Bif-1在肝癌中的表達并縮短其生存期相關性研究

范仁根　查文章　周勇　秦呈林　單湘湘　周建平　萬心強

Bif-1在肝癌中的表達并縮短其生存期相關性研究

范仁根1查文章1周勇1秦呈林1單湘湘2周建平2萬心強3

目的 探討Bif-1在肝癌組織的表達及其對于臨床預后的相關性。方法 用免疫組化法研究206例肝細胞肝癌中Bif-1的表達情況。半定量測定細胞質的免疫反應。并與其他多個臨床病理參數結合分析，其中包括患者的生存情況。運用χ2檢驗和K-M生存分析進行研究。結果 Bif-1在肝癌細胞中的表達水平高于癌旁組織。Bif-1在肝癌中表達水平的增高與組織低分化和短生存期顯著相關。Bif-1的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤大小、包膜侵犯、HBs-Ag的表達以及門靜脈侵犯無顯著相關性。結論 Bif-1在肝癌中過表達。Bif-1的過表達是一個新的獨立預后標志，與腫瘤的不良分化與總生存期縮短相關。

Bif-1；Beclin1；肝癌；生存期

在世界范圍內，肝細胞肝癌發病率第五，在腫瘤相關死亡率中位列第三，是肝移植的主要指征[1］。因此，肝癌是人類健康的一大重要問題，預計在不久的將來與其相關的問題還會增加。盡管診斷水平和外科治療方法近年來取得巨大進展，患者的預后仍不盡如人意，因為在切除術后或其他局部區域治療法后，復發率較高。然而，肝癌的發展機制至今仍不明確。

Bif-1是一種保守的胞漿蛋白，包含一個羧基SH3結構域，最初是被作為Bax結合蛋白發現的[2］。Bif-1與Bcl-2家族蛋白沒有顯著的同源性。這一家族的蛋白與Bax蛋白相互作用，影響細胞的生存和死亡。近來，Bif-1表達的臨床病理作用被認為與多種腫瘤的發展與預后相關[3］。然而，Bif-1與肝癌的臨床病理關聯仍不清楚。本研究的目的是用免疫組化的方法檢測Bif-1在肝癌中的表達情況并探索其與預后的相關性。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2012年6月～2013年6月筆者所在醫院收治的206例肝癌患者的臨床資料，男134例，女72例，年齡50～83歲，平均（52.34±2.09）歲。所有患者均符合肝癌疾病判斷標準。排除標準：嚴重感染者、合并嚴重疾病者等。

1.2方法

通過鼠抗人Bif-1單克隆抗體（CA，USA；1∶500稀釋）進行免疫組化染色，切片，脫蠟用二甲苯和乙醇，3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶（微波加熱檸檬酸緩沖液為40分鐘），一抗暴露于48℃過夜并用抗過氧化物酶染色試劑盒染色，標記抗原用3，3'-二氨基聯苯胺鹽酸鹽，其后用蘇木精復染。免疫組化染色為Bif-1評價經臨床三個未知患者預后的病理學專家，結果得到一致共識。根據Bif-1陽性細胞百分率強度進行評估。Bif-1陽性細胞百分率強度分級如下，0級0～39%；1級：40～69%；2級＞70%。免疫染色強度得分為：0，負；1，弱；2，強。此外，免疫反應評分為陽性染色細胞百分率及染色強度評分（0～4）相加得出。免疫陽性的腫瘤評分0～1被指定為“低”，腫瘤評分2～4免疫反應評分被指定為“高”。

1.3統計分析

采用SPSS 15統計軟件進行統計分析，采用χ2檢驗確定組間變量之間的差異，采用K-M生存分析法研究分類組與生存期的相關性。P＜0.05表明差異有統計學意義。

2　結果

通過免疫組化檢測206例肝癌患者及其相應的癌旁組織Bif-1的表達情況。在正常肝組織和癌組織中，可以觀察到Bif-1在癌細胞的細胞質染色，而細胞核不染色。免疫組化結果如圖1所示。106例腫瘤組織為Bif-1高表達組（51.5%），其余100個腫瘤組織為Bif-1低表達組（48.5%）。Bif-1在癌組織和癌旁組織的表達率分別為51.5%和33.0%，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1　Bif-1 在肝癌及癌旁組織的表達

圖2　Bif-1在肝癌術后組織中的表達與總體生存率的相關性

結果提示患者Bif-1的表達情況與患者的細胞病理分級及預后有一定相關性，而與患者性別、年齡，腫瘤大小、內膜損傷、乙肝表面抗原的表達、門靜脈浸潤無關。

表1　Bif-1在肝癌組織中的表達與臨床病理參數之間的相關性

實驗中，我們研究了Bif-1在肝癌組織中的表達與生存周期的相關性，單因素分析結果提示Bif-1與肝癌的預后密切相關，Bif-1陽性高表達的患者與低表達的患者生存周期明顯不同，差異有統計學意義（對數秩檢驗值=4.096，P=0.043；圖2）。高表達組的平均生存期為（40.0±2.5）個月，而低表達組為（49.0±3.5）個月。這表明，Bif-1表達水平是肝癌患者總體生存率的獨立預后因素。

3　討論

本研究中，我們用免疫組化法檢測了Bif-1在肝癌中的表達情況，與癌旁組織相比，Bif-1在肝癌組織細胞中高表達。Bif-1可通過UVRAG與Bec lin1作用來調節PI3KC3的活性以及在哺乳動物細胞中的自我吞噬效應。既往研究表明，Bif-1表達下調明顯抑制PI3KC3的活性以及自噬小體在人宮頸癌細胞和老鼠成纖維細胞的形成[4］。另外，研究發現Bif-1 與Atg9陽性囊泡可共同局部化[5］。這些囊泡的形成與轉運是吞噬過程中自噬小體膜起源和膨脹的必要條件。自我吞噬是一種進化上高度保守的代謝途徑，可降解細胞大分子和器官細胞[6］。自我吞噬與細胞程序性死亡密切相關，已經受到了眾多學者的關注。

自噬死亡消除了機體損壞的有害細胞，包括受化療藥物作用的腫瘤細胞。增生的腫瘤細胞的生長需要營養，然而腫瘤周圍環境中含氧量和營養都顯著減少。在正常乳腺組織氧氣和葡萄糖中位水平分別是10 kPa與5 mmol/l，而在乳腺癌組織中則分別為4 kPa與1.5 mmol/l[7］。這一差異說明腫瘤細胞除了高糖酵解，也需要通過自我吞噬來增加能量供給。隨著腫瘤的生長，癌細胞可能需要自我吞噬以在營養缺乏和低氧的環境下生存，表現為有限的血管化。自噬小體被認為存在于血管化不足和低代謝區域。另外，凋亡腫瘤組織中對自我吞噬的抑制亦可導致細胞壞死。因此，自我吞噬被認為是一個必要的生理反應，在營養缺乏的的條件下維持腫瘤細胞的活力。

實驗表明，相比于高分化的肝癌組織，低分化的肝癌組織中Bif-1的表達水平更高。Bif-1表達水平增高與肝癌分級之間的關聯目前尚不明確。Ogier-Denis等[8］人的研究已經證實，相比于分化良好的結腸癌細胞，未分化的克隆細胞株HT29高潛能的自噬蛋白降解明顯減少，從而導致自噬活性增高。因此，我們認為低/未分化的癌細胞表現出更大的自噬活力，通過蛋白降解使得腫瘤細胞在營養受限條件下得以存活。

我們的實驗結果表明，Bif-1在肝癌中是一個致癌基因而不是抑癌基因。然而，之前有研究[9］表明Bif-1在胰腺導管腺癌、大腸癌、前列腺癌、膀胱癌、膽囊癌以及胃癌中表達水平下降。這與我們在肝癌中的研究結果相悖，這一差異有待進一步研究。我們認為自我吞噬在腫瘤發生發展中發揮著種種病理生理學作用，其作用可能隨著腫瘤細胞類型和腫瘤組織環境差異而發生改變[10］。

總之，本研究表明Bif-1蛋白的表達可成為肝癌預后的一個新型標志物。Bif-1過表達的肝癌患者腫瘤分級更差，生存時間更短。Bif-1的生物學作用還需要更多的研究闡明，以便于評估其在肝癌診斷與治療中的潛在價值。

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The Correlation Studies of Bif-1 Overexpressed in Hepatocellular Carcinoma and Correlates With Shortened Patient Survival Time

FAN Rengen1ZHA Wenzhang1ZHOU Yong1QIN Cheng lin1SHAN Xiangxiang2ZHOU Jianping2WAN Xinqiang31 Genera l Surgery Department， First People's Hospital of Yancheng， Yancheng Jiangsu 224000， China， 2 Department of Geriatric Medicine， First People's Hospital of Yancheng， Yancheng Jiangsu 224000， China， 3 The Department of Clinical Medicine， Nantong University Medical School， Nantong Jiangsu 226019， China

Ob jective Bif-1 and Beclin1 interact with each other andaf ect the structure of autophagy bodies in the process of autophagy. The purpose of this study is to investigate the prognostic signif cance of Bif-1 expression and its correlation with prognostic parameters in other clinical and pathological parameters. Methods Immunohistochem ical method was used to study the expression of Bif-1 in 206 cases of hepatocellular carcinoma. Sem i quantitative determ ination of the immune response in the cy top lasm. And com bined with other clinical patho logical parameters， including the patient's survival. Chi square test and K-M survival analysis were used. Resu lts The expression level of Bif-1 in hepatocellular carcinoma cells w as significantly higher than that in adjacent tissues. The higher expression level of Bif-1 in liver cancer was signif cantly associated with low dif erentiation and short survival time. The expression level of Bif-1 was not signif cantly correlated with patient's age， gender， tumor size， capsule invasion， HBs-Ag expression and portal vein invasion. Conclusion The study indicates that Bif-1 is overexpressed in hepatocellular carcinoma. Over expression of Bif-1 is a new independent prognostic marker， and tumor dif erentiation was associated with a shorter overall survival.

Beclin1， Bif-1， Liver cancer， Survival time

R 735.7

A

1674-9308（2016）29-0037-04

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.29.021

1 江蘇省鹽城市第一人民醫院普外科，江蘇 鹽城 224000；2 江蘇省鹽城市第一人民醫院老年醫學科，江蘇 鹽城 224000；3.南通大學醫學院臨床醫學系，江蘇 南通 226019