彌漫大B細胞淋巴瘤患者呼氣中揮發性有機物的篩查

張英平，王 霖，劉 蟬，韓玲玲，夏 鷹，張亞中，劉 虎，夏瑞祥

彌漫大B細胞淋巴瘤患者呼氣中揮發性有機物的篩查

張英平1，王 霖1，劉 蟬2，韓玲玲2，夏 鷹3，張亞中2，劉 虎4，夏瑞祥1

目的 篩查彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）患者呼氣中的特異性揮發性有機物（VOCs），為呼氣檢測在DLBCL診斷中的應用提供實驗依據。方法 收集32例DLBCL患者呼氣樣品，30例健康者呼氣樣品作為對照。利用固相微萃取-氣相色譜/質譜（SPME-GC/MS）檢測兩組呼氣樣品中的VOCs，應用秩和檢驗篩選出DLBCL患者特征性VOCs。結果 DLBCL患者呼氣樣品中可檢測到11種特征性VOCs，分別為3-己酮、丁烷、壬醛、環己醇、苯、環己烷、己烷、癸烷、4-庚酮、十二烷、十六烷，其中烷烴類、酮類、苯類有機物較對照組明顯增高，醛類、醇類明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。在Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者呼氣中，表達無顯著差異。結論 3-己酮、丁烷、壬醛、環己醇、苯、環己烷、己烷、癸烷、4-庚酮、十二烷、十六烷可能作為DLBCL患者特異性VOCs，但這些標志物與DLBCL患者的臨床分期無關聯。SPME-GC/MS檢測方法可應用于DLBCL患者的輔助篩查。

彌漫大B細胞淋巴瘤；呼氣；揮發性有機物；氣相色譜/質譜

彌漫大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）中最常見的一種類型，在中國DLBCL占所有NHL的45.8%，占所有淋巴瘤的40.1%［1］。目前DLBCL的診斷主要依靠病理，其有創，檢查時程長、花費大，患者依從性差。因此，急需建立一種無創、快捷方便、相對廉價的檢查方法，作為一項常規體檢項目來初步篩查患者是否患有淋巴瘤。運用呼氣分析診斷疾病，主要是通過檢測人體呼出氣中揮發性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs）成份或濃度的改變，來反映相應細胞和組織的代謝情況。研究［2-3］證實VOCs與多種疾病的關系，尤其是腫瘤方面研究較多。該實驗采用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）與氣相色譜-質譜（gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS）技術聯用對DLBCL患者和健康對照者呼氣中的VOCs成分進行比較分析，篩查出DLBCL患者呼氣中特征性VOCs。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選取2014年11月～2015年4月入住安徽醫科大學第一附屬醫院血液內科的初診初治DLBCL患者，收集其呼氣樣品32例，其中男19例，女13例；年齡36～79（57.69±8.74）歲。DLBCL患者均為病理證實，其中Ⅰ/Ⅱ期14例，Ⅲ/Ⅳ期18例。患者近期無感染，無其他腫瘤病史，無胃病、肝病、腎病、糖尿病、甲亢、自身免疫性疾病等。另選擇健康對照者30例，其中男18例，女12例；年齡32～68（53.97±8.54）歲。對照組均為經體檢證實健康狀況良好的患者家屬、醫護人員等。兩組患者性別、年齡差異無統計學意義。所有受試者知情同意。

1.2 主要實驗儀器 Tedlar采樣袋（4 L）購自大連德霖氣體包裝有限公司；99.999%氮氣購自合肥眾儀有限公司；57318型75 μm CAR/PDMS SPME萃取頭和手動進樣57330U型SPME手柄購自上海安譜科學儀器有限公司；氣相色譜/質譜聯用儀（GC/ MS-QP 2010 Puls）購自日本Shimadzu公司；HP-5MS毛細管柱（30.0 m×0.25 μm×0.25 mm）購自美國Agilent公司。

1.3 呼氣樣品采集 受試者前1 d 24：00開始禁食、水，晨起后安靜狀態下深吸氣、屏氣數秒后緩慢向Tedlar袋共呼入3 L氣體；同時采集周圍環境氣體作為對照。使用采樣袋之前先用99.999%的氮氣清洗3次，以除去可能殘留的物質。

1.4 萃取、進樣及檢測方法 每次使用前先將SPME纖維針頭加熱30 min（在250℃條件下）以除去殘留雜質，然后插入呼氣標本中，在室溫下萃取30 min，隨即在GC/MS進樣口解析10 min，檢測并讀取數據。

1.5 氣相色譜與質譜條件 氣相色譜條件：載氣為高純氦氣（He），流速1 ml/min，不分流進樣；進樣口溫度250℃；柱箱程序升溫：初溫35℃保持5 min，然后以4℃/min升至100℃，最后以20℃/min升至260℃，保持1 min。質譜離子源溫度200℃，掃描范圍35～350 m/z。

1.6 實驗方法重復性和穩定性檢測 連續3 d采集相同地點、相同時間段、同一受試者的呼吸氣體樣品，每份呼氣樣本重復檢測3次，并同時檢測周圍空氣，利用上述SPME-GCMS聯用法檢測分析。通過對比3例氣體樣品中VOCs表達的質譜圖，顯示3份VOCs各主要峰的出峰時間基本一致，且出峰面積也大致相同，說明3者代謝的揮發性有機物成分基本相同，實驗的重復性也能達到要求。提示本實驗用于檢測DLBCL患者呼出氣體中的VOCs重復性良好，結果尚穩定。

1.7 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，采用非參數統計方法中的Wilicoxon秩和檢驗篩選比較物質。以α=0.05為檢驗標準。

2 結果

2.1 呼氣中VOCs的分析 按上述步驟1.4、1.5中的實驗方法對呼氣樣品進行檢測，選取保留時間為0～32 min的總離子流程圖，通過NIST 05數據庫檢索分析，在DLBCL患者呼氣樣本中至少檢測出98種化合物。DLBCL患者和健康對照者呼氣中VOCs色譜圖對比見圖1，可以看出DLBCL組和對照組在相同保留時間出現的峰高低明顯不同，即含量上存在差別，不同峰面積代表不同物質出現的強度不同。經檢測分析，結果顯示11種有明顯差異的VOCs，分別為3-己酮（峰1）、丁烷（峰2）、壬醛（峰3）、環己醇（峰4）、苯（峰5）、環己烷（峰6）、己烷（峰7）、癸烷（峰8）、4-庚酮（峰9）、十二烷（峰10）、十六烷（峰11），其中烷烴類、酮類、苯類化合物較對照組明顯增高，醛類、醇類明顯減少。見表1。

圖1 DLBCL組和對照組呼氣樣品中VOCs典型色譜圖比較

表1 呼氣中特征性VOCs峰面積的比較

表2 DLBCL組Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期呼氣中特征性VOCs峰面積的比較

2.2 不同分期的DLBCL患者呼氣中特征性VOCs的表達情況 在Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者呼氣中，上述11種標志物的峰面積差異均無統計學意義，即表達含量無明顯差異。見表2。

3 討論

人體主要通過肺泡交換將呼氣排出體外，在一定程度上反映了體內的代謝情況。人類呼氣成分中這些VOCs質或量的變化與機體的代謝狀態有關，通過檢測這些變化，可以進一步了解機體的病理生理情況［4］。呼氣分析正逐漸成為一種新型的診斷方法，對于患者而言，其是一種無創、相對價廉且可接受性較高的檢查。近年，呼氣分析已被普遍認為有很大可能成為一種安全快捷的腫瘤診斷替代方法。

呼氣成分中內源性VOCs主要由氧化應激產生，為人體的代謝產物［5］。生理情況下，機體里的抗氧化劑可以清除人體內的氧自由基。但是在病理情況下，過多的氧自由基則可以造成生物膜系統損傷以及細胞內氧化磷酸化障礙，其中對DNA的損傷可導致基因突變［6］，是一種常見的致癌機制；作用于細胞膜脂肪酸的氧化損傷則會導致機體呼氣中VOCs成份或濃度的增多［7］。研究［8］表明多種疾病存在與其相關的特征性VOCs，人體呼氣中VOCs的組成與不同疾病相關。氧化路徑不同，產生的物質也就不同，但氧化產物大部分屬于易揮發的有機物，如烷烴類、醛類、酮類、苯環類及其衍生物等。

呼出氣體中與DLBCL相關的VOCs，理論上是由DLBCL細胞代謝產生的，經過血液循環到達肺部，通過氣體交換，呼出體外。本研究采用SPMEGC/MS法對DLBCL患者及健康對照者呼氣樣本中VOCs進行定量分析，結果顯示11種特征性VOCs，分別為3-己酮、丁烷、壬醛、環己醇、苯、環己烷、己烷、癸烷、4-庚酮、十二烷、十六烷，其中烷烴類、酮類、苯類化合物較對照組明顯增高，醛類、醇類明顯減少。一般認為這些VOCs并不僅僅由腫瘤組織所產生，而是腫瘤在發生、發展過程中引起機體相應代謝紊亂而產生的［9］。

烷烴或烷烴的衍生物為人體中揮發性標志物的主要成分，本研究篩選出來的丁烷、環己烷、己烷、癸烷、十二烷、十六烷與其相符，這些物質在血液中溶解度極低，很快經過氣-血交換，直接由呼吸系統排出體外。其機制可能為腫瘤細胞中氧自由基活動增強，誘導氧化應激進一步引起細胞脂質過氧化，導致細胞膜中的多不飽和脂肪酸降解增加，故烷烴類物質生成增多。芳香族化合物，如苯也可作用于細胞膜導致脂質過氧化使VOCs產生增多；另外，芳香族化合物被普遍認為與飲酒、吸煙、環境污染和輻射等因素有關，推測其可能與淋巴瘤的病因有一定關系。

3-己酮和4-庚酮屬于酮類，通常認為與脂肪酸的過氧化有關，DLBCL患者體內氧化應激增強，進而產生更多的3-己酮和4-庚酮等酮類。花慶齡等［10］運用SPME-GC/MS檢測DLBCL患者尿液及健康對照組尿液中VOCs，發現4-庚酮濃度明顯升高，本實驗結果與之一致。在DLBCL患者呼氣中，壬醛的峰面積較對照組低。研究［11］表明，醛類物質的濃度在癌細胞代謝產物中往往低于非癌變細胞。癌細胞消耗醛類物質多與癌細胞中醛脫氫酶活性增高有一定關系。本研究實驗組中醇類物質減低，其代謝機制目前尚不明確，推測其產生可能還受到細胞色素P450混合酶系的調控［12］，有待進一步研究。

在腫瘤細胞生長過程中，絕大部分腫瘤細胞都存在著氧化應激增強的現象［13］。本研究中，在Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者呼氣中，特異性VOCs的表達無顯著差異。推測DLBCL患者呼氣中VOCs可能與腫瘤的分期無關，呼氣分析在DLBCL的早期診斷上可能更具優勢。Phillips et al［14］在肺癌檢測中，也得到相似的結果。

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The screening of VOCs in the breath of diffuse large B-cell lymphoma patients

Zhang Yingping1，Wang Lin1，Liu Chan2，et al
（1Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；

2Anhui Institute for Food and Drug Control，Hefei 230051）

Objective To screen volatile organic compounds（VOCs）in the breath of diffuse large B-cell lymphoma（DLBCL）patients，and provide the experimental evidence for the diagnosis of DLBCL.Methods Collected the breath samples from 32 patients with DLBCL and 30 healthy people as controls.The VOCs were extracted with solid phase microextraction（SPME）and analyzed with gas chromatography（GC）/mass spectrometry（MS）.The Wilcoxon test was used for discriminating the VOCs.Results 11 different kinds of VOCs were detected among the patients with DLBCL breath samples：3-hexanone，butane，nonanal，cyclohexanol，benzene，cyclohexane，hexane，decane，4-heptanone，dodecane and hexadecane.The alkane，ketone，benzene compounds were significantly higher than the controls（P＜0.05），the aldehydes，alcohol decreased significantly（P＜0.05）.There was no difference between the difference markers in the breath of DLBCL patients at stageⅠ～Ⅱ，and stageⅢ～Ⅳ.Conclusion

diffuse large B-cell lymphoma；breath；volatile organic compounds；gas chromatography/mass spectrometry

R 551.2；R 730.4；R 733.4

A

1000-1492（2016）08-1204-04

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.060.html

2016-04-19 接收

國家自然科學基金（編號：81472750）

安徽醫科大學第一附屬醫院1血液內科，4腫瘤內科，合肥230022

2安徽省食品藥品檢驗所，合肥 2300513安徽醫科大學臨床醫學院，合肥 230601

張英平，男，碩士研究生；

夏瑞祥，男，博士，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xrx2041@163.com

These substances 3-hexanone，butane，nonanal，cyclohexanol，benzene，cyclohexane，hexane，decane，4-heptanone，dodecane and hexadecane may be used as a characteristic VOCs in patients with DLBCL.There is no association between the VOCs and clinical stages of DLBCL patients.SPME-GC/MS detection method can be used among the DLBCL patients with secondary screening.