DADS聯合P-gp抑制劑比立考達協同逆轉A549/DDP多藥耐藥性的研究

廖明初 陳潔海 曹振華 陳 聰 艾小紅*

（南華大學附屬第一醫院腫瘤內科，湖南 衡陽 421000）

DADS聯合P-gp抑制劑比立考達協同逆轉A549/DDP多藥耐藥性的研究

廖明初 陳潔海 曹振華 陳 聰 艾小紅*

（南華大學附屬第一醫院腫瘤內科，湖南 衡陽 421000）

目的 為研究DADS（二烯丙基二硫）聯合第二代P-gp抑制劑比立考是否可協同逆轉肺癌耐順鉑細胞株A549/DDP的多藥耐藥，增強化療敏感性。方法 MTT進行藥物毒性試驗，Western和RT-PCR檢測P-gp及其編碼基因MDR-1表達變化。結果 非細胞毒性劑量的8 mg/L DADS和2.3 μmol/L的比立考達都可以增加CDDP（順鉑）對A549/DDP細胞毒性，且二者聯合具有協同作用。并通過Western和PCR驗證經8 mg/L DADS作用后耐藥細胞系A549/DDP后P-gp與MDR-1表達明顯降低，經8 mg/L DADS和2.3 μmol/L的比立考達共同作用后A549/DDP后P-gp與MDR-1表達進一步降低。結論 DADS與比立考達在逆轉肺癌多藥耐藥具有協同作用。

肺癌；DADS（二烯丙基二硫）；比立考達；多藥耐藥；P -gp

肺癌是我國乃至世界目前發病率及病死率最高的腫瘤之一，至少有1/3的肺癌患者在確診時已是中晚期，僅有約1/4的患者為早期。盡管對于早期的肺癌患者手術治療可獲得較長的生存期，但很大部分患者最終出現復發、轉移。而對于出現轉移及就診時已失去手術機會的中晚期患者，化療成為了最主要的治療了手段。盡管對肺癌的化學治療取得了一定的進展，特別是近20年來分子靶向藥物的日新月異，使得晚期肺癌患者從以前的平均生存期由之前的只有7個月左右，提高到2～3年，甚至是10年。但最終大部分會出現耐藥，使得腫瘤復發、進展，其5年生存率仍未見顯著提高，約為15%［1］。而多藥耐藥（MDR）是化療失敗的主要原因之一。傳統的肺癌的化療是以鉑類為基礎的聯合化療，其中，順鉑是有效且廣泛應用的臨床化療藥物，但是由于腫瘤內源性和外源性獲得的多藥耐藥，使得療效不盡人意。因此，進一步研究順鉑的耐藥機制和尋找新的逆轉耐藥靶點對于提高肺癌患者的生存具有重要意義［2］。研究表明ABC轉用體家族中P-gp（p-糖蛋白）會主動將藥物排出胞外，導致細胞內藥物濃度降低，從而導致細胞多藥耐藥［3］。比立考達（Biricodar）為第二代p-gp抑制劑，相比第一代p-gp抑制維拉帕米等，有更強的P-gp抑制作用，且毒性更小。其在乳腺癌耐藥細胞中增強化療藥物的敏感性已經被證實［4］。研究表明，DADS可以逆轉胃癌耐藥株7901/VCR、HepG2-ADM等細胞的多藥耐藥［5-6］。本實驗擬研究DADS與比立考達在逆轉多藥耐藥肺癌細胞株A549/DDP是否具有協同作用。

1　材料與方法

1.1細胞株：人肺癌細胞株A549由南華大學附屬第一醫院研究所實驗提供，耐順鉑肺癌細胞株A549/DDP購買于中南大學細胞庫。

1.2試劑與藥物：二烯丙基二硫（DADS）為Fluka公司產品，順鉑（CDDP），上海華聯制藥有限公司。培養液為GIBCO公司產品。小牛血清為杭州四季青生物工程公司產品，TRIZOL、RT試劑盒（Invitrogen），DEPC（上海生物工程）。PCR試劑（Promega公司），MTT（Amresco），小鼠抗p-gp單克隆抗體（SantaCruz公司）上述試劑均購于長沙力康生物技術有限公司。擴增引物P-gp及內參β-actin由Invitrogen構建。MDR-1引物序列：F 5'-TCGTA GGAGT GTCCG TGGAT-3'；R5'-TAGGT GCCTG TGAGG ATGCT-3'； 459 bp。β-actin F5'-CGTCA TACTC CTGCT T-3'；R5'-ATCTG GCACC ACACC T -3'；838 bp。

1.3細胞培養：將A549、A549/DDP用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液培養于37 ℃，5% CO2的恒濕培養箱中。A549/DDP細胞培養液中加入順鉑4 μg/mL維持其耐藥性，實驗前兩周撤出CDDP。

1.4確定A549/DDP對CDDP的耐藥性：MTT法，取對數生長期A549、A549/DDP細胞，已5×103/孔接種于96孔板，設空白對照，陰性對照組和CDDP組（2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL）。計算不同濃度下的細胞抑制率、IC50、RF（相對耐藥倍數），細胞抑制率=（1-實驗組A/對照組A）×100%，RF=IC50A549/CDDP/A549 IC50。

1.5DADS和比立考達的非細胞毒性劑量確定：MTT法，取對數生長期A549、A549/DDP細胞，已5×103/孔接種于96孔板，設空白對照，陰性對照組及DADS組和比立考達組，每組設5個復孔。種板4～6 h細胞貼壁厚加入藥物處理。其中DADS組濃度梯度為（1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L），比立考達（0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L、8.0 μmol/L）。繼續培養48 h，加入MTT 20 μL（5.0 g/L），繼續孵育4 h，棄掉培養液加入DMSO 150 μL/孔，室溫低速振蕩15 min，酶標儀490 nm檢測吸光度A值。細胞抑制率=（1-實驗組A/對照組A）×100%，計算不同藥物不同濃度下的細胞抑制率，非細胞毒性劑量為A549/CDDP細胞抑制率≤10%時所對應的藥物濃度。

1.6DADS、比立考達對細胞化療藥物敏感性的影響：方法同上，設A549、A549/DDP、A549/DDP+DADS、A549/DDP+比立考達、A549/ DDP+DADS+比立考達5個組，其中DADS、比立考達濃度為IC10對應濃度，CDDP（0.0005 μg/mL、0.005 μg/mL、0.05 μg/mL、0.5 μg/mL、5.0 μg/mL），計算細胞的抑制率、IC50、RI（耐藥倍數=逆轉前IC50/逆轉后IC50）。

1.7Western Blot：取對數生長期A549、A549/DDP，傳代于培養瓶，設A549、A549/DDP、A549/DDP+DADS、A549/DDP+比立考達、A549/DDP+DADS+比立考達5組，37 ℃，5% CO2的恒濕培養48 h胰酶消化細胞，RIPA提取蛋白，參照BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度并組間配平。SDS電泳后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2～4 h，加入兔抗人p-gp（1∶1000）及β-actin（1∶1000）一抗過夜，TBST洗膜3次，10分/次，后加入山羊抗兔二抗（1∶5000）室溫搖床孵育2 h，再洗膜，方法同前。DAB顯影，軟件對灰度值進行分析。

1.8RT-PCR：細胞處理及收集同上1.7，PBS清洗細胞，加TRIZOL 1 mL參照說明書提取總RNA，電泳分析RNA純度，2 μL RNA進行逆轉錄，步驟參照RT試劑盒。PCR：β-actin 95 ℃，10 min；35個循環（94 ℃，30 s；51 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，10 min。P-gp 94 ℃，10 min；35個循環（94 ℃，30 s；53 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃，10 min。PCR產物于-20 ℃保存。PCR產物分析：取各組4 μL產物進行5%瓊脂糖凝膠電泳30 min然后進行凝膠成像系統進行拍照。

2　結 果

2.1確定A549/DDP對CDDP的耐藥性：肺癌耐藥細胞株A549/DDP的IC50為7.50 mg/L，A549的IC50為0.25 mg/L，二者具有顯著差異（P＜0.05），耐藥倍數為30倍，見表1。說明A549/DDP對CDDP有穩定耐藥性。

表1　藥物對A549、A549/CDDP細胞的作用（，n=3）

表1　藥物對A549、A549/CDDP細胞的作用（，n=3）

注：avs A549，P＜0.01；bvs A549/DDP，P＜0.01.

組別　A549的IC50　A549/CDDP的IC50　RF　RI對照組　0.25±0.04　7.50±0.30a　30.0　/ DADS　0.23±0.08　2.35±0.36b　10.22　3.19比立考達　0.26±0.12　1.01±0.25b　4.65　7.43比立考達+ DADS 0.25±0.10　0.55±0.27b　2.2　13.63

2.2DADS和比立考達的非細胞毒性劑量確定：在本實驗MTT中，以A549/DDP IC10對應的藥物劑量為非細胞毒性試驗，及DADS為8 mg/L、比立考達為2.3 μmol/L，見表2和表3。

表2　不同濃度DADS對細胞抑制率的影響（，n=3）

表2　不同濃度DADS對細胞抑制率的影響（，n=3）

DADS （mg/L）　細胞抑制率　IC100.5　1.87±0.13　8 mg/L 1.0　4.34±0.23　/ 5.0　4.68±0.35　/ 10.0　16.67±0.37　/ 20.0　44.56±0.33　/

表3　不同濃度比立考達對細胞抑制率的影響（，n=3）

表3　不同濃度比立考達對細胞抑制率的影響（，n=3）

比立考達（μmol/L）　細胞抑制率　IC100.5　1.67±0.14　2.3μmol/L 1.0　3.60±0.12　/ 2.0　4.58±0.36　/ 4.0　31.88±0.40　/ 8.0　76.67±0.28　/

2.3DADS和比立考達對A549/DDP化療藥物敏感性的影響：非細胞毒性劑量的8 mg/L DADS和2.3 μmol/L的比立考達都可以增加CDDP對A549/CDDP細胞毒性（P＜0.01），且二者聯合具有協同作用。而對親本細胞A549卻無明顯增敏效果（P＞0.05）。見表1。

2.4Western Blot檢測各組細胞的P-gp表達：A549細胞系P-gp低表達，A549/DDP細胞系P-gp高表達，經2.3 μmol/L作用后耐藥細胞系A549/ DDP后P-gp表達無明顯改變，經8 mg/L DADS作用后耐藥細胞系A549/ DDP后P-gp表達明顯降低，經8 mg/L DADS和2.3 μmol/L的比立考達共同作用后A549/DDP后P-gp表達進一步降低。見表4。

表4　Western Blot和 RT-PCR分別檢測各組細胞P-g和MDR-1表達（，n=3）

表4　Western Blot和 RT-PCR分別檢測各組細胞P-g和MDR-1表達（，n=3）

注：a）vs A549/DDP相比具有統計學意義（P＜0.01）

實驗分組　P-gp/β-actin　MDR-1/β-actin A549　0.431±0.03　0.647±0.04 A549/DDP　1.237±0.09　1.855±0.08 A549/DDP+比立考達　1.212±0.07　1.829±0.05 A549/DDP+DADS　0.631±0.05a）　0.947±0.07a）A549/DDP+DADS+比立考達　0.231±0.01a）　0.352±0.03a）

3　討 論

肺癌是目前全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，來自美國流行病學調查研究結果預測2015年美國新發肺癌和死亡分析分別為221200和158040，居惡性腫瘤發病率第2位，病死率第3位［7］。全國腫瘤防治研究辦公室對2012年中國惡性腫瘤發病率和病死率分析，我國肺癌病死率和發病率均位列第一，年發病和死亡病例為70.5萬和56.9萬［8］。雖然近20年來隨著分子靶向藥物的迅速發展，肺癌患者從以前的平均生存期由只有7個月左右，提高到2～3年，部分甚至是10年。但最終還是會出現耐藥，使得腫瘤復發、進展，其5年生存率仍未見顯著提高，約為15%［9-10］。多藥耐藥是指腫瘤細胞對一種化療藥物產生耐藥的同時對之前未接觸過的多種抗腫瘤藥物同樣產生耐藥。

MDR耐藥的原因涉及腫瘤細胞對藥物的攝取、轉運出現障礙，藥物在細胞內代謝增加，腫瘤細胞修復增強，藥物的作用靶點改變等復雜過程［11-12］。MDR-1和P-gp在腫瘤細胞過度表達是導致腫瘤多藥耐藥的主要原因之一，同時MDR-1與P-gp也是目前研究最廣泛最深的耐藥機制之一。P-gp由MDR-1基因編碼，是ABC（ATP-binding cassette）轉運家族的主要成員之一。P-gp是一種能量依賴性藥物泵，利用ATP水解的能量，通過主動外排作用將藥物排出至腫瘤細胞外，從而使腫瘤細胞存活，產生耐藥［13］。比立考達是第2代p-gp抑制劑，通過競爭性與p-gp結合位點結合，抑制藥物的外排。相比第1代p-gp抑制劑，比立考達具有不良反應更小，抑制作用更強等優點，但其會干擾其他藥物的代謝動力學，使得其應用受限［14］。然而如應用一種p-gp逆轉劑加上p-gp抑制劑可以減少相互的用藥劑量，同樣有很好的增強化療敏感性的效果，并可以減少比立考達的不良反應。二烯丙基二硫（DADS）是大蒜中的脂溶性有效成分，可抑制多種腫瘤的發生和發展，其抗腫瘤與阻滯腫瘤細胞周期，促進腫瘤細胞凋亡，誘導分化，抑制血管生成等有關［15-16］。

本實驗通過MTT，非細胞毒性劑量的8 mg/L DADS和2.3 μmol/L的比立考達都可以增加CDDP對A549/DDP細胞毒性，且二者聯合具有協同作用。而對親本細胞A549卻無明顯增敏效果。并通過Western和PCR證實在A549細胞系P-gp及其編碼基因MDR-1低表達，A549/DDP細胞系高表達，經2.3 μmol/L作用后耐藥細胞系A549/DDP后P-gp和其編碼基因表達無明顯改變，而經8 mg/L DADS作用后耐藥細胞系A549/DDP后P-gp與MDR-1表達明顯改降低，經8 mg/L DADS和2.3 μmol/L的比立考達共同作用后A549/DDP后P-gp與MDR-1表達進一步降低。DADS與比立考達在逆轉肺癌多藥耐藥具有協同作用，二者合用可減少各自的藥物劑量，減少不良反應，并增強逆轉MDR效果。具有深遠的臨床應用前景。

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The Study of Reversing Multidrug Resistance of A549/DDP by DADS and Biricodar Synergy Effects

LIAO Ming-chu， CHEN Jie-hai， CAO Zheng-hua， CHEN Cong， AI Xiao-hong*
（Department of Medical Oncology， the First Affiliated Hospital of University of Sonth China， Hengyang 421001， China）

Objective To investigate the multidrug resistance synergistic reversing and the chemotherapy sensitivity enhancement buy DADS（diallyl trisulfide） and Biricodar on the multidrug resistancet of human lung A549/DDP cells. Methods MTT test drug sensitivity， the changes expression of MDR-1 and P-gp was examined by RT-PCR and Western blot. Results Using either non-cytotoxic dose 8 mg/L or 2.3 μmol/L Biricodar can make A549/DDP more sensitive to cisplatin， meanwhile， using DADS alone can decrease the level of MDR-1 and P-gp on A549/DDP cells， more over，the combination using DADS and Biricodar have more significant effect. Conclusion DADS and Biricodar have coordinate effect on reversing the multidrug resistance of human lung A549/DDP cells.

Lung cancer； DADS； Biricodar； Multidrug resistance； P -gp

R734.2

B

1671-8194（2016）26-0017-03