肝癌組織中VEGF-C、VEGF-D和受體VEGFR-3的表達及其相關性分析

廖文勝 胡虞乾 何陽陽 李西融 唐澄海 杜延召

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院肝膽胰外科，廣西桂林541000

肝癌組織中VEGF-C、VEGF-D和受體VEGFR-3的表達及其相關性分析

廖文勝 胡虞乾 何陽陽 李西融 唐澄海 杜延召

廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院肝膽胰外科，廣西桂林541000

目的探討肝癌組織中血管內皮生長因子-C（VEGF-C）、血管內皮生長因子-D（VEGF-D）和血管內皮生長因子受體-3（VEGFR-3）的表達及其在肝癌進展中的作用。方法收集2012年8月～2014年8月在廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院（以下簡稱“我院”）住院行手術治療的40例肝癌患者的癌組織及其無癌癌旁肝臟組織，同時選擇我院同期收治的10例血管瘤患者的肝臟組織。采用免疫組織化學方法檢測肝臟組織中VEGF-C、VEGF-D和受體VEGFR-3的表達，分析VEGF-C、VEGF-D和受體VEGFR-3表達在肝癌組織中的相關性。結果VEGF-C和VEGF-D主要表達于肝癌細胞漿內，它們在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織及正常肝臟組織（P＜0.05）；VEGFR-3主要表達于肝臟組織基底層部位的癌細胞，VEGFR-3在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織及正常肝臟組織（P＜0.01），并且VEGFR-3的表達與VEGF-C、VEGF-D的表達呈正相關（r=0.546、0.369，均P＜0.01）。結論VEGF-C、VEGF-D和受體VEGFR-3在肝癌組織中表達明顯增高，其可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關，聯(lián)合檢測可作為判斷肝癌發(fā)生和轉移的重要指標。

肝癌；血管內皮生長因子-C；血管內皮生長因子-D，；血管內皮生長因子受傷-3

肝細胞肝癌（hepatocelluarcarcinoma，HCC）作為一種常見的惡性腫瘤，起病隱匿，缺乏早期診斷標準［1］，進展迅速，早期診斷困難，確診時大多數(shù)已達晚期。癥狀以黃疸、腹痛和腹部腫塊為主，治療方法以手術切除為主，預后較差，其病因和發(fā)病機制目前未完全明確。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌的生長代謝、浸潤轉移和復發(fā)與腫瘤淋巴管及血管生成密切相關［2-4］。

血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）通過促淋巴管及血管生長的作用，從而對肝癌的發(fā)生、發(fā)展產生影響。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤的淋巴轉移與血管內皮細胞生長因子C（VEGFC）的表達有相關性，在淋巴管內皮細胞中有血管內皮細胞生長因子受體3（VEGFR-3）高表達［5］，在人體血管內皮細胞生長因子D（VEGF-D）可以視作一個血管生成因子，它可以促進腫瘤血管的形成與生長［6］。目前鮮見有文獻報道VEGFR-3、VEGF-C及VEGFR-D與肝細胞肝癌的研究，本研究通過對肝癌組織及正常肝臟組織的VEGFR-3、VEGF-C及VEGFR-D的表達進行檢測，進一步了解VEGFR-3、VEGF-C及VEGFR-D在肝癌中的病理作用。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2012年8月～2014年8月廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院（以下簡稱“我院”）病理科確診為肝細胞性肝癌的40例患者的癌組織以及其癌旁正常組織，癌旁組織均為肝臟腫瘤旁的組織，均經病理檢測為無癌正常細胞。同時選擇我院同期非肝癌患者的正常肝組織標本10例。肝癌患者平均年齡（52.5±11.5）歲，男30例，女10例，TMN分期：Ⅰ期有14例，Ⅱ期有15例，Ⅲa期11例；非肝癌患者平均年齡（54.0±11.6）歲，男8例，女2例。肝癌患者兩組年齡、性別與非肝癌患者比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 實驗試劑

兔抗人VEGF-C、VEGFR-3多克隆抗體、鼠抗人VEGF-D單克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司；PV-9000二步法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

材料首先經過4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后按照4 μm規(guī)格連續(xù)切片，之后常規(guī)HE染色、免疫組化。SP兔二步法進行免疫組化；VEGF-C抗體進行稀釋，其倍數(shù)是1∶200；VEGF-D抗體進行稀釋，其倍數(shù)是1∶400；VEGFR-3抗體進行稀釋，其倍數(shù)是1∶300；LYVE-1抗體進行稀釋，其倍數(shù)是1∶100。

1.4 結果判讀方法

由我院病理科經驗豐富，且不知道受檢者任何臨床和病理資料的2名專業(yè)醫(yī)師獨立對VEGF-C、VEGFR-D和VEGFR-3的免疫組化切片進行判讀、評估。首先在低倍鏡下（100倍）分別選取瘤周（腫瘤浸潤邊緣區(qū)）和瘤內脈管最豐富的區(qū)域，即“熱點”；然后在高倍顯微鏡下（200倍）隨機計數(shù)5個視野，以其均值作為該病例的LVD計數(shù)。原發(fā)性肝細胞性肝癌組織選擇陽性脈管最豐富區(qū)，在200倍視野下計數(shù)淋巴管數(shù)目，每例計數(shù)5個視野，并求其均值。VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3的判斷：采用染色指數(shù)計數(shù)法，參照1996年全國免疫組織化學技術與診斷標準化專題研討會意見：細胞質或核內見淡黃色細顆粒明顯高于背景色為陽性細胞。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，計量資料數(shù)據用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，等級資料相關分析用Spearman等級相關，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3在不同肝臟組織中的表達

VEGF-C和VEGF-D主要表達于肝癌細胞胞漿內，它們在肝癌組織中的表達明顯高于肝癌癌旁組織及正常肝臟組織（P＜0.05）；VEGFR-3主要表達于肝臟組織基底層部位的癌細胞，VEGFR-3在肝癌組織中的陽性表達率明顯高于肝癌癌旁及正常肝臟組織（P＜0.01）；VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3在肝癌癌旁組織與正常肝臟組織中的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3在不同肝臟組織中的表達［n（%）］

2.2 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達的相關性分析

VEGFR-3的表達與VEGF-C（r=0.546）、VEGFD（r=0.369）的表達呈顯著正相關（P＜0.01），而VEGF-D與VEGF-C無明顯相關性（P＞0.05）。

3 討論

肝癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，其轉移的分子機制還不明確，研究原發(fā)性肝細胞性肝癌的機制和轉移規(guī)律具有重要臨床價值。原發(fā)性肝癌具有易轉移、預后差、易復發(fā)等特點，腫瘤組織所具有侵襲轉移的特點正是肝癌預后差、易復發(fā)的病理學基礎。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞的轉移途徑有4種［7］：第一種為血行轉移，是最常見、最早的轉移途徑，腫瘤可經血行轉移至門靜脈可形成瘤栓，可導致一些并發(fā)癥如多發(fā)性轉移病灶、門靜脈高壓以及頑固性腹水。通過血行癌細胞還可侵襲肝外組織，如肺、腦等。血行轉移是肝細胞肝癌最常見的轉移方式。第二種是癌細胞通過淋巴道系統(tǒng)轉移，最常見轉移至肝門淋巴結，另外鎖骨上淋巴結和主動脈旁淋巴結等處的轉移也比較多見。臨床上膽管細胞型肝癌的淋巴道轉移發(fā)生率僅次于血行轉移。第三種為種植轉移途徑，臨床上不多見。第四種轉移途徑為直接浸潤，臨床上偶見浸潤周邊器官如膈、胃、網膜。血行轉移和淋巴轉移是臨床最常見的轉移方式，特別是通過淋巴轉移的癌細胞更難以清除。目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長、浸潤、轉移和復發(fā)都是依靠腫瘤新生血管和淋巴管的形成［8-10］，如果控制腫瘤的新生血管的出現(xiàn)和淋巴管生成就能夠有效地控制腫瘤的生長及進展。

血管及淋巴管生成的主要調控因子——VEGF家族及其受體（VEGFR），通過與其受體結合發(fā)揮促淋巴管及血管生長的作用，在腫瘤中促進新生毛細血管生成，介導血管內皮細胞生成、增殖和遷移，并且誘導淋巴管生成、增加血管通透性，是腫瘤淋巴管和血管生成的重要因子［11］，與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C屬于血小板源性生長因子，是酪氨酸激酶受體如VEGFR-3和VEGFR-2的配體，對VEGFR-3有較高的親和力［12］。高表達的VEGF-C可以促進皮膚淋巴管的增生［13］，它參與了新生血管的形成以及病理性和生理性淋巴管的形成［14-15］。近年來研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C的表達與多種腫瘤的淋巴轉移有關，并與腫瘤的浸潤深度關系密切［16-17］，下調VEGF-C能減緩腫瘤在體內的生長［18］。VEGFR-3表達主要位于是在淋巴管的內皮細胞［5］，它是淋巴管的內皮細胞的特異性分子標志物［19］。VEGFR-3［20］的一些內皮細胞發(fā)生分化和增生，再向周圍進行伸展，以發(fā)芽的方式成為淋巴管。VEGF-D在人體內可以視作一個血管生成因子，能夠促進腫瘤新生血管的形成與發(fā)展。Nakamura等［21］進行研究表明VEGF-D的能夠與VEGFR-3結合進而促進淋巴管出現(xiàn)、腫瘤經淋巴道的轉移。

通過對肝癌患者及正常人群的肝臟組織中VEGF-C、VEGFR-D、VEGFR-3的表達進行研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中這些因子表達明顯高于正常肝臟組織，它們的高表達有可能促進了新生血管的形成和新生淋巴管的出現(xiàn)，進而加快了腫瘤的生長及轉移，從而影響HCC患者的預后。同時，相關研究也發(fā)現(xiàn)，VEGF-C參與了肝惡性腫瘤轉移及淋巴轉移過程［22］。研究發(fā)現(xiàn)在肝細胞型肝癌可發(fā)現(xiàn)VEGFR-3顯著上調［23］。同時，本研究發(fā)現(xiàn)VEGFR-3在癌旁組織和正常組織中的表達低于癌組織中的表達，表明肝癌的發(fā)生發(fā)展可能與VEGFR-3上調有關，VEGFR-3的上調可能促進淋巴管的形成；因為新生的淋巴管有著不完整的基底膜，有利于癌細胞的遷移，腫瘤細胞從而進入基底膜空隙通過淋巴管發(fā)生轉移［4，24-26］，對肝癌的轉移有促進作用，影響肝癌的預后。

雖然本實驗發(fā)現(xiàn)VEGF-C、VEGF-D和受體VEGFR-3在肝癌組織中表達，但是具體的分子機制仍需進一步研究并證實，同時本研究進一步了解了VEGF與HCC可能存在的關系，為了解肝癌的轉移及治療提供了一個新的方向。

［1］Feitelson MA.Parallel epigenetic and genetic changes in the pathogenesis of hepatitis virus-associated hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Letters，2006，239（1）：10-20.

［2］張鵬.血管內皮生長因子與腫瘤壞死因子在原發(fā)性肝癌表達的意義［J］.中國醫(yī)藥指南，2013（23）：486.

［3］Yamaguchi R，Yano H，Nakashima O，et al.Expression of vascular endothelial growth factor-C in human hepatocellular carcinoma［J］.Journal of Gastroenterology and Hepatology，2006，21（1 Pt 1）：152-160.

［4］Chen J，Torcia S，Xie F，et al.Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes［J］.Nat Cell Biol，2013，15（12）：1415-1423.

［5］Kubo H，F(xiàn)ujiwara T，Jussila L，et al.Involvement of vascular endothelial growth factor receptor-3 in maintenance of integrity of endothelial cell lining during tumor angiogenesis［J］.Blood，2000，96（2）：546-553.

［6］Stacker SA，Caesar C，Baldwin ME，et al.VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics［J］.Nat Med，2001，7（2）：186-191.

［7］Pech M，Mohnike K，Wieners G，et al.Radiotherapy of liver metastases.Comparison of target volumes and dosevolume histograms employing CT-or MRI-based treatment planning［J］.Strahlentherapie und Onkologie：Organder Deutschen Rontgengesellschaft，2008，184（5）：256-261.

［8］徐陽.VEGF-C，VEGF-D和VEGFR-3在結直腸癌組織中的表達及臨床意義［J］.中國老年學雜志，2013（18）：4432-4433.

［9］張偉，任鳳云，金丹，等.血管內皮生長因子-D表達與非小細胞肺癌淋巴管生成和淋巴結轉移的相關性［J］.中國老年學雜志，2014（11）：2917-2920.

［10］曹懷宇，成雪梅，魏磊彬.VEGF-D在結直腸癌中的表達及與微血管密度的關系［J］.河北醫(yī)藥，2015，37（12）：1850-1851.

［11］van Keimpema L，de Koning DB，Strijk SP，et al.Aspiration-sclerotherapy results in effective control of liver volume in patients with liver cysts［J］.Digestive Diseases and Sciences，2008，53（8）：2251-2257.

［12］Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors［J］.Nat Med，2003，9（6）：669-676.

［13］Jeltsch M，Kaipainen A，Joukov V，et al.Hyperplasia of lymphatic vessels in VEGF-C transgenic mice［J］.Science，1997，276（5317）：1423-1425.

［14］Jussila L，Alitalo K.Vascular growth factors and lymphangiogenesis［J］.Physiological Reviews，2002，82（3）：673-700.

［15］Kumar B，Chile SA，Ray KB，et al.VEGF-C differentially regulates VEGF-A expression in ocular and cancer cells；promotesangiogenesisviaRhoAmediatedpathway［J］. Angiogenesis，2011，14（3）：371-380.

［16］Zhao YC，Ni XJ，Li Y，et al.Peritumoral lymphangiogenesis induced by vascular endothelial growth factor C and D promotes lymph node metastasis in breast cancer patients［J］.World Journal of Surgical Oncology，2012，10：165.

［17］Kigure W，F(xiàn)ujii T，Suto h T，et al.The association of VEGF-C expression with tumor lymphatic vessel density and lymph node metastasis in patients with gastric cancer and gastrointestinal stromal tumor［J］.Hepato-gastroenterology，2013，60（122）：277-280.

［18］Khromova N，Kopnin P，Rybko V，et al.Downregulation of VEGF-C expression in lung and colon cancer cells decelerates tumor growth and inhibits metastasis via multiple mechanisms［J］.Oncogene，2012，31（11）：1389-1397.

［19］Jacquemier J，Mathoulin-Portier MP，Valtola R，et al. Prognosis of breast-carcinoma lymphagenesis evaluated by immunohistochemical investigation of vascular-endothelial-growth-factor receptor 3［J］.International Journal of Cancer Journal International Du Cancer，2000，89（1）：69-73.

［20］Lymboussaki A，Achen MG，Stacker SA，et al.Growth factors regulating lymphatic vessels［J］.Current Topics in Microbiology and Immunology，2000，251：75-82.

［21］Nakamura Y，Yasuoka H，Tsujimoto M，et al.Prognostic significance of vascular endothelial growth factor D in breast carcinoma with long-term follow-up［J］.Clin Cancer Res，2003，9（2）：716-721.

［22］Zaiss DM，Yang L，Shah PR，et al.Amphiregulin，a TH2 cytokine enhancing resistance to nematodes［J］.Science（New York，NY），2006，314（5806）：1746.

［23］Zamah AM，Hsieh M，Chen J，et al.Human oocyte maturation is dependent on LH-stimulated accumulation of the epidermal growth factor-like growth factor，amphiregulin［J］.Human reproduction（Oxford，England），2010，25（10）：2569-2578.

［24］Luetteke NC，Qiu TH，F(xiàn)enton SE，et al.Targeted inactivation of the EGF and amphiregulin genes reveals distinct roles for EGF receptor ligands in mouse mammary gland development［J］.Development，1999，126（12）：2739-2750.

［25］劉先進，鄒美銀，章幼奕.血管內皮生長因子對原發(fā)性肝癌的預測分析［J］.抗感染藥學，2014（4）：355-358.

［26］孫超，唐瑞峰，白建國，等.白細胞介素2和6對肝癌細胞表達血管內皮生長因子D的調節(jié)［J］.中國老年學雜志，2015，35（19）：5383-5385.

Analysis of the expression of VEGF-C，VEGF-D and VEGFR-3 in liver cancer tissues and their correlation

LIAO WenshengHU YuqianHE YangyangLI XirongTANG DenghaiDU Yanzhao
Department of Hepatobiliary and Pancreata Surgery，Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin541000，China

Objective To explore the expression of vascular endothelial growth factor C（VEGF-C），vascular endothelial growth factor D（VEGF-D）and vascular endothelial growth factor receptor 3（VEGFR-3）in liver cancer tissue and their role of the progression of liver cancer.Methods Liver tissues of 40 patients with hepatocellular carcinoma treated in Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region（"our hospital"for short）from August 2012 to August 2014 and their para-carcinoma tissues were collected，normal liver tissues of 10 patients with hemangioma in our hospital at the same period were collected.The expression of VEGF-C，VEGF-D and VEGFR-3 of liver tissues were tested by immunohistochemical method，the relationship between VEGF-C，VEGF-D and VEGFR-3 in liver tissues were analyzed.Results VEGF-C and VEGF-D was mainly expressed in the cytoplasm of liver cancer cells，and their expression in liver cancer tissues was significantly higher than para-carcinoma tissues and normal liver tissues（P＜0.05）. VEGFR-3 was mainly expressed in the cancer cells of base parts of the liver tissues and VEGFR-3 positive rate of the liver cancer tissues was obviously higher than those of the normal liver tissues and para-carcinoma tissues（P＜0.01）. The expression of VEGFR-3 was positively correlated with VEGF-C and VEGF-D（r=0.546，0.369；all P＜0.01）. Conclusion VEGF-C，VEGF-D and VEGFR-3 are high expression in liver cancer tissues，and it may be associated with the development of the liver cancer.The joint detection can be used as an important index of judging liver cancer occurrence and metastasis.

Liver cancer；VEGF-C；VEGF-D；VEGFR-3

R735.7

A

1673-7210（2016）07（b）-0088-04

2016-04-03本文編輯：任念）

廣西壯族自治區(qū)科學研究與技術開發(fā)計劃項目（桂科攻1290003-2-3）。