RNA干擾沉默基質交感分子1減輕H9C2細胞低氧/復氧損傷

郟紅靜，吳繼雄，王曉晨，許邦龍

RNA干擾沉默基質交感分子1減輕H9C2細胞低氧/復氧損傷

郟紅靜，吳繼雄，王曉晨，許邦龍

目的 探討沉默基質交感分子1（STIM1）對H9C2心肌細胞低氧/復氧損傷的影響。方法 培養H9C2心肌細胞，建立心肌細胞低氧/復氧（H/R）模型，STIM1-siRNA轉染H9C2心肌細胞以下調STIM1表達。流式細胞術檢測各組細胞凋亡率，Western blot法檢測各組STIM1及凋亡相關蛋白表達情況。結果 與對照組比較，H/R組的STIM1表達量明顯增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2蛋白比率增高，Caspase-3上調，細胞凋亡率增加（P＜0.05）。STIM1-siRNA轉染能顯著下調STIM1基因的表達（P＜0.05），減少細胞內Ca2+濃度，并且Bax/Bcl-2比率降低，Caspase-3表達下調，細胞凋亡率明顯下降（P＜0.05）。結論 心肌細胞發生缺血再灌注時STIM1表達量明顯增加，STIM1-siRNA轉染下調STIM1基因的表達可以減輕低氧/復氧引起的心肌細胞凋亡。

H9C2心肌細胞；低氧/復氧；凋亡；基質交感分子1

急性心肌梗死是嚴重危害人類健康的常見病。再灌注治療通過恢復缺血組織的供血有效地挽救缺血組織，是治療心肌梗死的最主要措施。但心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）的存在，一定程度上限制了再灌注治療的療效［1-2］。鈣超載在MIRI引起的細胞凋亡過程中發揮著重要作用［3］。基質交感分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）是鈣庫操作性鈣離子通道（store-operated calcium entry，SOCE）的主要組成部分，通過調控SOCE從而影響細胞內鈣離子濃度的變化，進而調控細胞的生物學行為［4］。該研究利用H9C2心肌細胞建立心肌細胞低氧/復氧模型，從而模擬心肌細胞的缺血再灌注，觀察在心肌細胞發生缺血再灌注時STIM1表達量的變化，同時利用siRNA技術沉默STIM1的表達以探討其對低氧/復氧H9C2心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 H9C2心肌細胞株（中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；DMEM高糖培養基（美國Hyclone公司）；胰蛋白酶（中國Biosharp公司）；DMEM低糖培養基、Opti-MEM培養基（美國Gibco公司）；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物技術有限公司）；STIM1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（美國Cell Signaling Technologies公司）；β-actin、過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及超敏ECL化學發光試劑盒（上海碧云天公司）；PVDF膜（美國密理博公司）；STIM1-siRNA和scramble siRNA（即陰性對照組）（上海吉凱公司）；RT-PCR試劑盒、脂質體LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）。

1.2 siRNA構建及驗證 采用Block-iT RNAi Designer系統設計針對STIM1的stealth-siRNA，由上海吉凱公司設計并合成3條siRNA，見表1。該3條siRNA的干涉效率采用Western blot及RT-PCR檢測，將細胞隨機分成5組（n=8），即空白對照組、scramble siRNA組（陰性對照組）、siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組。

表1 各基因引物序列和基因片段長度

1.3 H9C2心肌細胞的培養及低氧/復氧模型的建立 細胞培養基為含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養基。細胞置于37℃、5%CO2和95%的空氣培養箱中，培養48 h換液，以后隔天換液1次，待細胞覆蓋率至少達到80%后用于建立低氧/復氧模型。

H9C2細胞更換含0.5%FBS、低糖DMEM培養基后在37℃、含95%N2/5%CO2的低氧培養箱中處理12 h后，更換0.5%FBS的DMEM培養基于37℃、5%CO2培養箱中進行復氧處理6 h以建立低氧/復氧模型［5］。對照組細胞在含10%FBS的DMEM完全培養基中于37℃、5%CO2培養箱中孵育18 h。

1.4 siRNA轉染細胞及實驗分組 轉染前1 d細胞被接種于6孔板中，用無雙抗的完全培養基培養，當細胞密度達到約80%時，用LipofectamineTM2000介導轉染STIM1-siRNA及scramble siRNA，按說明書操作，后將細胞置于常規37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。實驗分組：將培養的細胞隨機分成4組（n=8）：對照組、低氧/復氧組（H/R組）、低氧/復氧+STIM1-siRNA組（STIM1-siRNA組）、低氧/復氧+scramble siRNA組（scramble siRNA組）。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡變化 按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒提供的方法，收集經siRNA轉染48 h處理后的上清懸浮的細胞，同時用不含EDTA的胰酶消化貼壁的細胞后，收集細胞，2 000 r/min離心5 min，棄培養基，用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌2次。使用400 μl 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度約為1 ×106個/ml。在細胞懸浮液中加入5 μl Annexin VFITC，輕輕混勻后于室溫避光反應5～15 min。再加入10 μl PI混勻后于室溫避光反應5～15 min。在1 h內用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.6 Fluo3-AM熒光探針檢測細胞內Ca2+濃度

將H9C2心肌細胞接種在培養皿中培養。將細胞分為對照組、H/R組、STIM1-siRNA組及scramble siRNA組。處理結束后各組加入10 μmol/L的Fluo3-AM，37℃孵育60 min后激光共聚焦顯微鏡掃描熒光強度（德國Carl-Zeiss公司）。Image-Pro Plus 6.0軟件（美國Silver-Spring公司）獲取圖像并分析熒光強度。

1.7 RT-PCR法檢測STIM1 mRNA的水平 TRIzol法提取細胞總RNA，驗證其純度和完整性符合要求后進行逆轉錄，逆轉錄條件為30℃、10 min，42℃、60 min以及85℃、10 min。采用逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）以逆轉錄獲得的cDNA為模板，β-actin為內參進行RT-PCR反應。STIM1上游引物：5′-ACTCTCCGGAAGCAGCTAGA-3′，下游引物：5′-CCTTCGACAACCGAAGGTCA-3′。β-actin上游引物：5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCG-3′，下游引物：5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3′。逆轉錄條件為95℃、5 min，95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、32 s讀板，40個循環。反應體系20 μl，PCR結果采用2-ΔΔCt法進行定量比較，β-actin為內參。

1.8 Western blot法檢測STIM1-siRNA轉染效率及凋亡相關蛋白的表達情況 總蛋白樣本的提取：向每瓶培養的心肌細胞內加入400 μl含PMSF的裂解液，在冰上裂解30 min后于4℃、13 000 r/min離心5 min。將離心后含有蛋白的上清液分裝收集放置-20℃冰箱中保存，利用BCA法測定蛋白含量并制作標準曲線。使用10%SDS-PAGE膠電泳分離蛋白質，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，之后孵一抗4℃過夜。用TBST漂洗后于37℃孵育二抗2 h，洗膜后用ECL試劑盒顯影，對膠片進行掃描，凝膠圖象處理系統分析結果。

1.9 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，各組間進行單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗。若方差不齊則進行非參數分析（Kruskal-Wallis H檢驗），組間多重比較采用Tamhane法。

2 結果

2.1 siRNA對H9C2心肌細胞STIM1 mRNA和蛋白表達的影響 RT-PCR和Wetsern blot結果顯示，與空白對照組比較，陰性對照組對H9C2心肌細胞STIM1表達的影響差異無統計學意義。3條siRNA中，以siRNA3對STIM1表達的抑制效率最高，與空白對照組比較，siRNA3使得心肌細胞STIM1 mRNA表達量下降了71%，蛋白表達量減少了69%。見圖1。

2.2 各組H9C2心肌細胞STIM1的表達 Western blot結果顯示，各組STIM1的表達差異有統計學意義（χ2=26.214，P＜0.001）。其中，與對照組比較，H/R組STIM1表達量增加了3.75倍（P＜0.05），STIM1-siRNA組的STIM1蛋白表達水平較H/R組和scramble siRNA組明顯降低，分別為0.2倍和0.21倍（P＜0.001），而scramble siRNA組的STIM1蛋白表達水平與H/R組間的差異無統計學意義（P=0.948）。見圖2。

圖1 siRNA對H9C2心肌細胞STIM1 mRNA和蛋白表達的影響（n=10）

圖2 STIM1在各組H9C2心肌細胞中的表達情況（n=8）

2.3 STIM1-siRNA轉染后H9C2心肌細胞凋亡的變化 流式細胞術檢測細胞凋亡變化提示各組細胞凋亡率差異有統計學意義（χ2=26.591，P＜0.001）。對照組細胞凋亡率只有（0.1±0.01）%；與對照組比較，H/R組凋亡的細胞增多，細胞凋亡率達（33.5±5.80）%（P＜0.001）；STIM1-siRNA組細胞凋亡率為（6.9±0.94）%，較H/R組降低（P＜0.001）；scramble siRNA組細胞凋亡率為（35.3± 4.10）%，與H/R組比較差異無統計學意義（P= 0.897）。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測各組心肌細胞凋亡變化

2.4 STIM1-siRNA轉染對H9C2心肌細胞Ca2+濃度的影響 各組細胞熒光強度差異有統計學意義（F=278.808，P＜0.001），Ca2+濃度的差異有統計學意義。與對照組比較，H/R組心肌細胞內Ca2+濃度明顯增加（P＜0.001），熒光強度是對照組的2.93倍；而通過STIM1-siRNA轉染下調STIM1表達后，能抑制低氧/復氧導致的這一作用，熒光強度為H/ R組的0.35倍（P＜0.001）。H/R組與scramble siRNA組比較，差異無統計學意義（P=0.948）。見圖4。

圖4 STIM1-siRNA轉染對H9C2心肌細胞Ca2+濃度的影響

2.5 STIM1-siRNA轉染對H9C2心肌細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的影響 Western blot結果顯示，各組間Bcl-2（χ2=27.606，P＜0.001）、Bax（χ2=26.647，P＜0.001）和cleaved-Caspase-3（χ2= 24.589，P＜0.001）差異有統計學意義，Bax/Bcl-2（χ2=26.241，P＜0.001）差異有統計學意義。其中，與對照組比較，H/R組心肌細胞內Bax（P＜0.001）和Caspase-3（P＜0.001）的表達明顯增加，Caspase-3是對照組的3.75倍。Bcl-2表達下降（P＜0.001），Bax/Bcl-2是對照組的5.24倍；而通過STIM1-siRNA轉染下調STIM1表達后，能抑制低氧/復氧導致的這一作用，Caspase-3為H/R組的0.22倍（P＜0.001），Bax/Bcl-2為H/R組的0.35倍（P＜0.001）。H/R組與scramble siRNA組比較，差異無統計學意義（P=0.887）。見圖5。

圖5 Western blot法檢測各組中Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達情況（n=8）

3 討論

本實驗利用H9C2心肌細胞株建立心肌細胞低氧/復氧模型，從而模擬心肌細胞的缺血再灌注，觀察到心肌細胞發生缺血再灌注時STIM1表達量明顯增加，隨后用siRNA-STIM1轉染沉默STIM1基因的表達后，可見STIM1-siRNA組較H/R組和scramble siRNA組的STIM1表達量明顯減少，凋亡率明顯減低，凋亡相關蛋白含量明顯下降，這與Zhang et al［6］在動物實驗腦缺血模型中發現的結果相似，提示STIM1參與了MIRI，而抑制STIM1的表達可以減輕再灌注損傷引起的細胞凋亡。

凋亡是生理性或某些因素誘發的有程序的細胞自主生化過程，在MIRI過程中扮演著重要角色［7］。Bcl-2家族蛋白在調節細胞凋亡中發揮關鍵作用，這些蛋白質包括促細胞凋亡的Bax和抑制細胞凋亡的Bcl-2等，這些誘導或抑制凋亡的蛋白相互作用，形成了一個復雜的調控網絡，而這個網絡中促凋亡和抗凋亡蛋白的比率決定細胞的存活或者死亡［8］，Bax/Bcl-2比例增高，細胞凋亡明顯增加［9］。Caspase-3被認為是細胞凋亡過程中的主要執行者［10］。故Bcl-2、Bax/Bcl-2、Caspase-3是反映凋亡的經典指標。本實驗結果表明，與對照組比較，H9C2細胞經歷12 h低氧和6 h復氧后凋亡率顯著增加，說明體外細胞低氧/復氧模型的建立是成功的。Western blot結果顯示Bax/Bcl-2比例增高，cleaved-Caspase-3顯著上調。siRNA抑制STIM1基因的表達可以顯著降低細胞凋亡率及Bax/Bcl-2的比例，并使Caspase-3表達下調，從而說明了STIM1基因沉默可以抑制低氧/復氧損傷引起的心肌細胞凋亡。

STIM1是存在于內質網膜上的I型跨膜蛋白，是內質網鈣離子濃度的感受器和SOCE的核心蛋白之一，其結構中包含一段長約100個氨基酸序列的具有活化功能的結構域即SOAR。當內質網內的Ca2+消耗之后，該結構域能夠激活Orai通道，引起SOCE通路的開放及Ca2+內流［4，11-12］。當鈣庫內的Ca2+得到補充后，STIM1蛋白迅速地從內質網-細胞膜偶聯中解離出來，Orai蛋白也隨之失活，最終SOCE通路關閉［13］。Zhang et al［6］發現，SOCE參與了腦缺血損傷，在此過程中STIM1和Orai表達均增加，而用siRNA抑制STIM1表達可以下調Orai的含量，減少神經元細胞內Ca2+濃度，改善腦功能。本研究顯示低氧/復氧損傷可導致H9C2細胞內Ca2+濃度顯著增加，用siRNA抑制STIM1表達可以減少H9C2細胞內Ca2+濃度，與上述研究結果一致。因此，推測抑制STIM1的表達，可能是通過減少Ca2+內流而減輕低氧/復氧損傷中細胞的凋亡的。

綜上所述，通過本實驗研究顯示心肌細胞發生缺血再灌注時STIM1表達明顯增加，siRNA沉默STIM1基因的表達可以減少低氧/復氧損傷所致的心肌細胞Ca2+濃度的增加和細胞的凋亡，并下調凋亡相關蛋白的表達。未來將在動物模型中進一步探討STIM1影響MIRI的機制，希望為臨床減少缺血再灌注損傷提供新的思路。

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Inhibition of stromal interaction molecule 1 attenuates hypoxia/reoxygenation induced apoptosis in H9C2 cells

Jia Hongjing，Wu Jixiong，Wang Xiaochen，et al
（Dept of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the role of stromal interaction molecule 1（STIM1）in apoptosis of H9C2 cardiomyocytes after hypoxia/reoxygenation（H/R）injury.Methods H9C2 cardiomyocytes were cultured，the model of H/R injury was established.STIM1-siRNA was transfected into H9C2 cardiomyocytes to implement RNA interference.The apoptotic rate was detected by flow cytometry.Western blot analysis was used to detect the expressions of STIM1 and the apoptosis related proteins in each group.Results Compared with the control group，the expression of STIM1 was markedly increased in H/R group（P＜0.05），Bax/Bcl-2 was increased and the expression of Caspase-3 was up-regulated.Meanwhile，the apoptotic rate was increased（P＜0.05）.However，inhibition of STIM1 through transfection of STIM1-siRNA resulted in significantly decreased expression of STIM1（P＜0.05）and reduced influx of calcium，the ration of Bax/Bcl-2 was decreased and the expression of Caspase-3 was down-regulated，the apoptotic rate was also reduced（P＜0.05）.Conclusion The expression of STIM1 is significantly increased when cardiomyocytes suffered from the H/R injury.Inhibition of STIM1 through transfection of STIM1-siRNA can decrease the myocardial apoptosis after H/R injury.

H9C2 cells；hypoxia/reoxygenation injury；apoptosis；stromal interaction molecule 1

A

1000-1492（2016）08-1136-06

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.028.html

2016-04-19 接收

安徽醫科大學臨床科學研究項目（編號：2015xkj112）

安徽醫科大學第二附屬醫院心血管內科，合肥 230601

郟紅靜，女，碩士研究生；

吳繼雄，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：wjx8261@163.com

R 322.11；R 845.22