山楂原花青素調節環氧合酶-2表達誘導Eca109食管癌細胞凋亡

宓 偉，練 武，尹淑英，衣衛杰，石塔拉，韓文婷

山楂原花青素調節環氧合酶-2表達誘導Eca109食管癌細胞凋亡

宓 偉，練 武，尹淑英，衣衛杰，石塔拉，韓文婷

（濱州醫學院公共衛生與管理學院，山東 煙臺 264003）

探討山楂原花青素（hawthorn procyanidins，HPC）通過磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/serine threonine protein kinase，PI3K/Akt）信號通路調節環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）表達，誘導Eca109食管癌細胞凋亡的分子機制。體外常規培養食管癌細胞株，配制25、50、100、200、300、400 μg/mL不同質量濃度的HPC，CCK-8（Cell Counting Kit-8）法檢測并計算不同質量濃度HPC在72 h內對Eca109食管癌細胞的抑制率，選取IC50=250 μg/mL作為HPC處理組劑量，并設對照組。Western blotting法檢測Eca109細胞PI3K和Akt磷酸化程度、Caspase-3和COX-2蛋白表達水平，反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測Eca109細胞COX-2 mRNA表達水平，Annexin V-FITC/PI法檢測0、12、24、36、48、72 h時HPC對Eca109食管癌細胞凋亡率的影響。結果表明：HPC處理組Eca109食管癌細胞PI3K、Akt磷酸化程度隨著處理時間延長逐漸降低（P＜0.01），在48 h時活性最低，HPC處理組Eca109食管癌細胞COX-2 mRNA的表達量與對照組比較明顯降低（P＜0.01）。在HPC的作用下，Eca109食管癌細胞Caspase-3蛋白表達量在48、72 h時最強（P＜0.01），COX-2蛋白表達量在72 h時最低（P＜0.01）。Eca109食管癌細胞凋亡率隨著時間的延長越來越高，在72 h時達到63.54%（P＜0.01）。HPC可通過PI3K/Akt途徑下調COX-2表達，從而誘導Eca109食管癌細胞凋亡。

山楂原花青素；環氧合酶-2；食管癌；細胞凋亡

全世界食管癌的發病率在近些年呈上升趨勢，2008年的一項調查顯示，全世界67 億人口新發食管癌約48.3 萬例，發病率為7.0/10萬，居惡性腫瘤發病率第9位，死亡率為5.8/10萬，居惡性腫瘤死亡率第8位[1]。中國食管癌發病率為16.7/10萬，居所有惡性腫瘤發病率的第5位，死亡率為13.4/10萬，居所有惡性腫瘤死亡率的第4位，按性別統計，我國男性食管癌發病率居各類惡性腫瘤第4位，女性食管癌發病率居第7位，男、女食管癌死亡率均居第4位[2]。食管癌以鱗狀上皮細胞癌為主，浸潤強、轉移速度快、惡性程度高，嚴重影響人體健康[3-5]。環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是一種參與介導細胞分化、增殖等多種生理功能的多效酶，通過影響細胞增殖、細胞分化和免疫監視等促進腫瘤細胞的異常增殖、發展和腫瘤血管的生成，并提高腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[6-7]。山楂原花青素（hawthorn procyanidins，HPC）是在山楂果中存在的一大類由不同數量的兒茶素或表兒茶素縮合而成的多酚類低聚化合物，其生物活性遠高于從葡萄籽中提取的高聚體原花青素[8-9]。HPC具有清除自由基[10]、抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、降血壓[13]、降血脂[14]等多種生物活性，近年來被廣泛用于食品、飲料、保健品和藥品等領域，是極具開發前景的天然植物藥和保健成分[15-16]。但HPC是否能通過磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/serine threonine protein kinase，PI3K/Akt）途徑促進Eca109食管癌細胞凋亡的分子機制尚未見報道。因此，本研究通過初步觀察分析HPC對Eca109食管癌細胞的抑制效果，旨在探討HPC通過PI3K/Akt信號通路下調COX-2的表達誘導Eca109食管癌細胞凋亡的分子機制和可能的作用靶點，為開發食品中有效抗腫瘤成分提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Eca109食管癌細胞株由濱州醫學院附屬醫院中心實驗室提供。

HPC（純度95%，批號：20120401） 杭州綠天生物技術公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑盒、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、兔抗人COX-2多抗、兔抗人Caspase-3多抗 美國Sigma公司；兔抗人p-PI3K、p-Akt和兔抗人PI3K、Akt抗體美國Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人β-actin單抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體 美國Santa Cruze Biotechnology公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒 美國Caltag公司；RPMI-1640培養基 美國Life Technology公司；反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、PCR擴增試劑盒 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

CO2恒溫培養箱 德國Heraeus公司；TDL-40臺式離心機 上海菁華科技儀器有限公司；凝膠成像分析系統 美國Alpha Innotech公司；DYY-12型電泳儀、Perkinelmer多功能酶標儀 北京六一儀器廠；實時定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司；FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 Eca109食管癌細胞培養

Eca109食管癌細胞復蘇后，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，以RPMI-1640培養液稀釋至2×104個/mL，每孔100 μL接種于96 孔酶標板中，于5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養，2 d傳代1 次，取對數期細胞用于實驗。

1.3.2 CCK-8法檢測HPC對Eca109食管癌細胞抑制率

用胰消化酶消化細胞并用含10%血清的培養基將Eca109細胞制成單個細胞懸液并計數。調整細胞濃度為1×109個/L，每孔100 μL接種于96 孔板中，培養24 h貼壁后換成無血清的培養基并加入HPC。加入25、50、100、200、300、400 μg/mL不同質量濃度的HPC為HPC處理組，空白對照組加入等體積DMSO，每組設10 個平行孔，培養72 h。實驗終止前2 h每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續培養2 h后振蕩1 min，在450 nm波長處測定各孔光密度值并讀數[17]。通過下式計算HPC對Eca109食管癌細胞的抑制率，選取IC50作為后續實驗中HPC的處理劑量。

1.3.3 Western blotting法檢測相關蛋白表達

胰酶消化Eca109細胞并調整細胞濃度為1×106個/L，培養24 h后，更換為無血清含胰島素的培養基并給藥，24、48 h后，4 ℃條件下用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗細胞3 次并收集于EP管中，10 000 r/min離心15 min，吸取上清液，提取50 μg蛋白進行定量分析，凝膠電泳分離，電轉到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用含5%牛奶的TBST液封閉1 h。4 ℃分別孵育PI3K、Akt、Caspase-3、COX-2一抗過夜，復溫1 h后TBST室溫搖床洗膜5 min，重復3 次，室溫孵育二抗1 h，加ECL顯色液后凝膠成像系統顯色，以β-actin為內參照，計算各蛋白條帶的相對表達量，實驗重復5 次。

1.3.4 RT-PCR法檢測Eca109食管癌細胞COX-2 mRNA表達量

參照逆轉錄試劑盒的操作說明合成20 μL cDNA，PCR擴增COX-2基因片段，片段長度420 bp。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環。COX-2上游引物序列：5’-TAATGTACTCCTGCCAGGTCA-3’，下游引物序列：5’-AACGGTGGAAGCTCCTAGGCA-3’，擴增片段5 6 4 b p；內參G A D P H上游引物序列：5’-TAAGACCGTTACGAACAGCCA-3’，下游引物序列：5’-AGAAGCTGGAAGCTGCCTGCA-3’，擴增片段424 bp。反應后取10 μL PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，利用凝膠成像系統進行灰度值分析，測定各組代表條帶平均灰度值與內參對比，重復3 次。設置添加等體積培養液的對照組。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI法檢測Eca109食管癌細胞凋亡率

本次會議還舉辦了第三屆“易創杯”組織學與胚胎學教學標本制作大賽，參賽標本包括石蠟切片、鋪片標本、整體標本等類型，有HE染色、特殊染色及銀染技術。標本制作大賽為專業同行們提供了一個展示標本制作技能的平臺。45件實驗教學標本中11件作品分別獲一、二、三等獎。

制備Eca109食管癌細胞懸液濃度為1×106個/L，接種于6 孔板，每孔100 μL，培養過夜，在細胞貼壁后加入HPC，對照組加入等體積DMSO，分組處理0、12、24、36、48、72 h，收集細胞樣品，檢測前于PBS中重懸30 min，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用PBS漂洗3 次，4 ℃冰箱中靜置30 min后，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書上機檢測。

1.4 數據統計分析

數據以±s表示，應用SPSS 17.0統計軟件進行t檢驗和方差分析，檢驗水平α=0.05。

2 結果與分析

圖1 不同質量濃度HPC處理72 h對Eca109食管癌細胞的抑制率（x±s，n＝1111）Fig.1 Suppression rate of esophageal cancer cells induced by HPC with different concentrations after 72 h (x± s, n = 11)

2.1 不同質量濃度HPC對Eca109食管癌細胞的抑制率如圖1所示，2 5、5 0、1 0 0、2 0 0、3 0 0、 400 μg/mL不同質量濃度的HPC誘導Eca109食管癌細胞72 h時，隨著HPC質量濃度的增加，其對Eca109細胞的抑制率也逐漸升高，72 h時其抑制Eca109細胞的IC50約為250 μg/mL，因此選用250 μg/mL作為后續實驗的HPC處理劑量。

2.2 Eca109食管癌細胞的PI3K和Akt磷酸化程度

圖2 Eca109食管癌細胞的PI3K和Akt磷酸化程度（x±s，n＝55）Fig.2 Time-dependent degree of PI3K and Akt phosphorylation (x± s, n = 5)

如圖2所示，與β-actin相對表達量比較，250 μg/mL HPC處理后，Eca109食管癌細胞中PI3K和Akt磷酸化程度具有時間依賴性，PI3K和Akt活性也隨之明顯降低，于48 h時均達到極顯著水平（P＜0.01）。

2.3 Eca109食管癌細胞的COX-2 mRNA表達量

圖3 Eca109食管癌細胞中CCOOXX--22 mRNA的表達（x±s，n＝55）Fig.3 Expression of COX-2 mRNA (x± s, n = 5)

如圖3所示，與對照組比較，250 μg/mL HPC處理組的Eca109食管癌細胞中COX-2 mRNA的表達量明顯降低（P＜0.01）。

2.4 Eca109食管癌細胞的Caspase-3和COX-2蛋白表達量

圖4 Eca109食管癌細胞中Caspase-3和COX-2蛋白的表達（x±s，n＝55）Fig.4 Expression of Caspase-3 and COX-2 protein in esophageal cancer cells (x ± s, n = 5)

如圖4所示，與β-actin相對表達量相比，250 μg/mL HPC干預后，Eca109食管癌細胞中Caspase-3蛋白表達量隨著時間的推移而逐漸升高，于48 h和72 h時達到較高水平（P＜0.01）；而COX-2蛋白表達量隨著時間的推移而逐漸降低，于72 h時降至最低（P＜0.01）。

2.5 HPC對Eca109食管癌細胞凋亡的影響

由圖5可知，與對照組相比，250 μg/mL HPC誘導培養Eca109食管癌細胞后，細胞凋亡率呈時間依賴性，其中0、12、24、36、48、72 h時Eca109細胞的凋亡率分別為10.54%、21.37%、38.29%、46.72%、50.26%和63.54%（P＜0.01）。

圖5 Eca109食管癌細胞凋亡率（x±s，n＝77）Fig.5 Apoptosis rates of esophageal cancer cells analyzed by Annexin V-FITC/PI (x± s, n = 7)

3 討 論

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來食管癌的發病人群呈不斷年輕化趨勢[18]。手術切除是食管癌的常用臨床治療手段，但是手術難以完全切除瘤組織，對轉移癌細胞的清除率較低，導致患者術后容易復發或轉移，術后3 a生存率較低，若手術和化療同時進行，患者3 a生存率則會大大提高，但常用的化療藥物具有毒副作用大、對癌細胞敏感性低、患者耐受性差等缺陷[19]。同時在食管癌發病早期及時發現并治療，避免發展為浸潤性癌，對于患者的預后非常重要[20-21]。當人體處于健康狀態時，細胞的分化與凋亡處于平衡狀態；若細胞不能正常啟動凋亡程序，處于無限繁殖狀態，就可能引發腫瘤。因此，通過誘導細胞凋亡的分子機制，探尋有效的天然植物藥及分子治療靶點對于食管癌的治療和預后有重要意義。

PI3K/Akt細胞信號通路調節多種惡性腫瘤的發生發展，PI3K/Akt主要是通過影響其下游的多種效應分子如Bax-2、Caspase-3、Caspase-9和COX-2的表達而發揮其抗凋亡的作用[22]。目前，通過基因敲除法或天然植物藥物抑制PI3K、Akt的磷酸化而調控相關基因的轉錄和表達，阻斷其降低下游多種促凋亡效應分子活性，活化抗凋亡效應分子，促進細胞凋亡和自噬等已經成為腫瘤治療研究的新焦點。PI3K與Akt組成的PI3K/Akt信號通路在腫瘤細胞的分化增殖和存活中起著重要的作用[23]。腫瘤細胞凋亡的發生和發展受到細胞內外多種信號分子的調控，通過激活PI3K/Akt信號通路，進而激活活性氧調控的核轉錄因子-κB并轉入細胞核內調控一系列的基因表達。研究表明，組成性活化的PI3K/Akt信號通路在食管腫瘤譜中失調，導致食管癌細胞異常增殖分化，加速腫瘤進程起著關鍵調控作用[24]。PI3K/Akt信號通路受多因素調節，包括天然植物藥、激活劑和抑制劑，其負反饋主要由類脂磷酸酶SHIP2（SH2-containing inositol 5-phosphatase）和PTEN（phosphatase and tensin homologdeleted onchromosometen）調節，它們分別從PIP3的3’和5’去除磷酸而將其轉變成PI（4，5）P2和PI（3，4）P2而降解，從而阻斷Akt及其下游效應分子的有效活化，抑制腫瘤的增殖[25-27]。

本研究表明，HPC誘導Eca109食管癌細胞凋亡呈現劑量和時間依賴性，以IC50=250 μg/mL作為本實驗后續處理劑量。結果顯示在HPC的作用下，Eca109食管癌細胞PI3K和Akt磷酸化程度在48 h時達到最低，同時COX-2 mRNA表達量也降低，隨著時間推移，在72 h時COX-2蛋白表達量明顯降低，Caspase-3蛋白表達明顯升高，此時食管癌細胞凋亡率約為63.54%。在HPC的作用下，Eca109食管癌細胞的PI3K磷酸化程度降低，從而阻斷Akt的活化，致使下游促癌細胞增殖的COX-2表達量降低，促癌細胞凋亡的Caspase-3蛋白表達量升高，從而加速食管癌細胞的凋亡。

綜上所述，HPC誘導Eca109食管癌細胞凋亡可能與其通過PI3K/Akt信號通路下調COX-2的表達有關，HPC對食管癌潛在的多種分子機制還需要進一步研究，有理由期待HPC作為食品中新型天然抗腫瘤成分被開發和利用。

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Hawthorn Procyanidins Regulate the Expression of COX-2 and Induce the Apoptosis of Eca109 Esophageal Cancer Cells

MI Wei, LIAN Wu, YIN Shuying, YI Weijie, SHI Tala, HAN Wenting
(School of Public Health and Management, Binzhou Medical University, Yantai 264003, China)

The present work was undertaken to explore the molecular mechanisms for the apoptosis of esophageal cancer cells induced by HPC through regulating the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) via the PI3K/Akt signal pathway. Esophageal cancer cells were nurtured routinely at HPC concentrations of 25, 50, 100, 200, 300 and 400 μg/mL. The cell counting kit-8 (CCK-8) assay was used to detect and calculate the inhibitory rate of esophageal cancer cells after 72 hours of culture. The IC50of 250 μg/mL was chosen as the experimental group. Western blotting was adopted to detect the degree of PI3K/Akt phosphorylation and the protein expression levels of Caspase-3 and COX-2. RT-PCR wa s used to evaluate the expression level of COX-2 mRNA. Annexin V-FITC/PI was used to test inhibitory rate of esophageal cancer cells after 0, 12, 24, 36, 48 and 72 h. The degree of PI3K and Akt phosphorylation declined gradually as the culture time elapsed and reached the lowest point (P ＜ 0.01) after 48 hours in the experimental group, while the opposite trend was observed for the control group (P ＜ 0.01) . The expression of COX-2 mRNA in the experimental group was significantly lower (P ＜ 0.01) compared to that in the control group. Under the action of HPC, the expression of Caspase-3 protein was the strongest (P ＜ 0.01) after 48 and 72 hours while the expression of COX-2 protein was the lowest (P ＜ 0.01) after 72 hours. The apoptosis rate of esophageal cancer cells increased as the culture period was prolonged, which reached 63.54% (P ＜ 0.01) after 72 hours of culture. HPC can exert a pro-apoptotic effect on esophageal cancer cells by reducing the expression level of COX-2 through the PI3K/Akt signal pathway.

hawthorn procyanidins; cyclooxygenase-2; esophageal cancer; cell apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201601031

R151.3

A

1002-6630（2016）01-0176-06

宓偉, 練武, 尹淑英, 等. 山楂原花青素調節環氧合酶-2表達誘導Eca109食管癌細胞凋亡[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 176-181.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601031. http://www.spkx.net.cn

MI Wei, LIAN Wu, YIN Shuying, et al. Hawthorn procyanidins regulate the expression of COX-2 and induce the apoptosis of Eca109 esophageal cancer cells[J]. Food Science, 2016, 37(1): 176-181. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601031. http://www.spkx.net.cn

2015-03-09

國家自然科學基金青年科學基金項目（81302423）；濱州醫學院科技計劃項目（BY2013KJ86）

宓偉（1978—），男，講師，博士研究生，研究方向為植物化學物與慢性病。E-mail：miweinew@163.com