棄掉舊培養(yǎng)液，使用PBS清洗待處理細胞2遍，每孔加RIPA裂解液200 μl（含2 μl蛋白酶抑制劑1 mmol/L PMSF），放置在冰上裂解30 min，并收集細胞裂解懸液，于12 000 r/min冷凍離心機離心30 min后收集上清液。采用BCA法定量，取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE垂直電泳，分離蛋白質，并將樣品蛋白從凝膠轉移至PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h。TBST洗膜3次，每次10 min，分別使用β-actin、TSC1、α-SMA和ColⅠ抗體4℃孵育過夜（稀釋濃度為1∶1 000），再用TBST洗膜3次，每次約10 min，對應加入二抗山羊抗鼠和抗兔（稀釋比均為1：10 000）室溫孵育1 h，TBST洗膜3遍后，最后加入ECL化學發(fā)光試劑顯影。

1.4 焦磷酸測序 按照Axygen DNA抽提Kit說明提取基因組DNA，并對基因組DNA進行亞硫酸鹽修飾。PCR反應體系［50 μl：H2O 8.5 μl、KAPA 2G Robust HS ReadyMix 12.5 μl、up-Primer（50 pmol/μl）1 μl、down-Primer（50 pmol/μl）1 μl、Template（DNA）2 μl］。引物設計TSC1上游引物：5′-GGGATTGTGAGGTAAATAGTTGAG-3′；TSC1下游引物：5′-CCCTACCAAACAAATAAATCTCTT-3′；TSC1測序引物：5′-GGGTTTTTTGGGGTAG-3′，另PCR長度為161 bp。PCR擴增后，使用QIAGEN PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀進行測序。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析，計量數(shù)據均以±s表示；兩兩比較采用t檢驗，采用Pearson法進行相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肝臟組織的TSC1蛋白表達 使用Western blot法檢測正常對照組及肝纖維化模型組的大鼠肝臟組織的蛋白表達量。與正常對照組的大鼠肝組織比較，肝纖維化模型組的α-SMA和ColⅠ蛋白表達量明顯升高（t=7.283、9.118，P＜0.01），而TSC1蛋白的表達量明顯減小（t=15.35，P＜0.05）。見圖1。

2.2 HSC T6的TSC1蛋白表達 采用Western blot法檢測正常對照組及TGF-β1刺激組的α-SMA、ColⅠ和TSC1。與正常對照組比較，TGF-β1刺激組α-SMA、ColⅠ表達上升（t=12.60、16.49，P＜0.01），TSC1表達減少（t=4.256，P＜0.01）。見圖2。

圖1 Western blot法檢測大鼠肝臟組織的蛋白表達

2.3 TSC1啟動子甲基化焦磷酸測序 提取HSC T6細胞的基因組DNA，采用焦磷酸測序，結果見圖3。可以看到測序峰清晰。正常對照組及TGF-β1刺激組均檢測了同樣的3個位點。正常對照組3個位點Pos.1、Pos.2、Pos.3的TSC1啟動子甲基化程度分別為18.13%、16.84%、9.49%。TGF-β1刺激組3個位點的TSC1啟動子甲基化程度分別為10.73%、32.16%、0。參照文獻［6］，將甲基化程度在20%以下視為無甲基化，而20%～50%可視為低甲基化，50%以上視為高甲基化。正常對照組的Pos.1、Pos.2、Pos.3的甲基化程度均低于20%，可視為無甲基化。而TGF-β1刺激組的Pos.2甲基化程度為32.16%，高于20%，可視為低甲基化。說明TGF-β1刺激組的TSC1啟動子甲基化程度高于正常對照組。

圖3 HSC T6細胞TSC1啟動子甲基化焦磷酸測序

3 討論

肝纖維化被認為是由多種因素如肝炎病毒、酒精、血吸蟲病、毒物等長期持續(xù)損害肝臟導致的慢性炎癥反應［2］。多種信號轉導通路與細胞因子構成了調控肝纖維化的網絡。研究探索與肝纖維化形成，進展有關的新機制也是當下的熱點。

抑癌基因TSC1與TSC2分別編碼錯構素和結節(jié)素［3］。在人體大部分器官組織中，錯構素和結節(jié)素可共表達；兩者在細胞質內形成異二聚體而發(fā)揮作用，參與調節(jié)細胞生長與增殖、調節(jié)細胞周期、調節(jié)細胞內吞作用、調節(jié)細胞黏附作用、參與TGF-β/ Smad通路等［7］。肺淋巴管平滑肌瘤病、口腔鱗癌、子宮內膜癌、胰腺癌等各種腫瘤組織中的TSC1、TSC2蛋白表達低或缺失［8］。TSC1-TSC2腫瘤抑制因子位于mTOR信號通路的上游，可負調控mTOR。mTOR/p70S6K信號通路參與調節(jié)膠原蛋白的表達、細胞周期的控制、肝星狀細胞的激活與增殖，進而對肝纖維化起著至關重要的作用。Patsenker et al［9］以及Yu et al［10］發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR可以明顯減少纖維化進程。TSC1在腎纖維化模型中低表達，并且敲除TSC1基因的轉基因小鼠可以顯示出腎間質纖維細胞的激活以及腎纖維化［5］。本研究在肝纖維化模型中檢測了TSC1蛋白的表達，表明TSC1蛋白在肝纖維化模型中與正常對照組比較表達較低；并在HSC T6細胞中進行檢測，由TGF-β1刺激的HSC T6細胞表達TSC1比正常對照組低。提示TSC1的表達可能與肝纖維化有一定關聯(lián)。

蛋白質的表達受多個環(huán)節(jié)影響，如DNA的復制、轉錄、翻譯、翻譯后修飾等，任何環(huán)節(jié)的一絲差錯都會最終影響蛋白質的表達。針對TSC1蛋白在腫瘤組織中低表達的現(xiàn)象，研究［3］表明TSC1基因突變及雜合性缺失都可影響其蛋白質表達。至今大約有超過400篇關于TSC的基因突變、基因缺失等報道，研究［11］顯示人乳腺癌中TSC1蛋白表達低于正常組織，并且TSC1基因啟動子的甲基化程度高于正常組織。DNA甲基化屬于表觀遺傳學，是基因表型改變形式之一。正常的甲基化在維持細胞及機體的正常功能中有著十分重要的作用，但是異常的甲基化則會參與引發(fā)多種疾病，如各種腫瘤，自身免疫疾病等等。本研究檢測了TSC1基因在HSC T6細胞中的甲基化程度，顯示由TGF-β1刺激的HSC T6細胞的TSC1基因某位點甲基化程度為32.16%，高于20%，可視為低甲基化。而檢測的正常對照組各位點的甲基化程度均低于20%，可視為無甲基化。這有可能是肝纖維化模型組及TGF-β1刺激的HSC T6細胞表達TSC1蛋白低的原因。雖然這可能不是TSC1蛋白表達低的唯一原因，但是肯定也是有著十分緊密的關聯(lián)。

本研究表明肝纖維化中TSC1蛋白表達比正常對照組低，并且檢測到由TGF-β1刺激的HSC T6細胞表達TSC1比正常對照組低。并采用焦磷酸測序實驗揭示了TSC1基因啟動子甲基化有可能是這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因。有關TSC1基因啟動子甲基化的具體機制和具體作用，目前還沒有相關報道，有待進一步的研究。本研究為肝纖維化的形成提供了新的可能機制，并為治療肝纖維化提供了新的作用靶點。

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The expression and the DNA methylation of TSC1 in liver fibrosis

Chen Chen1，2，Huang Cheng1，2，Meng Xiaoming1，2，et al
（1School of Pharmacy，Anhui Medical University，
2Institute for Liver Disease of Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To explore the expression and the promoter methylation status of the TSC1 in HSC T6 differentiation induced by transforming growth factor β1（TGF-β1）in vitro，and the expression of the TSC1 in CCl4-induced liver fibrosis in rat.Methods Western blot was used to detect the expression of the TSC1.Pyrosequencing was used to test the methylation status of the TSC1 promoter.Results The expression of TSC1was significantly reduced in response to TGF-β1 and CCl4（P＜0.01），and the TGF-β1 treated group TSC1 promoter was found to be higher methylated than the control group.Conclusion A novel evidence has been provided that TSC1，which may be affected by DNA methylation in TGF-β1 treated HSC T6，may play a vital role in liver fibrosis.

TSC1；liver fibrosis；methylation

R 34

A

1000-1492（2016）08-1132-04

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.026.html

2016-04-14 接收

國家自然科學基金（編號：81273526、81473268）；安徽省科技攻關項目（編號：1301042212）

1安徽醫(yī)科大學藥學院，2安徽醫(yī)科大學肝病研究所，合肥230032

陳 晨，女，碩士研究生；

李 俊，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lj@ahmu.edu.cn