新型吡啶氮芥類化合物的合成及其抗微生物活性研究

曹守瑩，白長存，陶兆林，梁麗麗

新型吡啶氮芥類化合物的合成及其抗微生物活性研究

曹守瑩1，白長存2，陶兆林1，梁麗麗

目的 以2，6-二甲基吡啶為起始原料，經氧化、酯化、還原、氯化、N-烷基化等多步反應合成了吡啶雙氮芥類化合物及其鹽酸鹽、硝酸鹽。方法 目標化合物的結構經1H NMR、IR、MS和元素分析證實。結果 體外抗菌、抗真菌活性研究表明：所測試的大多數化合物均可有效抑制被測微生物的生長，且目標化合物對金黃色葡萄球菌表現出很強的專一選擇性抑制作用，活性與臨床藥物相當或優于臨床藥物。其中吡啶雙氮芥化合物7、8a和8b對金黃色葡萄球菌的選擇性抑制作用顯著，與參照藥物氯霉素相當，吡啶雙酰胺氮芥化合物11對金黃色葡萄球菌的抑制能力是氯霉素的兩倍。結論 此類化合物有望作為潛在的抗金黃色葡萄球菌先導化合物，值得進一步研究其構效關系。實驗培養得到了中間體產物6的晶體結構，單晶X射線衍射測試表明6的晶體結構屬正交晶系P21212空間群。

氮芥；吡啶；抗細菌；抗真菌

氮芥類藥物是一類有β-氯乙胺結構的化合物，因有廣泛的生物活性和重要的藥理活性如抗細菌［1］、抗真菌［2］、抗腫瘤［3-5］、抗病毒［6］等而備受關注。氮芥類藥物也是臨床上應用較早的一類重要的化學合成抗癌藥，迄今為止仍被用于治療各類惡性腫瘤，在抗癌藥物中占有重要的地位［7］。近年來隨著研究的深入，結構修飾后的氮芥類化合物也呈現出優異的抗微生物活性［2］，在醫藥領域顯示出寬廣的應用前景，其相關研究與開發也漸趨活躍、發展迅速。吡啶及其衍生物作為一種重要的芳氮雜環類化合物，在多種天然產物的母體結構中廣泛存在。吡啶類化合物還是化學工業，特別是精細化工行業的重要原料［8］，應用范圍涉及醫藥中間體、農藥等多個領域，而在醫藥領域，如抗菌、抗癌、抗病毒等方面也發揮著重要作用［9-11］。研究［12-13］表明，在藥物結構中引入吡啶環可以有效地調節藥物的脂水分配系數和酸堿平衡常數。近年來，將氮芥類化合物的烷基化部分和吡啶環構筑于同一分子結構中的化合物鮮見文獻報道。因此基于國際、國內抗微生物藥物研發的新趨勢，該研究采用藥物設計活性基團拼合原理，將氮芥類藥物的藥效團β-氯乙胺和吡啶環構筑于同一分子結構中，首次設計合成了幾個結構新穎的吡啶氮芥類化合物，并進行了抗微生物活性測試，對其構效關系作了初步研究。合成路線如圖1所示，所合成的目標化合物均未被文獻報道。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 熔點儀：X-6型精密顯微熔點測定儀（溫度未校正）；Bluker SMART APEXⅡ-CCD X射線單晶衍射儀；紅外光譜儀：Bio-Rad FTS-185，Bruker RFS100/S（KBr壓片）；核磁共振儀：Bruker AV 300核磁共振儀（TMS內標）；質譜儀：LCMS-2010A（ESI電離源）；元素分析儀：Carlo Erba1106型元素分析儀。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈、THF等試劑均為市售分析純；硅膠：青島海洋化工廠200-300目、300-400目；TLC薄層層析硅膠板HSGF 254型；2、6-二甲基吡啶、二乙醇胺（成都科龍化工有限公司）；氟康唑、氯霉素（珠海嘉成生物科技有限公司）；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、嗎啡啉丙磺酸、瓊脂、酵母浸膏等（北京奧博星生物技術有限公司）；RMPI 1640（美國Gibco BRL公司）。

1.1.3 體外抗微生物活性測試用細菌和真菌 體外抗微生物活性測試的細菌包括3株革蘭陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）、耐甲氧西林金葡菌（MRSA N 315）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ATCC 21216）；3株革蘭陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 8099）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）和變形桿菌（Bacillus proteus ATCC 13315）；2株真菌：白色念珠菌（Candida albicans ATCC 76615）和假絲酵母菌（Candida mycoderma ATCC 96918）。

1.2 合成及結構表征

1.2.1 中間體2，6-吡啶二甲酸（2）的合成 把2，6-二甲基吡啶1（10.7 g，0.1 mol）溶于500 ml水中，17 h內分8次加入KMnO4（41.6 g，5.3 mol）。待反應原料2，6-二甲基吡啶反應完畢后，過濾，濾液濃縮至150 ml，加入30 ml濃鹽酸。將混合液加熱至沸騰使濃縮出來的固體充分溶解，然后慢慢使其自然冷卻到室溫，在5℃條件下低溫保存過夜，2，6-吡啶二甲酸慢慢析出。過濾混合液，得到2，6-吡啶二甲酸的白色固體，用30 ml冷水洗滌固體，空氣干燥，收率62%，m.p.255～257℃。

1.2.2 中間體2，6-吡啶二甲酸甲酯（3）的合成

2，6-吡啶二甲酸2（10.1 g，0.06 mol）和50 ml SOCl2置于150 ml燒瓶中，加熱回流10 h，剩余SOCl2蒸餾除去。冰浴下冷卻殘留物10 min，撤去干燥管，滴液漏斗緩慢逐滴滴入250 ml無水甲醇，撤去冰浴，加熱使反應體系回流反應30 min，停止反應，蒸餾去除150 ml甲醇，冰浴冷卻反應體系，化合物2，6-吡啶二甲酸甲酯3析出，繼續用甲醇洗去其上雜質，收率93.7%，m.p.119～122℃。

1.2.3 中間體2，6-二羥甲基吡啶（4）的合成 2，6-

吡啶二甲酸甲酯3（11.3 g，0.06 mol）和250 ml無水乙醇置于50 ml燒瓶中，冰浴下攪拌冷卻15 min，撤去干燥管，分數次緩慢加入硼氫化鈉（13 g，0.35 mol），加上干燥管，0℃繼續反應1 h。撤去冰浴，加熱使反應體系升溫至251℃，反應3 h，繼續加熱至回流反應10 h，停止反應。蒸餾去除溶劑后加入100 ml丙酮，繼續加熱回流1 h，停止反應，減壓蒸餾去除溶劑，將殘留物溶解于400 ml水中，用氯仿萃取水溶液12 h，得到化合物2，6-羥甲基吡啶4的白色固體，收率66%，m.p.117～119℃。

1.2.4 中間體2，6-二氯甲基吡啶（5）的合成 氮氣保護下，在250 ml圓底燒瓶中加入新蒸的干燥四氫呋喃（100 ml）和化合物4（8.79 g，0.06 mol），冰浴攪拌下冷卻10 min，用滴液漏斗緩慢逐滴滴入15 ml SOCl2，0℃繼續反應30 min。撤掉冰浴，反應體系緩慢升溫至室溫后加熱回流8 h，停止反應。加入甲苯共沸除去過量SOCl2，得到產物2，6-二氯甲基吡啶的白色鹽酸鹽固體。把5的鹽酸鹽固體溶解于200 ml水中，加入飽和NaHCO3溶液調pH至8，化合物5析出，過濾水洗，用石油醚重結晶得到無色針狀純凈的2，6-二氯甲基吡啶5，收率53%，m.p.74～75℃。

1.2.5 中間體2，2′，2″，2?｛吡啶-2，6-二取代［雙（亞甲基）雙（脲三基）］｝四醇（6）的合成 在100 ml圓底燒瓶中加入乙腈（15 ml）、化合物5（1.76 g，0.01 mol）和二乙醇胺（3.16 g，0.03 mol），混合均勻后50℃攪拌過夜反應，TLC跟蹤監測至反應完畢，停止反應。冷卻反應體系，反應混合液旋蒸去溶劑，殘留物加入飽和NaHCO3溶液洗滌，氯仿萃取，有機層用MgSO4干燥，旋蒸去溶劑乙腈，殘余物經硅膠柱色譜，得目標產物白色固體，收率95%，m.p. 45～47℃。IR（KBr）：ν 3389（OH），3009（Ar-H），2933，2887，2831，1592，1577，1446，1385，1338，1156，824，464 cm-1；1H NMR（CDCl3，300 MHz）：δ 7.59～7.64（t，1H，J=15 Hz，Py 4-H），7.06～7.09（d，2H，J=9 Hz，Py 3-H，5-H），3.76（s，4H，PyCH2N），3.60～3.63（t，8H，J=9 Hz，CH2OH），2.68～2.72（t，8H，J=12 Hz，NCH2）ppm；13C NMR（CDCl3，75 MHz）δ：161（pyridine 2-C），137（thienyl 4-C），122（thienyl 3-C），63（pyridine-CH2），59（NCH2），41.5（CH2Cl）ppm。

1.2.6 目標化合物N，N′-［吡啶-2，6-二取代雙（亞甲基）］雙［2-氯-N-（2-氯乙基）乙胺］（7）的合成［14］

氮氣保護下，在150 ml圓底燒瓶中加入新蒸的干燥四氫呋喃（50 ml）和化合物6（1.3 g，0.04 mol），冰浴攪拌下冷卻10 min。撤去干燥管，滴液漏斗緩慢逐滴滴入5 ml SOCl2，0℃繼續反應30 min。撤掉冰浴，反應體系緩慢升溫至室溫后加熱回流8 h，停止反應。除去過量SOCl2，殘留物加入飽和NaHCO3溶液洗滌，氯仿萃取，有機層用水和飽和食鹽水洗滌完畢后用Na2SO4干燥。減壓蒸餾去氯仿，殘余物經硅膠柱色譜（展開劑：石油醚/乙酸乙酯，v/v，2/ 1），得到目標產物無色油狀液體，收率53%。IR（KBr）：ν 3004（Ar-H），2961，2847，1681，1620，1442，1363，1163，815，659 cm-1；1H NMR（CDCl3，300 MHz）：δ 7.65～7.70（t，1H，J=15 Hz，Py 4-H），7.40～7.42（d，2H，J=9 Hz，Py 3-H，5-H），3.89（s，4H，PyCH2N），3.52～3.57（t，8H，J=9 Hz，CH2OH），2.97～3.02（t，8H，J=12 Hz，NCH2）；13C NMR（CDCl3，75 MHz）δ：158.2（pyridine 2-C），137.5（thienyl 4-C），121.0（thienyl 3-C），60.1（pyridine-CH2），56.3（NCH2），42.1（CH2Cl）ppm。

1.2.7 目標化合物2，6-雙｛［雙（2-氯乙基）氨基］甲基｝吡啶鹽酸鹽（8a）的合成 在100 ml圓底燒瓶中加入甲醇（5 ml）和化合物7（0.77 g，0.002 mol），室溫攪拌下逐滴滴加4 mol/L的鹽酸（2 ml），30℃繼續反應24 h。TLC跟蹤監測至原料點消失，停止反應。減壓蒸餾除去過量鹽酸，得到目標產物棕色固體，收率76%，m.p.212～215℃。1H NMR（CDCl3，300 MHz）：δ 8.65～8.73（t，1H，J=15 Hz，Py 4-H），7.76～7.91（d，2H，J=6 Hz，Py 3-H，5-H），4.99（s，4H，PyCH2N），4.52～4.55（t，8H，J= 9 Hz，CH2OH），3.27～3.31（t，8H，J=12 Hz，NCH2）ppm。

1.2.8 目標化合物2，6-雙｛［雙（2-氯乙基）氨基］甲基｝吡啶硝酸鹽（8b）的合成 在100 ml圓底燒瓶中加入乙酸乙酯（5 ml）、氯仿（5 ml）和化合物7（0.77 g，0.002 mol），室溫攪拌下逐滴滴加4 mol/L的硝酸（1 ml），30℃繼續反應24 h。TLC跟蹤監測至原料點消失，停止反應。減壓蒸餾除去過量鹽酸，得到目標產物棕色固體，收率72%，m.p.218～221℃。1H NMR（CDCl3，300 MHz）：δ 7.65～7.70（t，1H，J=15 Hz，Py 4-H），7.40～7.42（d，2H，J= 6 Hz，Py 3-H，5-H），3.89（s，4H，PyCH2N），3.52～3.57（t，8H，J=9 Hz，CH2OH），2.97～3.02（t，8H，J=12 Hz，NCH2）ppm；MS m/z：449［M+H-2HCl］+。

1.2.9 中間體2，6-吡啶二甲酰氯（9）的合成 氮氣保護下，DMF（2 ml）慢慢加入到SOCl2（10 ml）中，室溫下攪拌10 min后，加入2，6-吡啶二甲酸（3.34 g，0.02 mol），回流反應4 h。體系冷卻至室溫后，加入甲苯共沸除去過量SOCl2，殘留物真空干燥后得到化合物9的粗品，不必純化，直接投入下步反應。收率約61%，m.p.55～58℃。

1.2.10 中間體二（2-氯乙基）胺鹽酸鹽（10）的合成 在圓底燒瓶中加入氯仿（20 ml）和二乙醇胺（21 g，0.2 mol），冰浴冷卻反應體系10 min，逐滴加入SOCl2（25 ml）。撤掉冰浴，室溫下反應1 h后回流過夜反應。反應完畢后加入甲苯共沸除去過量SOCl2，殘留物用丙酮重結晶，得到二（2-氯乙基）胺鹽酸鹽的白色固體，收率63%，m.p.216～218℃。

1.2.11 目標化合物N2，N2，N6，N6-四（2-氯乙基）吡啶-2，6-二甲酰胺（11）的合成 氮氣保護、冰浴0～5℃條件下，在100 ml圓底燒瓶中加入化合物9（1.02 g，0.005 mol）、化合物10（1.42 g，0.01 mol）和15 ml干燥的THF，滴液漏斗緩慢逐滴滴入三乙胺（4 ml），繼續反應30 min。讓反應體系自然升到室溫，繼續反應30 h。停止反應，加入20 ml乙酸乙酯，硅藻土過濾，濾液旋蒸去溶劑，殘余物經硅膠柱色譜（展開劑：石油醚/乙酸乙酯，v/v，1/1），得到目標產物棕油狀液體，收率46%。IR（KBr）ν：2967，2852（CH3，CH2），1683（C=O），1257（C-N），1154 cm-1；1H NMR（CDCl3，300 MHz）：δ 7.95～8.01（t，1H，J=20 Hz，Py 4-H），7.79～7.81（d，2H，J= 9 Hz，Py 3-H，5-H），3.89～3.85（t，J=12.0 Hz，8H，CH2Cl），3.68（bs，8H，CONCH2）ppm。

圖1 吡啶氮芥類化合物的合成

2 結果

2.1 合成部分 在制備目標化合物的過程中，意外得到了中間體6的單晶，挑選出一個合適尺寸的完美單晶，并對其進行了X-射線衍射測試。

化合物6的橢球圖見圖2，其晶胞堆積見圖3。單晶X射線衍射測試表明6的晶體結構屬正交晶系P21212空間群，分子式為C15H27N3O4，晶胞參數為a=9.145（6）?，b=10.716（7）?，c=8.292（5）?，V=812.6（9）?3，Z=2。分子結構顯示，化合物6的分子位于二重軸上，最小的不對稱單元含半個分子，其中的一個N原子和一個C原子位于旋轉軸上。吡啶環是氫鍵的受體，而兩個羥基的O原子是氫鍵供體，形成了分子內的O—H···N和分子間的O—H···N，這樣形成了一個閉合的氫鍵籠子。氫鍵數據顯示，分子之間分子間的O—H·· ·N氫鍵相互作用有助于晶體的堆積形成。化合物6的更多的詳細數據和精修參數，見輔助材料［15］。

圖2 化合物6的晶體結構

2.2 抗微生物活性部分 中間體及目標化合物的體外抗細菌、抗真菌活性數據見表1、表2。抗微生物活性測試所采用的藥敏實驗方法是美國國家實驗室標準委員會（NCCLS）推薦的標準方法［16］，選擇氯霉素和氟康唑作為參考對照藥物，并用最小抑制濃度（MIC，μg/ml）來表征化合物抗菌能力的大小。對照藥物氯霉素是早期抗菌藥，治療淺表細菌感染的常用藥物，而氟康唑是強效抗真菌藥物，選擇這兩種藥作為對照藥具有一定的代表性。

體外抗細菌結果表明：目標化合物及中間體對所測細菌表現出不同程度的抑制活性，其中吡啶雙氮芥化合物7、8a和8b對金黃色葡萄球菌的選擇性抑制作用顯著，MIC值為4 μg/ml，抑制活性與參照藥物氯霉素相當。吡啶雙酰胺氮芥化合物11對金黃色葡萄球菌的抑制能力很強（MIC=2 μg/ml），活性是氯霉素的2倍。但是這些化合物對所測的大腸桿菌、枯草桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制效果普遍不佳。

圖3 化合物6沿A軸的晶胞堆積

體外抗真菌結果表明：目標化合物及中間體抗真菌的活性相比于其抗細菌活性要稍弱，部分化合物抑制活性不明顯。吡啶雙氮芥化合物7、8a、8b及11對白色念珠菌、假絲酵母菌有一定的抑制作用，MIC值為64～512 μg/ml，其中化合物11對白色念珠菌抑制活性最好，但弱于參照藥物氟康唑。

3 討論

在目標化合物的合成過程中，氯化是非常關鍵的步驟。化合物8和SOCl2反應，可以方便、迅速而高效地制備得到重要的中間體酰氯9，若想得到純凈的9可用石油醚進行重結晶。需注意的是，酰氯9不穩定，在空氣中非常容易水解變回反應物2，6-吡啶二甲酸，所以無需精制可直接投入下步反應。

目標化合物7和11的合成，即f和k兩步，對實驗操作及溶劑的要求均很高，要求在氮氣保護條件下且所用溶劑是新蒸無水溶劑，后處理過程也要迅速，否則產率過低或不能成功制備。步驟d、f、k三步使用無水非質子溶劑四氫呋喃，使反應活性和收率均比文獻［17］值有所提高。目標化合物11的制備即k步需要控制反應的投料比，酰氯9和二（2-氯乙基）胺鹽酸鹽10的比例是1∶2，因為過多的二（2-氯乙基）胺鹽酸鹽在堿性條件下不僅會發生自身親核取代，還會對11的四個氯乙基進行親核取代。另外目標化合物7和11在常溫、無氮氣保護條件下快速變質，需要在低溫、無水、無氧條件下保存，且不能長時間保存。

表1 目標化合物及中間體的抗細菌活性數據（MIC，μg/ml）

表2 目標化合物及中間體的抗真菌活性數據（MIC，μg/ml）

抗菌活性測試顯示：目標化合物7和8a對變形桿菌的抑制作用優于其他測試化合物，MIC值為128 μg/ml。所測試的大部分化合物在一定程度上能夠抑制被測微生物的生長，且目標化合物對金黃色葡萄球菌表現出很強的專一選擇性抑制作用，活性與臨床藥物相當或優于臨床藥物，因此，此類化合物有望作為潛在的抗金葡菌先導化合物，值得進一步研究其構效關系。

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Synthesis and antimicrobial evaluation of novel pyridine-derived nitrogen mustards

Cao Shouying1，Bai Changcun2，Tao Zhaolin1，et al
（1Dept of Chemistry，2Dept of Biochemistry&Molecular Biology，Bengbu Medical College，Bengbu 233030）

Objective A series of novel pyridine-derived nitrogen mustards were successfully synthesized via amulti-step sequence of oxidation，etherification，chlorination and N-alkylation.Methods The target compounds were confirmed by1H NMR，IR，MS spectra as well as elemental analyses.Results All these synthesized nitrogen mustards were evaluated for in vitro antimicrobial and fungi ctivities by two fold serial dilution technique.The antimicrobial activities indicated that most of the title compounds inhibited effectively all the tested stains in vitro and showed strongly selective inhibitory efficacy against Staphylococcus aureus with comparable or superior activity to the clinic drug.Among these compounds，pyridine-derived bis-alkyl nitrogen mustard 7 and its hydrochloride 8a and nitrateand 8b showed equivalent anti-S.aureus activities to chloramphenicol.Conclusion Pyridine-derived bisamide nitrogen mustard 11 exhibited better antibacterial activities against S.aureus than chloramphenicol，which were worthy of further investigation.A single crystal of the key intermediate 6 with suitable dimension and no crack was obtained and measured by X-ray diffraction.The structure belongs to orthorhombic system with space group P21212.

nitrogen mustard；pyridine；antibacterial；antifungal

O 622

A

1000-1492（2016）08-1145-06

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.032.html

2016-05-04 接收

安徽省高等教育振興計劃（編號：2014zytz014）；安徽省高等學校自然科學研究項目（編號：KJ2015B056by、KJ2015B126by）；安徽省自然科學基金（編號：1308085QB24）；安徽省生化藥物工程技術研究中心開放課題（編號：BYEC1302）

蚌埠醫學院1化學教研室、2生化與分子生物學教研室，蚌埠 233030

曹守瑩，女，碩士，助教；

白長存，男，講師，責任作者，E-mail：baichangcun@163. com