三丁酸甘油酯對宮內發育遲緩哺乳仔豬肝臟抗氧化和線粒體功能的影響

何進田，董 麗,2，白凱文，徐 穩，牛 玉，黃 強，張莉莉，王 恬,*

（1.南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095；2.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009）

三丁酸甘油酯對宮內發育遲緩哺乳仔豬肝臟抗氧化和線粒體功能的影響

何進田1，董 麗1,2，白凱文1，徐 穩1，牛 玉1，黃 強1，張莉莉1，王 恬1,*

（1.南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095；2.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009）

目的：研究三丁酸甘油酯（tributyrin，TB）對宮內發育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）哺乳仔豬肝臟抗氧化和線粒體功能的調節作用。方法：選取8 頭正常初生體質量仔豬和16 頭IUGR仔豬，將IUGR仔豬隨機均分為2 組，分別飼喂基礎人工乳（IUGR組）、基礎人工乳＋0.1% TB（IUGR＋TB，IT組），正常仔豬飼喂基礎人工乳（NBW組）。從仔豬7 日齡開始飼喂，21 日齡時每組選取6 頭體質量接近的仔豬進行屠宰取樣，并對肝臟進行組織切片觀察，酶活力以及相關酶mRNA表達量的測定。結果：與NBW組相比，IUGR組仔豬的肝臟組織切片出現中央靜脈充血現象，而IT組無顯著變化。IUGR組仔豬肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力較NBW組顯著降低（P＜0.05），丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量極顯著升高（P＜0.01），線粒體蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、錳-超氧化物歧化酶（Mn-superoxide dismutase，Mn-SOD）活力顯著低于NBW組（P＜0.05）；與IUGR組相比，IT組仔豬肝臟SOD活力、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、GSH-Px活力及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）均顯著升高（P＜0.05），且MDA含量極顯著降低（P＜0.01），線粒體MDH、Mn-SOD活力均顯著升高（P＜0.05）；與NBW組相比，IT組仔豬肝臟GSH含量、T-AOC顯著升高（P＜0.05），MDA含量極顯著降低（P＜0.01），其他指標無顯著差異。與NBW組相比，IUGR組仔豬肝臟SOD、CAT mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05），IT組仔豬肝臟SOD、PRDX3 mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）。IT組仔豬肝臟CAT mRNA表達水平較IUGR組顯著降低（P＜0.05），PRDX3 mRNA表達水平較IUGR組顯著升高（P＜0.05）。結論：IUGR哺乳仔豬肝臟抗氧化能力降低，線粒體功能受損。TB能夠提高IUGR仔豬肝臟抗氧化能力，保護線粒體免受損傷，具有作為抗氧化劑的潛力。

宮內發育遲緩；肝臟；抗氧化能力；線粒體；哺乳仔豬

宮內發育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）通常發生在哺乳動物妊娠期，表現為胎兒或胎兒體內器官生長發育受阻[1]。據統計，IUGR在人類和動物生產中的發生率高達5%～10%，具有較高的發病率和死亡率[2]。研究表明子宮內生長環境受限會提高胎兒出生后患代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）的可能性，如2型糖尿病、高血壓、代謝異常等，并且與成年期發病率有緊密的聯系[3]。IUGR還降低了具有免疫、抗氧化、蛋白質合成等功能蛋白的表達水平[4]，引起機體氧化應激。肝臟是動物體內重要的代謝器官，可以清除體內氧化代謝產生的自由基，避免機體聚積過多的自由基而造成損傷[5]。

三丁酸甘油酯（tributyrin，TB）是由3 分子丁酸和1 分子甘油酯化后的產物，屬于丁酸鹽衍生物，在腸道酶的作用下分解為β-羥基丁酸和甘油進入肝臟進行代謝。TB能有效緩解IUGR引起的腸道損傷[6]，緩解肝臟炎癥反應[7]，其良好的抗癌作用已在人類和動物身上得到了驗證[8]。日糧中添加2 kg/t TB時，斷奶仔豬的生長性能及健康狀況均得到了明顯改善[9]，TB添加量為0.1%時，可緩解由脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）引起的肉雞肝臟損傷[10]。這些結果都表明TB作為食品添加劑具有保護動物健康、保障食品安全的研究潛力。豬具有與人類相似的器官構造、功能等特征，IUGR豬已被廣泛用于臨床疾病研究，對預防和治療人類IUGR病具有重要的參考意義。但目前有關TB在IUGR方面的應用還較少。因此，本實驗選擇IUGR哺乳仔豬為研究模型，觀察IUGR對仔豬出生早期肝臟造成的影響（組織形態、抗氧化能力等），并探討TB對其調節作用，為進一步評估IUGR對動物健康造成的影響奠定理論基礎，同時為TB作為一種食品添加劑在生產中的應用提供基本依據。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

選取體質量相近、預產期相近、同胎次（3～4）的妊娠母豬20 頭，在其分娩當日，選擇8 窩仔豬，每窩新生仔豬（杜洛克×長白×大白）中選擇1 頭正常體質量（normal body weight，NBW）仔豬（（1.67±0.13） kg）設為NBW組和2 頭IUGR仔豬（（0.93±0.11） kg）分別均分到IUGR組和IT組中（以初生體質量低于群體兩個標準差的仔豬為IUGR仔豬，而初生體質量在群體一個標準差范圍內的仔豬為NBW仔豬[11]），即共8 頭NBW仔豬和16頭IUGR仔豬。哺乳至7 日齡，進行單獨人工飼喂，NBW和IUGR組飼喂基礎人工乳，IT組飼喂基礎人工乳＋0.10% TB，至21 日齡，每組屠宰6 頭仔豬，雌雄各半。宰前空腹12 h，屠宰后立即取肝臟相同部位于－20 ℃冰箱和液氮罐保存供后期指標測定。基礎人工乳配方和營養成分見表1。

表1 基礎人工乳配方和營養成分（消化能水平）Table1 Compositions and nutrient contents of diets (DM basis)

1.2 試劑

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、琥珀酸脫氫酶（succinatedehydrogenase，SDH）試劑盒、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）試劑盒、銅鋅-超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol 美國Invitrogen公司；SYBR、Rox Reference Dye 日本TaKaRa生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養管理

實驗期內仔豬在育仔箱內飼養，自由采食人工乳，按人工乳與溫水1∶4（m/V）的比例調和。實驗在安徽宣城安佑實驗豬場進行，按豬場飼養管理要求進行常規免疫和定期消毒。

1.3.2 肝臟組織形態學觀察

取仔豬肝臟右葉相同組織部位于質量分數為4%的多聚甲醛液中固定，用乙醇及二甲苯脫水、透明，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織學形態變化。

1.3.3 肝臟處理與指標測定

將仔豬肝臟組織按質量比1∶9加入預冷的生理鹽水，冰水浴條件下勻漿破碎，3 000 r/min離心10 min，取上清液于－20 ℃冰箱中保存待用。肝臟線粒體的提取參考Tang等[12]的方法。肝臟中SOD、GSH-Px活力，T-AOC及GSH、MDA含量，肝臟線粒體中SDH、MDH、SOD、CuZn-SOD活力，以上指標均嚴格按照試劑盒說明書方法和步驟進行測定。錳-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活力為SOD活力與CuZn-SOD活力的差值。

1.3.4 反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測肝臟SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）與過氧化物還原酶3（peroxiredoxin 3，PRDX3）mRNA的表達量

1.3.4.1 RNA的提取和cDNA的合成

仔豬屠宰后取肝臟，立即放入液氮罐中凍存。采用Trizol試劑從肝臟中提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA的完整性。所有用于測定的樣品都需要檢查RNA純度（1.8≤OD260nm/OD280nm≤2.0），并用0.1%焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水稀釋到相同質量濃度500 ng/μL。稀釋后的RNA采用10 μL反轉錄反應體系，以TaKaRa反轉錄試劑盒測定加樣量，按照試劑盒說明書中方法和步驟進行測定。反轉錄反應參數為：37 ℃ 15 min，3 個循環；85 ℃ 5 s。反轉錄產物（cDNA）保存于－20 ℃條件下備用。

1.3.4.2 SOD、CAT與PRDX3 mRNA表達量的測定

基因引物序列見表2，GAPDH作為內參基因校準目的基因mRNA的表達，RT-PCR采用20 μL反應體系：10 μL SYBR、上下游引物各0.4 μL、Rox Reference Dye（50×）0.4 μL、6.8 μL DEPC水和2 μL cDNA模板。

表2 RT-PCR引物序列Table2 Primer sequences used in RT-PCR

PCR反應步驟為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，40 個循環；60 ℃ 34 s，每個樣品均先做預試。使用ABI軟件檢測相關基因表達，用2–ΔΔCT法對基因mRNA表達量進行統計。

1.4 數據統計分析

實驗數據以Excel初步處理后，采用SPSS Statistics 20分析，結果以表示。所有數據采用單因素方差分析中的Duncan’s法進行多重比較，以P＜0.05和P＜0.01作為差異顯著性的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 TB對IUGR哺乳仔豬肝臟組織形態的影響

圖1 仔豬肝臟組織形態切片（HE，×100）Fig.1 Histological images of liver (HE, × 100)

由圖1可知，與NBW組相比，IUGR組仔豬肝臟組織中央靜脈和門管區（圖1B中箭頭所指部位）充血較嚴重，而IT組與NBW組比較則沒有顯著變化。

2.2 TB對IUGR哺乳仔豬肝臟抗氧化功能的影響

表3 TB對IUGR哺乳仔豬肝臟抗氧化功能的影響Table3 Effect of tributyrin on liver antioxidant function of suckling piglets with intrauterine growth retardation

由表3可知，與NBW組相比，IUGR組仔豬肝臟中GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），SOD活力和GSH含量均有降低趨勢（P＞0.05），T-AOC無顯著變化（P＞0.05），MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。與IUGR組相比，IT組仔豬肝臟中GSH-Px、SOD活力和GSH含量均顯著升高（P＜0.05），MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。IT組仔豬肝臟中GSH含量和T-AOC顯著高于NBW組（P＜0.05），MDA含量則極顯著低于NBW組（P＜0.01），SOD及GSH-Px活力與NBW組相比沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 TB對IUGR哺乳仔豬肝臟線粒體功能的影響

表4 TB對IUGR哺乳仔豬肝臟線粒體功能的影響Table4 Effect of tributyrin on liver mitochondrial function of suckling piglets with intrauterine growth retardation

由表4可知，與NBW組相比，IUGR組仔豬肝臟線粒體中SDH、Mn-SOD活力均顯著降低（P＜0.05）。IT組仔豬肝臟線粒體中SDH、Mn-SOD活力均較IUGR組顯著升高（P＜0.05），且與NBW組之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 B對IUGR哺乳仔豬肝臟SOD、CAT、PRDX3 mRNA表達量的影響

表5 TB對IUGR哺乳仔豬肝臟SOD CAT PRDX3 mRNA相對表達量的影響Table5 Effect of tributyrin on mRNA expression of SOD, CAT and PRDX3 in liver of suckling piglets with intrauterine growth retardation

由表5可知，IUGR組仔豬肝臟SOD、CAT mRNA表達水平較NBW組均顯著升高（P＜0.05）。IT組仔豬肝臟CAT mRNA表達水平較IUGR組顯著降低（P＜0.05），PRDX3 mRNA表達水平較IUGR組顯著升高（P＜0.05）。與NBW組相比，IT組肝臟SOD、PRDX3 mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05），CAT mRNA表達水平無顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

IUGR對動物器官的不良影響已有較多報道，IUGR新生胎兒肝臟的營養代謝會發生異常。近年來，許多研究者也在試圖通過開發有效的添加劑來改善IUGR對機體產生的不良影響。肝臟在機體內發揮著不可替代的作用，健康狀態下能夠維持體內氧化還原的動態平衡。TB分解產生的丁酸能通過抑制核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活、降低肝臟腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA的表達，實現抑制肝臟損傷和降低血清TNF-α水平的功能[13]。有研究發現，TB能減少氫過氧化物的產生、提高抗氧化酶的活性、增強抗氧化能力[14]，但目前有關TB作為食品添加劑對IUGR引起的肝臟損傷和抗氧化功能影響的研究報道仍較少。

黃雪新[15]研究發現7 日齡IUGR仔豬肝臟內細胞總數、肝細胞、枯否細胞、淋巴樣細胞數量均顯著減少，表明IUGR可能會對仔豬肝臟造成損傷，影響營養物質的轉運。劉闖等[16]利用雙熒光標記miRNA芯片技術對IUGR胎豬肝臟分析發現，肝臟細胞的增殖受到了抑制。本研究發現21 日齡IUGR仔豬肝臟組織充血，但在日糧中添加TB后這一現象得到明顯的改善，并且與正常仔豬無顯著差異。Dong等[6]的研究也發現IUGR會造成仔豬腸道絨毛發育受損，脾臟質量顯著下降，在日糧中添加TB后對IUGR造成的機體器官損傷均有一定的緩解作用，這也與本實驗結果一致。TB在腸道分解生成的β-羥基丁酸能被腸道表面細胞快速吸收，進入肝臟為細胞的生長發育提供能量，加快細胞增殖，TB對器官損傷的緩解作用可能與此有關。李嬌龍等[10]研究發現飼料中添加0.1%的TB緩解了LPS引起的肉雞肝臟損傷，這些都表明TB作為食品添加劑可能對動物機體遭受的損傷具有一定的緩解作用，這可能是通過加速細胞增殖實現的，但具體機制還有待研究。

動物機體在健康狀態下保持著氧化和抗氧化之間的動態平衡，當機體遭到攻擊時（如疾病、應激、營養失衡等），體內會發生一系列的氧化應激反應，產生大量自由基，抗氧化酶活性降低[17]。體內的氧化還原平衡狀態一旦被打破，氧化應激會引發多種疾病，嚴重影響人類和動物的健康。SOD、GSH是體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑[18]，GSH-Px是機體一種重要的過氧化物分解酶，MDA是體內脂質過氧化產物之一，上述幾種物質活力或含量的高低可在一定程度上反應機體的氧化應激狀態[19]。本實驗結果顯示，受IUGR影響，21 日齡仔豬肝臟GSH含量及SOD、GSH-Px活力均降低，其中GSH-Px活力顯著降低，MDA含量顯著升高，這提示IUGR可能促進了肝臟脂質過氧化反應，降低了抗氧化酶的活力。李博等[20]研究也發現23 日齡IUGR仔豬肝臟清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力有下降的趨勢，并且SOD活性顯著下降，與本實驗結果相似。研究發現，發育未成熟的早產兒機體氧自由基活性較高，能夠損害體內的大分子物質，如DNA、蛋白質、多不飽和脂肪酸及碳水化合物等，這種氧化損傷會導致蛋白質的二級、三級結構發生改變[21]。Kamath等[21]證實了IUGR新生兒氧化應激損傷嚴重。由此可見，IUGR會引起肝臟氧化應激，降低機體抗氧化能力。本實驗發現在日糧中添加TB后，IUGR仔豬肝臟中MDA含量顯著下降，抗氧化酶活力升高。王遠孝等[22]通過在斷奶仔豬日糧中添加60 mg/kg的γ-氨基丁酸顯著提高了仔豬機體的抗氧化能力，提示丁酸鹽能使機體產生更多抗氧化酶，增強機體清除脂質過氧化產物的能力。Leonel等[14]發現通過給患結腸炎的小鼠飼喂TB，小鼠體內SOD活性得到了顯著提高，MDA含量顯著降低，抗氧化性能得到了增強，這與本實驗結果相似。體外實驗也表明了丁酸鹽具有顯著的抗氧化活性[23]。

線粒體是機體進行氧化代謝的部位，也是氧自由基產生的主要場所，線粒體在肝臟組織中的含量極高。SDH是三羧酸循環中唯一嵌入線粒體內膜的酶[24]，為線粒體的一種標志酶。MDH是一種重要的氧化還原酶，Mn-SOD主要存在于線粒體基質中，作為抗氧化劑在機體防御疾病的過程中起著重要的作用[25]。本實驗發現IUGR仔豬肝臟線粒體SDH、Mn-SOD活力均顯著降低，在食用添加TB的日糧后其SDH、Mn-SOD活力均能夠得到提高。機體氧化和抗氧化動態平衡被打破后，產生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基，改變膜蛋白的結構和酶的活性，進而引起線粒體膜發生改變，對細胞造成氧化損傷[26]。有報道以低蛋白日糧模擬IUGR環境，發現仔豬肝臟線粒體DNA拷貝數較正常組降低，母體攝入低蛋白日糧可能會影響胎兒線粒體DNA的復制和轉錄，IUGR抑制線粒體的功能[27]，這也與本實驗結果一致。本實驗通過進一步研究發現，IUGR仔豬肝臟SOD、CAT mRNA表達水平顯著上升，PRDX3 mRNA表達水平也有上升趨勢。PRDX3主要分布于線粒體內，在調控線粒體內ROS暴發引起的細胞凋亡中發揮著十分重要的作用。IT組仔豬肝臟SOD、CAT mRNA表達水平下降，仍高于NBW組。這些結果表明IUGR仔豬機體發生了氧化應激，線粒體功能受損，激活自我損傷修復。在食用添加TB的日糧后對IUGR引起的線粒體功能損傷有一定的緩解作用，并且顯著提高了PRDX3 mRNA表達水平。有報道證明丁酸鹽能夠提高AMP激酶活性，增強小鼠骨骼肌中線粒體功能[28]。本實驗中TB對IUGR仔豬肝臟線粒體功能的增強作用可能與丁酸鹽作用的發揮密切相關，具體作用機制還有待進一步研究。

本實驗結果表明，IUGR哺乳仔豬肝臟會發生損傷和氧化應激，線粒體功能受損。日糧中添加0.1% TB可能具有緩解IUGR引起的肝臟線粒體損傷和增強肝臟抗氧化功能的潛力。結果提示TB作為食品添加劑可能具有修復機體早期遭受內外環境變化引起的損傷、保護動物健康的重要作用。

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Effect of Tributyrin on Liver Antioxidant Capacity and Mitochondrial Function of Piglets with Intrauterine Growth Retardation during Sucking Period

HE Jintian1, DONG Li1,2, BAI Kaiwen1, XU Wen1, NIU Yu1, HUANG Qiang1, ZHANG Lili1, WANG Tian1,*
(1. College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

Objective: The effect of tributyrin on liver antioxidant capacity and mitochondrial function of sucking piglets with intrauterine growth retardation (IUGR) was observed in the present study. Methods: Totally 8 piglets with normal birth weight and 16 IUGR piglets were selected. The IUGR piglets were randomly divided into 2 groups (IUGR group fed basic artifi cial milk; IT group (IUGR + 0.1% tributyrin) fed basic artifi cial milk supplemented with 0.1% tributyrin). The piglets with normal birth weight were provided with basic artifi cial milk (NBW group). The experiment started at the age from 7 to 21 days. Totally 6 piglets (similar body weight) were selected from each group and slaughtered, and liver histological sections, antioxidant enzyme activities and mRNA expression were measured. Results: 1) Compared with NBW group, liver histological sections from IUGR group revealed central venous congestion, but IT group had no signifi cant change. 2) Compared with NBW group, IUGR group had lower glutathione peroxidase (GSH-Px) activity (P < 0.05) and increased malondialdehyde (MDA) content (P < 0.01) in liver, and lower malate dehydrogenase (MDH) and Mn-superoxide (Mn-SOD)activities in mitochondria (P < 0.05). IT group had higher SOD and GSH-Px activities, glutathione (GSH) content and total antioxidant capacity (T-AOC) (P < 0.05), and lower MDA content (P < 0.01) in liver, as well as higher activities of MDH and Mn-SOD in mitochondria when compared to IUGR group. Compared with NBW group, the activities of GSH and T-AOC were significantly increased (P < 0.05), and the MDA content was significantly decreased (P < 0.01) in IT group. 3) Compare with NBW group, the mRNA expression levels of the SOD and CAT genes in liver of IUGR group were significantly increased (P < 0.05), and the mRNA expression levels of SOD and PRDX3 in liver of IT group were also signifi cantly increased (P < 0.05). Compared to IUGR group, the mRNA expression of CAT was signifi cantly decreased (P < 0.05) and the mRNA expression of PRDX3 was signifi cantly increased (P < 0.05) in liver of IT group. Conclusion: Piglets with IUGR exhibited decreased antioxidant capacity in liver and impaired mitochondrial function. Diets supplemented with tributyrin could improve antioxidant capacity and protect mitochondria from damage in liver of IUGR piglets. Tributyrin may be an effi cient antioxidant.

intrauterine growth retardation (IUGR); liver; antioxidant capacity; mitochondria; piglets

10.7506/spkx1002-6630-201603035

TS202.3

A

1002-6630（2016）03-0191-06

何進田, 董麗, 白凱文, 等. 三丁酸甘油酯對宮內發育遲緩哺乳仔豬肝臟抗氧化和線粒體功能的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 191-196. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603035. http://www.spkx.net.cn

HE Jintian, DONG Li, BAI Kaiwen, et al. Effect of tributyrin on liver antioxidant capacity and mitochondrial function of piglets with intrauterine growth retardation during sucking period[J]. Food Science, 2016, 37(3): 191-196. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603035. http://www.spkx.net.cn

2015-05-01

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201808）；教育部高等學校博士點基金項目（20110097120033）

何進田（1990—），男，碩士研究生，研究方向為動物營養與飼料科學。E-mail：2013105040@njau.edu.cn

*通信作者：王恬（1958—），男，教授，博士，研究方向為動物營養與飼料科學。E-mail：twang18@163.com