miR-126在ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達

王　婷，潘旭東，馬愛軍，吳　梅，肖　星，孫清琳 ，王　蘭

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miR-126在ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達

王婷1，潘旭東1，馬愛軍1，吳梅2，肖星1，孫清琳3，王蘭2

目的觀察微小RNA(miR)-126及靶基因血管細胞粘附分子1(VCAM-1)在載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達，探討miR-126與動脈粥樣硬化斑塊形成的關系。方法取8周齡ApoE-/-小鼠24只，隨機分為對照組(假手術+普通飲食)、模型組(頸動脈套管術+高脂飲食)各12只。術后第8周末檢測血漿中總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的水平，HE染色觀察頸總動脈斑塊面積/血管面積，熒光定量PCR(RT-PCR)檢測斑塊內miR-126、VCAM-1 mRNA水平的表達，Western blot檢測VCAM-1蛋白水平的表達。結果與對照組相比，模型組血脂水平明顯升高(P<0.05)；模型組的頸動脈粥樣硬化斑塊面積/血管面積明顯大于對照組(P<0.01)；miR-126表達水平在模型組明顯低于對照組(P<0.01)；VCAM-1的mRNA及蛋白的表達在模型組明顯高于對照組(P<0.01)。結論miR-126在頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達下調可能在斑塊形成過程中發揮重要作用。

動脈粥樣硬化；ApoE-/-小鼠；miR-126；VCAM-1

miRNA是一類序列高度保守的非編碼RNAs，可以通過與mRNA的3’-非翻譯區(3’-untranslated region，3’-UTR)特異性結合，抑制蛋白質翻譯或直接導致其降解，在轉錄后水平調控蛋白質的表達[1]。近年來研究表明miRNAs在膽固醇代謝[2]，平滑肌細胞表型轉化、增殖、遷移[3～5]；血管新生[6]及內皮細胞衰老[7]；炎性反應[8]、泡沫細胞的形成[9]等多個過程中調控動脈粥樣硬化的發生發展。miR-126是一種內皮細胞特異性表達的miRNA[10]，可促進內皮祖細胞的增殖和分化[11]，維持血管的完整性[12]，修復內皮細胞功能。已有研究顯示miR-126可能通過調控其靶基因VCAM-1[13]、抑制內皮細胞炎性反應、延緩動脈粥樣硬化的發展，但miRNA-126在頸動脈粥樣硬化斑塊中的變化尚不明確。頸動脈粥樣硬化是腦血管病重要的危險因素，因此本研究旨在觀察miR-126及VCAM-1在ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達變化，為進一步探討miR-126在頸動脈粥樣硬化中的作用機制提供新的線索。

1　材料與方法

1.1主要材料與試劑ApoE-/-小鼠，雄性，8周齡，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[scxk(京)2009-0015]。高脂飼料(0.25%膽固醇+15%脂肪)，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。Trizol mRNA提取液、PCR上下游引物(生工生物工程股份有限公司，上海)。Prime ScriptTM miRNA qPCR Starter Kit Ver.2.0試劑盒(大連TaKaRa公司)。組織裂解液、0.45 μm PVDF膜(Solarbio公司，北京)。VCAM-1單抗(ab174279)(abcam公司，美國)。β-actin、ECL化學發光液(博士德公司，武漢)。

1.2研究方法

1.2.1動物模型與分組8周齡apoE-/-小鼠24只，飼養于青島大學動物實驗中心。隨機分為兩組：對照組、模型組。第1周所有小鼠均給予普通飲食。第2周模型組予以高脂飼料，對照組繼續飼以普通飲食。第3周模型組行右頸總動脈套管術，對照組行右頸總動脈假手術[14]。所有小鼠于術后8 w處死取材。

1.2.2血脂水平測定股動脈穿刺取血，常規生化法測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.3病理分析右頸總動脈遠端、近端及套管處連續石蠟切片，片厚5 μm，隨機選取10張做HE染色，使用IPP6.0測定小鼠頸總動脈粥樣硬化斑塊面積(即斑塊處外彈力膜面積)和管腔面積，計算出斑塊面積，斑塊面積=血管面積-管腔面積，并計算出斑塊面積與血管面積的比值(PA/LA)。

1.2.4實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測miR-126、VCAM-1的mRNA表達取小鼠右側頸總動脈，加入TRzol mRNA提取液研磨，提取總RNA，總RNA以分光光度計測定RNA純度和濃度,并反轉錄。引物序列如下：miR-126(71 bp)：5’CCGGCATTATTACTTTTGGTACG3’；VCAM-1(118 bp)：上游引物5’CCCAAACAGAGGCAGAGTGT3’，下游引物5’AGCAGGTCAGGTTCACAGGA3’；miR-126內參U6(TaKaLa試劑盒自帶)；VCAM-1內參GAPDH：上游引物5’AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA3’，下游引物5’GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA3’。反應條件：miR-126：預變性(95 ℃ 30 s)，變性(95 ℃ 10 s)，退火延伸(60 ℃ 30 s)，共45個循環，相同的實驗條件下重復3次；VCAM-1：預變性(95 ℃ 30 s)，變性(95 ℃ 10 s)，退火(55 ℃ 20 s)，延伸(72 ℃ 30 s)，共55個循環，相同的實驗條件下重復3次。反應完成后計算機自動分析Ct值，采用2-△△Ct方法計算相對比值。

1.2.5Western blot檢測VCAM-1的蛋白表達取小鼠右側頸總動脈，加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑研磨，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。每組取20 μg樣品，蛋白樣品先80 V電泳30 min，進入分離膠，然后120 V電泳1 h至膠下端1 cm左右，將蛋白轉移至PVDF膜上(15 V，45 min)，置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2.5 h，加一抗(VCAM-1，1∶2500；β-action，1∶200)室溫下搖晃2 h，4 ℃冰箱過夜；用TBST液洗膜10 min×3次；加二抗(VCAM-1,1∶1500；β-action，1∶3500)室溫下搖晃2 h；用TBST液洗膜10 min×3次；在膜上涂0.2 ml ECL發光液1 min，利用化學發光方法進行圖像掃描，保存圖像。使用Image J計算灰度值。

2　結　果

2.1動物體質量及血脂水平檢測結果試驗過程中兩組小鼠體質量差異無統計學意義，對照組血脂水平明顯低于模型組，差異有統計學意義(見表1)。

2.2頸總動脈內膜病理學改變兩組頸總動脈內膜病理學改變，對照組無明顯斑塊，內膜光滑、完整，僅見極少量的泡沫細胞。模型組小鼠頸總動脈內有明顯粥樣斑塊形成，管腔狹窄，內膜不規則增厚，完整性破壞，脂質浸潤，大量泡沫細胞形成，平滑肌細胞增生并分泌大量細胞外基質，可見一些壞死物質及脂質沉積。模型組斑塊面積/血管面積明顯大于對照組(P<0.01)，說明模型制造成功，有明顯的斑塊形成。

2.3miRNA-126和VCAM-1 mRNA水平的表達與對照組相比，模型組miR-126表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，VCAM-1表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，提示動脈粥樣硬化斑塊中VCAM-1表達增多可能與miR-126低表達有關。

2.4VCAM-1蛋白水平的表達模型組VCAM-1表達明顯高于對照組(P<0.01)，表明VCAM-1在動脈粥樣硬化斑塊中蛋白水平表達同樣升高。

表1　各組小鼠體質量及血脂變化

與對照組比*P<0.05

3　討　論

本實驗選用頸總動脈套管及高脂飲食的ApoE/-小鼠，模型組血脂水平明顯增高，小鼠頸總動脈套管處形成明顯動脈粥樣硬化斑塊，該模型依賴低剪切力及高脂血癥誘導頸動脈套管處近心端快速形成動脈粥樣硬化斑塊[15]，維持血管壁完整性，不造成中膜硬性損傷及血流中斷，相對于血管拉傷或結扎后形成的動脈粥樣硬化病變更接近人類病變的推進過程[16]，較廣泛應用于研究頸動脈粥樣硬化疾病。頸動脈粥樣硬化是血管壁的一種慢性炎性疾病。內皮細胞活化后釋放多種細胞因子并表達大量黏附分子，促使單核細胞黏附于內皮細胞并趨化遷移至內膜下，轉變為巨噬細胞，吞噬低密度脂蛋白膽固醇形成泡沫細胞，參與動脈粥樣硬化斑塊的形成[17]。目前研究認為，黏附分子在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中發揮了極其重要的作用，而VCAM-1是重要的黏附分子之一，其過表達是形成動脈粥樣硬化斑塊的關鍵啟動步驟[18]。miR-126是一種內皮細胞特異性高表達的內源性小分子調節物質，近來，Zernecke等[19]研究發現，靜脈注射miR-126，可以抑制小鼠主動脈粥樣硬化病變，使主動脈粥狀硬化斑塊中巨噬細胞的面積減小，表明miR-126與動脈粥樣硬化斑塊的形成有密切關系。

本實驗研究結果顯示，頸動脈粥樣硬化斑塊中miR-126表達明顯降低，VCAM-1 mRNA表達和蛋白表達均明顯增高,表明動脈粥樣硬化斑塊的形成可能與miR-126低表達有關。已有研究顯示[20]，在大動脈粥樣硬化型腦梗死患者的血漿中miR-126的表達明顯低于正常對照組。另外，Tian等研究發現[21],高脂肪喂養所致的動脈粥樣硬化兔模型中，miR-126水平明顯降低，而VCAM-1表達水平明顯升高，這與我們的研究結果相符合。而且，Harris等[13]研究發現，miR-126表達水平降低時VCAM-1表達水平明顯升高，相反，miR-126過表達時，VCAM-1表達水平明顯降低，表明miR-126能夠負反饋調節VCAM-1表達，控制血管內皮細胞的炎性反應。因此，我們認為在動脈粥樣硬化疾病中，miR-126的低表達可能失去了對VCAM-1表達的抑制作用，從而不能抑制炎癥細胞聚集，促進動脈粥樣硬化斑塊形成。

本研究通過觀察miR-126及VCAM-1在ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊中的表達變化，表明miR- 126可能通過表達下調導致VCAM-1表達升高，促進了動脈粥樣硬化發展，進一步證實了miR-126在動脈粥樣硬化中的作用，為臨床中動脈粥樣硬化疾病的治療提供了新的靶點。然而miR-126在動脈粥樣硬化中的具體作用機制尚未十分明確，需要進一步基礎和臨床試驗研究。

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The expression of miRNA-126 in carotid atherosclerotic plaques of ApoE-/-mice

WANGTing,PANXudong,MAAijun,etal.

(DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266100,China)

ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-126 (miR-126) and the vascular cell-adhesion molecule-1 (VCAM-1) in carotid plaque,and the relationship between miR-126 and atherosclerotic lesion formations in apolipoprotein E-knockout (ApoE-/-) mice.MethodTwenty-four male ApoE-/-mice were randomized into two groups:control group (sham-operate+normal diet) and model group (perivascular collar placement+high-cholesterol diet).After eight weeks of operate,all mice were sacrificed.The serum levels of totals of total cholesterol (TC),triglyceride (TG),high-density lipoprotein-cholesterol (HDL-C) and low-density lipopoprotein (LDL-C) were measured by enzyme method.Pathological picture analysis was performed to calculate the ratio of area of carotid atherosclerotic plaque to area of vessel lumen.The expression of VCAM-1and miR-126 were measured by RT-PCR,and the expression of VCAM-1 also measured by Western blot.ResultAs compared with control group,the model group associated with a marked increase in TC,TG,LDL-C (P<0.05),and area of carotid atherosclerotic plaque (P<0.01),the expression of miR-126 was significantly decreased in mRNA levels (P<0.01),and the expression of VCAM-1 was significantly increased in mRNA and protein levels (P<0.01).ConclusionThe down-regulation of miR-126 in carotid atherosclerotic plaque may play an important role in the development of atherosclerosis.

Atherosclerosis;ApoE-/-mice;miR-126;VCAM-1

1003-2754(2016)04-0296-03

2016-02-19；

2016-03-30

國家自然科學基金(No.81571112)

(1.青島大學附屬醫院神經內科，山東 青島 266100；2.青島大學基礎醫學實驗中心人體顯微結構學實驗室，山東 青島 266071；3.青島大學醫學院組織胚胎學教研室，山東 青島 266071)

潘旭東，E-mail：drpan022@163.com

R743.1

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