BNDF調控SIRT1/PGC-1α通路拮抗Aβ25~35誘導的神經元細胞氧化損傷

姚 婕 張紅梅 閻麗萍 姬文濤 馬巧亞

西安交通大學第二附屬醫院干部病房一病區，陜西西安710004

BNDF調控SIRT1/PGC-1α通路拮抗Aβ25~35誘導的神經元細胞氧化損傷

姚 婕 張紅梅 閻麗萍 姬文濤 馬巧亞▲

西安交通大學第二附屬醫院干部病房一病區，陜西西安710004

目的探討腦源性神經營養因子（BDNF）對Aβ25～35誘導的神經元細胞氧化損傷的影響及作用機制。方法分離新生SD大鼠皮層神經元細胞，并分為空白對照組、Aβ25～35組、1 μg/L BDNF+Aβ25～35組、10 μg/L BDNF+Aβ25～35組、100 μg/L BDNF+Aβ25～35組、BDNF+siRNA-scramble+Aβ25～35組、BDNF+siRNA-TrkB+Aβ25～35組、BDNF+siRNASIRT1+Aβ25～35組。不同濃度BDNF誘導培養細胞48 h，siRNA-scramble、siRNA-TrkB或siRNA-SIRT1采用Lipofectamine 2000轉染細胞，誘導培養24 h。MTT法和流式細胞術檢測神經元細胞的細胞存活率和凋亡率，利用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法檢測各組細胞中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，qRT-PCR和Western blot檢測TrkB、SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax的表達。結果與空白對照組比較，Aβ25～35組細胞存活率明顯降低，細胞凋亡率增加，MDA含量升高，SOD活性降低（P＜0.05）。與Aβ25～35組比較，不同濃度BDNF均能提高細胞存活率，降低凋亡率，升高細胞內SOD活性，降低MDA含量，上調TrkB、SIRT1、PGC-1α、Bcl-2表達，減少Bax表達（P＜0.05），并且呈現劑量依賴性。沉默SIRT1表達后抑制BDNF對Aβ25～35誘導細胞凋亡的保護作用；沉默TrkB表達后抑制BDNF對SIRT1/PGC-1α信號通路的激活作用。結論BDNF能夠保護Aβ25～35誘導神經元細胞的氧化損傷，并且通過TrkB受體調控SIRT1/PGC-1α信號通路。

腦源性神經營養因子；神經元細胞；氧化損傷；TrkB；SIRT1/PGC-1α

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性疾病，是老年癡呆的最常見類型［1］。β淀粉樣蛋白（β-amyoid peptides，Aβ）在腦內的異常代謝和沉積是AD發病的中心環節［2-3］。Aβ誘導氧化應激導致神經細胞功能紊亂和死亡［4］。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經營養因子家族的主要成員之一，維持神經元存活和生長［5］。本研究中采用β樣淀粉蛋白25～35（β-amyloid 25～35，Aβ25～35）誘導損傷皮層神經元細胞模擬AD的細胞模型，觀察BDNF預處理對Aβ25～35誘導皮層神經元細胞損傷的影響并探索其作用機制，為臨床治療AD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康新生SD大鼠10只，雌雄不限，實驗動物合格證號：SCXK（京）20043008，使用許可證號SYXK（京）20040012，由中國醫學科學院藥物研究所動物實驗中心提供。

1.2 實驗試劑

二苯基溴化四氮唑（MTT）均購自美國Sigma公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠微管相關蛋白2多克隆抗體購自美國Chemicon公司；β-TublinⅢ單克隆抗體購自美國Sigma公司；Hoeschst33258購自北京中杉金橋生物技術公司；FITC-Annexin-V/ PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京碧云天生物公司；多克隆兔抗鼠TrkB、Bcl-2、Bax抗體購自美國Abcam公司；兔來源多克隆抗體PGC-1α（Lot#B2510）、SIRT1（Lot#K0309）購自美國Santa Cruz公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

1.3 大鼠皮層神經元細胞原代培養

大鼠麻醉后取出雙側大腦皮層置于D-hanks培養皿中，解剖顯微鏡下剝離血管及腦膜。加0.25%胰蛋白酶2 mL，37℃消化5 min。2500 r/min離心2 min，棄上清液。加接種培養液4 mL，反復吹打至細胞分散。10 μL細胞懸液調整細胞密度為1×105個/cm3后，接種96孔板中，培養12 h，待細胞貼壁后更換為神經元細胞培養基。每3天換液1次，培養7 d后備用。培養過程中采用倒置相差顯微鏡觀察細胞培養過程中的形態變化。

1.4 染色神經元細胞鑒定

細胞培養7 d，4%多聚甲醛固定15 min，1%H2O2處理10 min。0.3%Triton X-100透化10 min，封閉液封閉1 h，β-TublinⅢ抗體（1∶50）4°C過夜。FITC標記IgG二抗（1∶200）孵育1 h避光。滴加1∶4000稀釋的Hochest 33258 1滴，孵育5 min。熒光顯微鏡下觀察神經元細胞鑒定染色結果。

1.5 神經元細胞分組

神經元細胞分組處理：空白對照組（在培養基中加入終濃度為0.1%的DMSO作用48 h）；Aβ25～35組（在空白組處理基礎上加入Aβ25～35，使其終濃度為20 μmol/L，誘導細胞24 h）；1 μg/L BDNF+Aβ25～35組、10 μg/L BDNF+Aβ25～35組和100 μg/L BDNF+Aβ25～35組（在培養基中分別加入終濃度為1、10、100 μg/L BDNF作用48 h后培養基中加入Aβ25～35，使其終濃度為20 μmol/L，與細胞作用24 h）；BDNF+siRNA-TrkB+ Aβ25～35組，BDNF+siRNA-SIRT1+Aβ25～35組，BDNF+siRNA-scramble+Aβ25～35組（使用Lipofectamine 2000轉染siRNA-TrkB、siRNA-SIRT1、siRNA-scramble 24 h，其余處理同BDNF組）。

1.6 MTT法檢測細胞存活率

調整細胞濃度以5×104個/mL接種于96孔板中，同時設定陰性對照孔（即不加細胞按照同步驟處理），每組各細胞孔中加入20 μL的MTT溶液（5 mg/L），37℃下培養4 h，棄去上清后，加150 μL的DMSO溶液，振蕩反應10 min，酶標儀上測定各孔在590 nm處的光密度（OD）值。每組同時設置5個重復孔。各組神經元細胞的存活率（%）=（處理組OD-陰性對照孔OD）/（空白對照組OD-陰性對照孔OD）×100%。

1.7 檢測各組細胞凋亡率

取出200 μL濃度為1×106個/mL的細胞懸液，FITC標記的Annexin-V和PI各5 μL混勻后避光孵育20 min，低速離心收集細胞，150 μL PBS重懸細胞，用流式細胞檢測儀上樣檢測各組神經元細胞凋亡率變化。

1.8 各組細胞中MDA含量和SOD活力測定

按照試劑盒說明分別以硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法測定細胞中MDA含量和SOD活性。

1.9 qRT-PCR檢測各組細胞中TrkB、SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax mRNA表達

根據按照GREEN spin組織/細胞RNA快速提取試劑盒步驟提取細胞總RNA。按照Takara RNA PCR Kit（AMY）Ver 3.0說明書操作進行反轉錄。RT試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，然后以cDNA的第1鏈作為模板進行PCR擴增。PCR循環反應條件：95°C預變性30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個循環。溶解曲線分析：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。所用引物均由上海生工技術有限公司合成，引物序列見表1。全部反應結束后，FTC-3000實時熒光定量PCR儀附帶的分析軟件自動分析、計算出樣品的△CT值，以比較域值法將其與同一樣本內參基因β-actin的ΔCT值比較，即ΔΔCT=待測基因ΔCT值-內參ΔCT值，而檢測基因mRNA表達的相對量=2-ΔΔCT。

表1 qRT-PCR檢測所用各基因的引物序列

1.10 Western blot檢測各組細胞中TrkB、SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白表達

收獲各組細胞，加裂解液提取蛋白，BCA法總蛋白定量。調整上樣量為25 μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉膜，封閉過夜。封閉完畢后PBS洗膜5次，分別加一抗（所用的一抗稀釋比例分別為TrkB抗體1∶1000、SIRT1抗體1∶2000、PGC-1α抗體1∶1000、Bcl-2抗體1∶1000和Bax抗體1∶1000），37℃反應1.5 h，PBS洗膜5次，加辣根過氧化物酶標記二抗，37℃反應1 h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統依次顯影、定影，Quantity One Basic軟件分析膠片蛋白條帶。

1.11 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用最小顯著差法（least significant difference，LSD），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代培養皮層神經元形態學觀察與純度鑒定

剛接種時，神經元細胞大多數呈圓球形，懸浮于培養基中；接種6～10 h細胞貼壁，大部分神經元細胞開始發出細絲樣突起（圖1A）。培養24 h后幾乎全部細胞已貼壁，胞體呈圓形或橢圓形，神經元細胞周圍有其特有的光暈（圖1B）。培養3 d后，神經元呈錐體形或梭形且細胞體積增大，突起增多伸長并增粗（圖1C）。培養5 d，神經元胞體明顯增大呈錐體形，立體感較前增強，突起增多伸長呈絲帶狀（圖1D）。培養7 d，神經細胞生長良好，胞突主干和分枝明顯延長并增粗，其突起形成稠密的神經網絡（圖1E）。細胞免疫熒光結果顯示綠色熒光為神經元β-TublinⅢ染色，可見整個視野內神經元均勻分布，神經元純度高達95%（圖1F）。

圖1 神經元細胞形態學觀察及鑒定

2.2 各劑量BDNF對神經元細胞存活率的影響

將空白對照組細胞存活率設定為100.00%，由OD值計算出其他組的相對細胞存活率。Aβ25～35處理使OD值明顯下降，與空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；不同濃度BDNF升高細胞OD值，各組間差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 MTT法檢測各組細胞存活率（±s）

表2 MTT法檢測各組細胞存活率（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與Aβ25～35組比較，#P＜0.05；與1 μg/L BDNF+Aβ25～35組比較，△P＜0.05；與10 μg/L BDNF+Aβ25～35組比較，▲P＜0.05；BDNF：腦源性神經營養因子

組別OD值細胞存活率（%）空白對照組Aβ25～35組1 μg/L BDNF+Aβ25～35組10 μg/L BDNF+Aβ25～35組100 μg/L BDNF+Aβ25～35組0.778±0.036 0.351±0.022*0.412±0.021#0.449±0.053#△0.498±0.021#△▲100.00 21.74±2.11*32.86±3.39#37.96±4.12#△48.66±5.68#△▲

2.3 各劑量BDNF對神經元細胞凋亡率的影響

與空白對照組凋亡率［（7.69±1.46）%］比較，Aβ25～35組細胞凋亡率［（41.94±2.56）%］明顯增加；與Aβ25～35組比較，1 μg/L BDNF+Aβ25～35組、10 μg/L BDNF+Aβ25～35組和100 μg/L BDNF+Aβ25～35組細胞凋亡率依次為（32.24±2.52）%、（22.37±2.98）%和（16.37±2.54）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.4 各劑量BDNF對神經元細胞MDA及SOD含量影響

Aβ25～35組細胞內MDA含量上升，SOD活力下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同濃度BDNF降低細胞MDA含量，升高SOD活力，各組間差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

圖2 流式細胞儀檢測神經元細胞凋亡

表3 各組神經元細胞內MDA含量及SOD活性測定結果（±s）

表3 各組神經元細胞內MDA含量及SOD活性測定結果（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與Aβ25～35組比較，#P＜0.05；與1 μg/L BDNF+Aβ25～35組比較，△P＜0.05；與10 μg/LBDNF+Aβ25～35組比較，▲P＜0.05；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；BDNF：腦源性神經營養因子

組別MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）空白對照組Aβ25～35組1 μg/L BDNF+Aβ25～35組10 μg/L BDNF+Aβ25～35組100 μg/L BDNF+Aβ25～35組8.114±0.267 14.441±0.386*13.247±0.240#12.124±0.339#△10.703±0.221#△▲29.114±0.534 16.441±0.386*18.097±0.251#19.024±0.206#△20.969±0.232#△▲

2.5 各劑量BDNF對TrkB、SIRT1、PGC-1α、Bcl-2及Bax表達的影響

Aβ25～35降低細胞內TrkB、SIRT1、PGC-1α和Bcl-2 mRNA表達和蛋白表達，升高Bax表達，差異有統計學意義（P＜0.05）；不同濃度BDNF升高細胞中TrkB、SIRT1、PGC-1α和Bcl-2 mRNA表達和蛋白表達，降低Bax表達下調，各組間差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

2.6 SIRT1/PGC-1α信號通路參與BDNF保護神經元細胞氧化損傷

BDNF處理減少細胞凋亡率，降低細胞內MDA含量，升高SOD活力，差異有統計學意義（P＜0.05）；沉默SIRT1增加細胞凋亡，升高細胞MDA含量，降低SOD活力，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4、圖4。

2.7 沉默TrkB阻斷BDNF激活SIRT1/PGC-1α信號通路

BDNF上調細胞內TrkB、SIRT1和PGC-1α表達，差異有統計學意義（P＜0.05）；沉默TrkB減少TrkB、SIRT1和PGC-1α表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖3 各劑量BDNF對TrkB、SIRT1、PGC-1α、Bcl-2及Bax表達的影響

表4 各組神經元細胞內MDA含量及SOD活性測定結果（±s）

表4 各組神經元細胞內MDA含量及SOD活性測定結果（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與Aβ25～35組比較，#P＜0.05；與100 μg/L BDNF+Aβ25～35組比較，△P＜0.05；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；BDNF：腦源性神經營養因子

組別MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）空白對照組Aβ25～35組100 μg/L BDNF+Aβ25～35組BDNF+siRNA-scramble+Aβ25～35組BDNF+siRNA-SIRT1+Aβ25～35組8.114±0.267 14.441±0.386*0.498±0.021#0.494±0.018 0.526±0.014△29.114±0.534 16.441±0.386*48.660±5.680#46.960±4.250 40.260±3.750△

圖4 流式細胞儀檢測神經元細胞凋亡

圖5 沉默TrkB對SIRT1/PGC-1α信號通路的影響

3 討論

AD發病的氧化應激學說受到越來越多學者的重視［6-7］。氧化應激是各種神經損傷及各種中樞神經系統功能退行性紊亂的最后共同通路，抗氧化損傷成為防治AD的重要策略之一［8］。BDNF是重要的神經保護劑，在神經系統中起著重要作用［9-10］。BDNF在AD模型大鼠海馬組織中表達量減少［11］，體外實驗證實BDNF對神經元細胞具有保護作用［12］。研究也證明BDNF能夠通過提升心肌細胞抗氧化和清除氧自由基的能力以減輕缺氧/復氧損傷［13］。因此，本研究探討了BDNF對Aβ25～35誘導大鼠皮層神經元細胞氧化損傷的影響及作用機制。

MDA作為機體脂質過氧化反應終產物，能夠反映細胞受氧自由基損傷的程度，而SOD作為抗氧化酶，其活性高低反映機體抗氧化能力［14］。本研究中發現，Aβ25～35誘導神經元細胞凋亡率增加，細胞存活率明顯下降，細胞內MDA含量上升，SOD活力下降，證實離體環境下Aβ25～35誘導神經元細胞氧化損傷。不同濃度BDNF預處理，細胞存活率上升，凋亡率下降，MDA含量逐漸下降，SOD活性上升，并且呈現劑量依賴性關系。這表明BDNF能夠通過提升神經元細胞抗氧化和清除自由基的能力以減輕Aβ25～35誘導細胞凋亡。

寡聚態的Aβ可在體內和體外誘導大鼠和小鼠的神經元凋亡［15］。同時有研究表明AD動物中Bcl-2蛋白家族的基因表達發生了改變［16］。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的一個關鍵的調節因素［17］，促凋亡蛋白Bax、Bak等蛋白的激活將進一步直接或間接的鈍化抑制凋亡的Bcl-2蛋白［18］。為了探究BNDF抑制神經元細胞凋亡的機制，本研究從轉錄水平和蛋白水平同時檢測了神經元細胞中Bcl-2和Bax基因的表達情況。結果顯示，不同劑量BNDF均能夠顯著升高Bcl-2表達和下調Bax表達來減少細胞凋亡。

SIRT1通過去乙酰化激活很多非組蛋白成分來調節細胞增殖、分化、衰老和凋亡，其中PCG-1α與氧化應激的關系最為密切［19］。本研究提示BNDF能夠激活SIRT1/PGC-1α信號通路拮抗氧化應激導致細胞損傷和凋亡，沉默SIRT1表達則拮抗BDNF對Aβ25～35誘導的神經元細胞凋亡的保護作用。TrkB是BDNF的功能性受體，BDNF和TrkB結合后，受體通過二聚體化及胞內激酶特異性酪氨酸磷酸化而激活，發揮各種生理作用［20］。同樣本研究結果顯示，沉默TrkB表達之后抑制BNDF激活SIRT1/PGC-1α信號通路，降低Bcl-2表達和上調Bax表達。因此，BDNF通過TrkB受體調控SIRT1/PGC-1α信號通路拮抗Aβ25～35誘導的神經元細胞凋亡。

綜上所述，BDNF預處理能夠減輕Aβ25～35誘導的神經元細胞凋亡，這對臨床上采用補充大腦外源性BDNF治療AD患者提供了理論支持。

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BDNF antagonizes Aβ25-35induced neuronal oxidative damage through modulating the SIRT1/PGC-1α pathways

YAO JieZHANG HongmeiYAN LipingJI WentaoMA Qiaoya▲
Ward 1，Cadre Ward，the Second Affiliated Hospital of Xi＇an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi＇an710004，China

Objective To explore the effect and potential mechanism of brain-derived neurotrophic factor（BDNF）pretreatment on neuronal oxidative damage induced by Aβ25-35.Methods The rat cortical neurons obtained from new born SD rats were cultured in vitro for 7 days.After the identification，neurons were randomly divided into control group，Aβ25-35group，1 μg/L BDNF+Aβ25-35group，10 μg/L BDNF+Aβ25-35group，100 μg/L BDNF+Aβ25-35group，BDNF+siRNA-scramble+Aβ25-35group，BDNF+siRNA-TrkB+Aβ25-35group，BDNF+siRNA-SIRT1+Aβ25-35group.Cells was cultured with different concentrations of BDNF for 48 hours，while siRNA-scramble，siRNA-TrkB and siRNA-SIRT1 were transfected into cells with Lipofectamine 2000 and cultured for 24 hours.The cell survival rate and apoptotic rate of different groups were measured by MTT method and flow cytometry，respectively.The malondialdehyde（MDA）content and superoxide dismutase（SOD）activity were detected respectively by the thiobarbituric method and xanthinoxidase method.The expression of TrkB，SIRT1，PGC-1α，Bcl-2 and Bax was detected by quantitative Real-time PCR and Western blot，respectively.Results Compared with the control group，the cell survival rate was decreased，the apoptotic rate was increased，MDA contents were increased and SOD activity was decreased in Aβ25-35group（P＜0.05）.Compared with the Aβ25-35group，the cell survival rates were increased，the apoptotic rates were decreased，MDA contents were decreased and SOD activity was increased after pre-treatment with different concentrations of BDNF.Furthermore，the expression of TrkB，SIRT1，PGC-1α and Bcl-2 protein was also increased，while the expression of Bax protein was decreased in a dose-dependent manner（P＜0.05）.Silencing SIRT1 gene antagonized the protective effect of BDNF on the apoptotic induced by Aβ25-35，silencing TrkB gene antagonized the activation of BDNF on SIRT1/PGC-1α pathways. Conclusion BDNF has a protective effect on neurons against oxidative damage induced by Aβ25-35，and modulates the SIRT1/PGC-1α pathways via TrkB.

Brain-derived neurotrophic factor；Neuronal cell；Oxidative damage；TrkB；SIRT1/PGC-1α

R318

A

1673-7210（2016）07（b）-0016-06

2016-03-12本文編輯：張瑜杰）

▲通訊作者